4 1 analise microbiologica

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NÃO PODE FALTAR
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
Cinthia Madeira de Souza
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CONVITE AO ESTUDO
Bem-vindo a esta nova unidade, caro aluno!
Já aprendemos sobre os microrganismos mais prevalentes em alimentos e as
condições ideais para o seu crescimento e multiplicação.
Nesta unidade, desenvolveremos competências para que você seja capaz de
realizar análises microbiológicas, considerando os padrões microbiológicos dos
alimentos.
Primeiramente, aprenderemos alguns conceitos e suas aplicações práticas de
técnicas microbiológicas, como amostragem, preparação de amostras, meio de
cultura e métodos de contagem de microrganismos. Você será capaz de
Fonte: Shutterstock.
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compreender os padrões e critérios microbiológicos estabelecidos pela legislação,
além de contagem especí�ca para alguns tipos de microrganismos. 
Por último, aprofundaremos o estudo dos microrganismos indicadores, que são
extremamente importantes para a análise de alimentos. 
PRATICAR PARA APRENDER
Como já vimos, temos uma in�nidade de microrganismos causadores de doenças
transmitidas por alimentos. 
Nesta seção, trabalharemos com os conceitos iniciais de análise microbiológica.
Não podemos pegar 100% de uma produção industrial para submetê-la a um teste
microbiológico, por isso você aprenderá técnicas de amostragem, como preparar
uma amostra para análise, os diferentes meios de cultura, como prepará-los e
como realizar a contagem dos microrganismos.
Suponha que você atue no departamento de análises microbiológicas de um
laboratório da sua cidade. Você recebeu amostras dos alimentos de um refeitório
hospitalar, já que muitos funcionários, após o jantar, apresentaram enjoo, vômito e
diarreia. O gestor do hospital, muito preocupado com a saúde dos seus
trabalhadores, foi até o seu laboratório para entender como as análises seriam
realizadas. O que você deverá mostrar a ele? 
Bons estudos? 
CONCEITO-CHAVE
Já estudamos a composição química dos alimentos e suas análises físico-químicas.
Além das análises físico-químicas, a análise microbiológica é relevante para o
controle de qualidade microbiológico dos alimentos. Também já estudamos os
conceitos básicos e, agora, vamos aplicá-los para as análises microbiológicas. 
Sabe-se que os microrganismos são seres microscópicos e incolores, que não
podem ser vistos a olho nu. Para isso, faz-se meios de cultura para análise das
colônias, técnicas de coloração para analisar as estruturas microbianas e celulares,
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testes bioquímicos para provas do metabolismo e técnicas moleculares para
con�rmações mais precisas dos patógenos. 
Mas, antes de falarmos sobre as técnicas de análise, temos que compreender que
estamos analisando alimentos e que precisamos de uma amostra que represente
o todo.
AMOSTRAGEM
A amostragem é a etapa fundamental para um resultado coerente da análise
microbiológica, pois sabe-se que os contaminantes de alimentos podem ser
diversos, não só em quantidade, mas em diversidade, exigindo métodos
especí�cos de análise, além de uma distribuição não uniforme. Analisar todo
alimento ou todo o lote de uma indústria é inviável por dois motivos:
1.  A análise é destrutiva, ou seja, não é possível recuperar a amostra.
2.  O custo da análise é elevado.
Assim, realiza-se um processo de amostragem para decidir qual a quantidade de
alimento a ser analisado. 
VOCABULÁRIO
Amostragem: ação, processo ou técnica de escolha de amostra adequada
para análise de um todo.
Amostra: pequena porção de alguma coisa dada para ver, provar ou
analisar, a �m de que a qualidade do todo possa ser avaliada ou julgada.
Os primeiros planos de amostragem datam de 1974, quando a ICMSF (Comissão
Internacional de Especi�cações Microbiológicas para Alimentos) determinou que
cada local produtor de alimentos, em qualquer ponto da cadeia, tivesse um plano
de amostragem para avaliação da qualidade. Desde então, os padrões evoluíram, a
�m de aumentar a segurança alimentar. 
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A amostragem é caracterizada de acordo com a avaliação de risco que o
microrganismo pode causar. De um lote, ou seja, o total de unidades do produto
produzido num determinado tempo e sob as mesmas condições, é retirado um
certo número de unidades amostrais que serão analisadas de forma
independente.
A amostragem pode ser de duas ou três classes:
1.  Duas classes: o produto é classi�cado como aceitável ou inaceitável.
2.  Três classes: o produto é classi�cado como aceitável, inaceitável ou marginal.
Marginais são aqueles acima do limite mínimo aceitável, mas abaixo do limite
máximo tolerado. 
Usualmente, faz-se a amostragem por quarteamento. 
ASSIMILE
Quarteamento: é o processo manual ou mecânico de redução da amostra a
pequenas porções representativas da amostra inicial, sempre dividindo em
múltiplos de 4.
Figura 4.1 | Quarteamento de uma amostra
Fonte: elaborada pela autora.
As principais fontes de erros na amostragem são:
•  Identi�cação inadequada da amostra de alimento.
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•  Natureza da amostra.
•  Transporte e manuseio da amostra.
•  Preparação e armazenamento da amostra.
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE
Para que se tenha uma análise �dedigna, as amostras devem ser coletadas e
preparadas com qualidade, para que os resultados laboratoriais tenham validade. 
O processo de identi�cação é de extrema importância, visto que, nessa etapa,
serão considerados o nome do alimento, seu nome cientí�co, origem (vegetal ou
animal), integridade (inteiro ou parte, sempre especi�cando a parte), estado de
maturação, lote e validade e outros detalhes que julgue importantes. Os detalhes
da coleta também são importantes e devem estar presentes nos rótulos: data e
hora da coleta, pro�ssional que coletou, local de origem, ponto de coleta (durante
o processamento, alimento pronto), método de preparo, peso ou porção, número
de itens e outros detalhes que julgar importantes, a depender do tipo de alimento. 
Os locais de coleta são importantes, para que não haja contaminação da amostra.
Deve-se utilizar sempre recipientes limpos, secos, estéreis, com boca larga e com
tamanho adequado ao volume amostral. Além disso, o manuseio deve ser
realizado de acordo com as boas práticas, para que a contaminação cruzada seja
reduzida, com a utilização de luvas, máscaras e local asséptico.
O primeiro passo para a preparação da amostra é a desintegração do alimento.
Será, então, pesado para que tenha representatividade do todo. Os protocolos de
boas práticas preconizam 25g ou 25mL de amostra. A �gura 4.2 mostra o passo a
passo para o preparo e diluição da amostra. 
Figura 4.2 | Passo a passo para o preparo e diluição da amostra de um alimento
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Fonte: adaptada de Franco e Landgraf (2009).
A contagem de microrganismos pode ser realizada através do método de
plaqueamento, em superfície ou profundidade. Para isso, precisaremos deixar os
nossos meios de cultura preparados.
MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura são essenciais para o crescimento e multiplicação de
microrganismos no ambiente laboratorial.
ASSIMILE
Meio de cultura é de�nido como o conjunto de nutrientes necessários para
multiplicação e manutenção de microrganismos. Cada tipo de
microrganismo possui uma exigência nutricional diferente, por isso temos
diversos tipos de meios de cultura.
Os meios de cultura podem ser:
•  Líquidos: não possuem ágar.
•  Semissólidos: possuem 1% de ágar na sua composição. 
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•  Sólidos: apresentam ágar na concentração de 1,5 a 2,5%.
O ágar é um polissacarídeo, extraído de algas, responsável pela consistência
gelatinosa dos meios de cultura. Antigamente, utilizava-se a gelatina, mas, além de
ser consumida por microrganismos, liquefaz-se nas temperaturas ideais para o
crescimento microbiológico, entre 30 e 35°C. 
Os meios de cultura são classi�cadosde acordo com sua composição e �nalidade:
•  Meios de Cultura Basal: possuem os nutrientes essenciais para o crescimento de
microrganismos em geral.
•  Meios de Cultura de Enriquecimento: são adicionados nutrientes especí�cos para
o microrganismo que se deseja pesquisar. Também pode conter inibidores para
determinados microrganismos. Por ser um meio líquido, não permite o isolamento
dos microrganismos.
•  Meios de Cultura Diferencial: permitem a diferenciação de espécies, através de
suas características como cor, textura, halo de hemólise etc.
•  Meios de Cultura Seletivos: possuem inibidores para determinados
microrganismos. Como é um meio sólido, permite a identi�cação e isolamento,
permitindo visualizar as unidades formadoras de colônia (UFC).
•  Meios de Cultura de Transporte: são meios de cultura temporários, utilizados
para armazenamento e manutenção temporária do material a ser analisado. 
•  Meios de Cultura Complexos: são meios de cultura que não podem ser
quimicamente conhecidos. 
•  Meios de Cultura Sintético: também conhecidos como meios quimicamente
de�nidos, são fabricados em laboratórios, com composição química altamente
conhecida, desde os macros até os micronutrientes. 
REFLITA
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A escolha do tipo de meio de cultura in�uenciará na qualidade da análise
microbiológica. Então, a seleção do meio de cultura, pensando na bactéria
ou no fungo a ser encontrado, deve ser feita com cautela para que o
resultado seja �dedigno.
Para cada tipo de microrganismo, utilizam-se meios especí�cos para seu
crescimento.
Após a preparação dos meios de cultura, faz-se o processo de inoculação em placa,
ou seja, a transferência dos microrganismos do caldo enriquecido, já diluídos, na
placa. A inoculação envolve técnicas de semeadura. A semeadura é uma técnica
asséptica, para que não haja contaminação. 
MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
Para a contagem de microrganismos, pode-se utilizar diferentes meios de
crescimento, sempre esterilizados.
EXEMPLIFICANDO
Diversos meios de cultivo podem ser utilizados, como: ágar-nutriente,
dextrose-triptona ágar, ágar-leite desnatado, ágar-suco de tomate, MRS-
ágar, etc. Já para a contagem de leveduras, os meios mais comumente
utilizados são: extrato de levedura-peptona-dextrose-ágar, extrato de malte
e ágar-batata-dextrose (VIEIRA, 2012).
Os microrganismos possuem tamanho reduzido e são incolores, o que di�culta
muito a sua visualização. Dado esse fato, os microrganismos devem ser corados
previamente, para serem visualizados no microscópio óptico. Antes da coloração, o
microrganismo que cresceu no meio de cultura deve ser �xado à lâmina e secado
ao ar. Logo em seguida, devem ser corados com corantes especí�cos, de caráter
ácido ou básico. A parede bacteriana é corada com corantes básicos.
EXEMPLIFICANDO
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Corantes básicos: safranina, fucsina, azul de metileno e cristal violeta.
Corantes ácidos: fucsina ácida, azul de anilina e laranja G. 
A coloração pode ser simples, apenas para detecção do microrganismo e sua
forma. Mas também pode ser diferencial, permitindo classi�car os microrganismos
em grupos especí�cos, como a coloração de Gram, que classi�ca as bactérias em
gram positivas ou gram negativas. Também é possível a coloração especial de
alguma parte do microrganismo, como esporo, �agelos etc. 
Para o acompanhamento do crescimento de uma população bacteriana, a
contagem pode ser realizada por diferentes métodos:
•  Contagem direta ou microscópica: é realizada por câmaras de contagem ou
contagem eletrônica. É um método rápido, sendo essa sua maior vantagem. Possui
a desvantagem de não considerar microrganismos vivos e mortos. Também só é
possível contabilizar partículas acima de 104/mL. 
•  Contagem de microrganismos viáveis em placas: também conhecida por técnica
de semeadura em superfície. Para a contagem nesse método, utiliza-se a
estimativa, pois cada colônia vista na placa corresponde a uma unidade formadora
de colônia (UFC). A diluição tem o objetivo de seriar a amostra, para que a
colonização esteja entre 30 e 300 UFC, para maior precisão da análise.
REFLITA
Para o crescimento adequado do microrganismo, preconiza-se diluir a
amostra. e então, como devemos realizar a contagem �nal?
Caro aluno, agora que você aprendeu as principais técnicas, que tal coloca-las em
prática?
FAÇA VALER A PENA
Questão 1
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Em uma indústria de alimentos, você foi incumbido de realizar o controle de
qualidade de bombons de morango. Após a trituração da amostra, foi diluída a 10-
3. Foi colocada uma alíquota de 1mL em placa e, após o crescimento, foram
contabilizadas 30 colônias. 
Quantas unidades formadoras de colônia estavam presentes na amostra?
a.  3 x 10 UFC/mL. 3
b.  3 x 10 UFC/mL.4
c.  3 x 10  UFC/mL.-3
d.  6 x 10  UFC/mL.-3
e.  6 x 10  UFC/mL.  3
Questão 2
Os meios de cultura possuem todos os nutrientes necessários para o crescimento
microbiológico, como bactérias e fungos. Podem ser de diversos tipos,
industrializados ou preparados em laboratório, e devem ser preparados em meios
estéreis, para evitar a contaminação cruzada. 
Sobre os meios de cultura, assinale a alternativa correta. 
a.  Diferenciais são utilizados para recuperação de microrganismos estressados e promovem seu
crescimento. 
b.  Meios de transporte permitem a observação de halos de hemólise.
c.  Seletivos favorecem o crescimento de determinados microrganismos e inibem o crescimento de outros. 
d.  O Ágar nutriente é ideal para crescimento de microrganismos fastidiosos.
e.  Enriquecidos com sangue, permitem diferenciar grupos de bactérias com base nas suas características
biológicas.  
Questão 3
Os microrganismos são seres pequenos e transparentes As colorações são
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REFERÊNCIAS
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução da Diretoria Colegiada
RDC-12, 2001. Disponível em: https://bit.ly/3gIoKeJ. Brasil. Acesso em: 4 mar. 2021. 
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução da Diretoria Colegiada
RDC n° 331, de 23 de dezembro de 2019. Disponível em: https://bit.ly/3iYDg3C.
Acesso em: 17 jun. 2021.
Os microrganismos são seres pequenos e transparentes. As colorações são
técnicas importantes que permitem a identi�cação de microrganismos. 
Coluna I
A. coloração simples
B. coloração diferencial
C. coloração especial
Coluna II
1. Flagelos
2. Parede celular
3. Estruturas e formas básicas
Qual alternativa aponta a relação correta entre a coluna I, que contém a técnica,
com a coluna II contendo as estruturas?
a.  A-2; B-3; C-1. 
b.  A-1; B-2; C-3. 
c.  A-2; B-1; C-2.
d.  A-3; B-1; C-2. 
e.  A-1; B-3; C-2.  
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https://bit.ly/3gIoKeJ
https://bit.ly/3iYDg3C
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria no 146, 1996.
Disponível em: https://bit.ly/35I2ZW7. Acesso em: 4 mar. 2021. 
FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo:
Atheneu, 2005, 182 p.
Microorganisms in Foods 2: Sampling for Microbiological Analysis: Principles and
Speci�c Applications. 2nd ed., University of Toronto Press, 1986. Disponível
em: https://bit.ly/3qfDd4W. Acesso em: 24 mar. 21.
International Commission on Microbiological Speci�cations for Foods (ICMSF).
Microorganisms in Foods 7. Microbiological testing in food safety management.
Kluwer Academic/ Plenum Publishers, 2002. 
MONTVILLE, T. J., MATTHEWS, K. R. Food Microbiology. An introduction. 2nd ed.
USA: ASM Press, 2008.
VIEIRA, D. A. de P. Microbiologia. Inhumas: IFG; Santa Maria: Universidade Federal
de Santa Maria, 2012. 90 p. 
ZAPPA, V.; MELVILLE, P. A.; BENITES, N. R. Avaliação através do método de
contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) o crescimento no leite de
colônias de Candida spp e Klebsiella pneumoniae isoladas de tanque de
refrigeração de leite, em culturas puras e associadas. Revista Cientí�ca
Eletrônica de MedicinaVeterinária. Ano VII, N. 13, Julho, 2009. Disponível
em: https://bit.ly/3qh0NhK. Acesso em: 17 jun. 2021. 
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https://bit.ly/3qfDd4W
https://bit.ly/3qh0NhK