Estudos P2 - Enzimologia e Tecnologia das Fermentações

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Enzimologia e Tecnologia das
Fermentações
Giovanna Rêgo
CLassificação dos processos
fermentativos
- Quanto ao produto obtido:
1) Metabólito primário: vem do metabolismo
primário do MO, associado ao seu
crescimento e produzido simultaneamente
à sua proliferação. A formação de
produto é diretamente proporcional à
formação de biomassa.
ex.: aa, nucleotídeos, etanol, enzimas,
ácidos orgânicos
2) Metabólito secundário: a produção só
ocorre pelo metabolismo de situações de
necessidade e não está associado ao
crescimento, ou seja, só é produzido
quando ocorre limitação de nutrientes
após a fase ativa do crescimento.
MO é privado de alimento e entra em
sofrimento, passando a produzir ATB
para que caso chegue um novo MO ele
seja combatido e o pouco alimento que
resta fique para ele → não se reproduz e
produz mais metabólito secundário.
ex.: antibióticos
Curva de crescimento microbiano
A partir da fase estacionária que começa
a produzir ATB.
Metabólito primário é produzido junto ao
crescimento, já o metabólito secundário é
produzido após o crescimento.
Produção de estreptomicina
Quando mais produz ATB é quando o MO
está decaindo!
Giovanna Rêgo
- Quanto a condução do processo
fermentativo
1) Fermentação descontínua: em
batelada/sistema fechado.
Coloca os ingredientes no reator e o
processo ocorre sozinho, retirando o
produto “pronto” podendo acrescentar
aditivos.
Tem começo, meio e fim, lava o reator
e começa o processo novamente,
diminuindo o risco de contaminação.
Instalação de menor custo.
Exemplo: cerveja
Vantagens Desvantagens
< risco de
contaminação
Baixo rendimento
Grande flexibilidade* Tempos mortos
(carga, descarga,
lavagem e
esterilização)
Controle da
estabilidade do MO**
* Fermentador pode ser utilizado para
diferentes tipos de fermentações
** Tem controle por ter começo, meio e
fim. Se for contínua pode acontecer do
MO não estar bem mais.
Tipos de fermentação descontínua:
- Um inóculo por tanque: inicia com
uma cultura nova (pura), menor
risco de contaminação e muito
custo/tempo perdido
- Recirculação de células:
reaproveitam os MO da fermentação
anterior (pula a fase LAG e
economiza tempo), sedimentação ou
centrifugação e faz tratamento com
ácido.
- Por meio de cortes: depois da
primeira fermentação, divide-se o
mosto fermentado em dois
recipientes, completa-se os dois
com o meio e deixa-se fermentar e
um envia-se para a separação do
produto e outro serve para produzir
o inóculo para mais dois (iogurte).
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2) Fermentação descontínua alimentada:
nutrientes são adicionados ao
fermentador durante o processo, então o
volume varia no fermentador.
Os produtos permanecem no
fermentador até o final!
Muito utilizado para metabólitos
secundários (ATBs)
Pode ser com ou sem
reaproveitamento de células.
Vantagens Desvantagens
Controle de oferta de
substratos
Maior risco de
contaminação
Permite a obtenção
de alta [ ] celular
Minimiza a repressão
catabólica*
Maior necessidade de
ter controle do
processo (adição de
nutrientes)Controle melhor da
formação de espuma
*Diminuição da produção de ATB com
adição de glicose.
3) Fermentação contínua: o meio é
adicionado de forma contínua e os
produtos de fermentação também são
continuamente removidos.
Objetivo: manter um nível de
produtividade ótimo.
Resumindo… Sistema aberto, volume
constante e produto produzido
continuamente.
Vantagens Desvantagens
Maior produtividade Mais investimento
inicial
Manutenção das
células no mesmo
estado fisiológico
Pode ocorrer mutação
genética espontânea
(= queda de
produtividade)
Maior uniformidade do
processo
Maior probabilidade de
contaminação
Possibilidade de
associar outras
operações contínuas
na linha de produção
Em processos que
necessitam assepsia
como produção de
enzimas e ATBs, o
processo contínuo
encontra ainda
aplicações restritas
Menor necessidade de
mão de obra
Probióticos
São alimentos funcionais e nutracêuticos
que fornecem nutrição básica e promovem
saúde.
Probiótico ≠ Prebiótico
PRO: administração oral de MOs
PRE: ingestão de substratos
estimulantes
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Microrganismos vivos, administrados em
quantidades adequadas, que conferem
benefícios à saúde do hospedeiro.
- Lactobacillus
- Bifidobacterium
- Saccharomyces
Modulam a microbiota intestinal,
imunoestimulação, prevenção de câncer,
anti-hipertensivo.
Modulação da microbiota intestinal
Por competição:
- Impedem a multiplicação dos MOs
patogênicos
- Inibem a ação patogênica
(modulação de toxinas)
Imunoestimulação
Para pessoas que estão tendo muitas
infecções
- COntrole de citocinas pró e
anti-inflamatórias
- Melhora das respostas de IgA
(anticorpos das secreções)
- Aumento de anticorpos
- Aumento da atividade de
macrófagos (fagocita bactérias)
- Aumento do número de NK (Natural
Killers) promovendo melhor resposta
contra vírus
Prevenção do câncer
Auxilia principalmente em casos de
predisposição, mas não impede que
ocorra o desenvolvimento de células
cancerígenas.
- Estímulo da resposta imune (NK e
TCD8)
- Ligação e degradação de compostos
com potencial carcinogênico (ex.:
câncer de estômago por churrasco
causado por HPAs)
- Produção de compostos
antitumorais
- Alteração das condições
físico-químicas do intestino
Anti-hipertensivo
Dentre os inibidores de ECA estão
peptídeos bioativos.
Obtidos de produtos como queijo, leite
e iogurtes.
Bactérias de queijos e iogurtes
apresentam enzimas com ação proteolítica
levando a degradação parcial da caseína e
podendo gerar peptídeos com ação
hipotensora, como aqueles formados por
valina-prolina-prolina (VPP) e
isoleucina-prolina-prolina (IPP).
Leites fermentados
- Fermentação descontínua (começo,
meio e fim)
- Substrato: lactose
- Produto: ácido lático
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Leite acidófilos
É adicionado açúcar para dar sabor e
conservação.
Iogurte
A adição de leite desnatado em pó serve
para engrossar o iogurte.
Medicamentos Biológicos
Medicamento sintético ≠ biológico
Sintético: produzido quimicamente e
nem sempre conseguimos produzir o que
queremos (ex.: proteínas). Logo tem
limitações, pois certos produtos não tem
como fazer com as moléculas, então é
introduzido o biológico.
Biológico: são produzidos a partir de
seres vivos.
Tem maior complexidade estrutural e são
maiores.
Sua via de administração é apenas
injetável, pois por ser uma molécula muito
complexa ao ser administrada VO ocorre a
digestão e sofre modificações, perdendo
a sua ação.
Exemplos:
- Sintético: AAS → 21 átomos
- Biológico: insulina (Lantus - hormônio
proteico) → 827 átomos
O primeiro medicamento biológico utilizado
foi a insulina → 1921
Ela foi extraída do pâncreas do
cachorro e depois passou a ser
produzida (extraída) a partir de suínos e
somente essa existia até 1982.
Hoje já têm a obtenção biotecnológica,
e também foi o 1º medicamento a ser
obtido por biotecnologia!
Hormônio do Crescimento
Também extraído de animais
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Clonagem e expressão proteica
Pega o gene de produção de insulina uma
célula humana e passa a ser inserido em
outro DNA (bacteriano). Assim, pega-se o
plasmídeo (DNA circular que transmite
características da própria bactéria para
outra) e insere em outro MO
(recombinante) e faz a fermentação para
que se prolifere e produza a insulina.
Sua produção tem um custo maior, pois é
passível de proliferação posterior ao
processo → deve ser muito bem feita,
pois é injetável e se estiver contaminada
será conhecida como antígeno.
Processos:
1) Upstream: construção do vetor,
seleção da cepa e otimização do
meio.
2) Fermentação
3) Downstream: lise celular, purificação
e bioproduto
Por que a insulina foi a 1ª a ser escolhida?
É uma proteína simples com poucos
aa (51) e existia uma corrida para
descobrir o que fazer para utilizar o DNA
humano.
O faturamento dos medicamentos
biológicos é muito alto, por isso possui alto
investimento.
Biossimilares: não intercambiáveis!São similares, mas não pode trocar, pois
são medicamentos muito complexos,
podem haver “segredos” no processo da
indústria diferente de outra.
Ex.: na fermentação ou na purificação
- São feitos por MO e existem
diferença nas estruturas e
características
- Tem moléculas grandes e complexas
sem certeza absoluta da estrutura
- Ocorrem processos diferentes em
cada indústria
- Pode ocorrer risco de reação
alérgica com a troca, precisando
realizar testes de imunogenicidade
quando for produzido
- Necessita testes clínicos, por isso
não são baratos
Purificação de biomoléculas
É o processo realizado após a
fermentação.
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Etapas de purificação:
1) Clarificação:
Serve para separar os MOs do restante,
a parte utilizada depende de o produto
estar dentro do MO ou no sobrenadante.
Pode ocorrer por:
- Filtração
- Centrifugação
A melhor técnica depende do produto
desejado.
A indústria deve escolher a melhor técnica
que tenha menor risco de perda do
produto.
O produto pode estar tanto dentro da
célula (exige mais técnicas para retirar de
dentro do MO) quanto no sobrenadante.
2) Rompimento celular:
A escolha da técnica de rompimento
depende de cada microrganismo, sendo
pelos processos:
- Mecânicos: judia das células,
podendo utilizar homogeneizador de
alta pressão (agitação + pérolas de
vidro para chocarem nas células e
rompe-las) ou ultrassom (depende
do MO).
- Físicos: pode ser por choque
osmótico (muda a [ ] do meio para
entrar água na célula e provocar
lise) ou por congelamento e
descongelamento.
- Químico: pode ser por bases e
ácidos ou pela ação de detergentes
(quebra a bicamada lipídica da
membrana celular provocando lise).
- Enzimático:
Não é necessário continuar o processo de
rompimento depois que as concentrações
ficam estáveis, pois apenas gera gasto de
tempo e energia!
3) Purificação de baixa resolução:
Já foi feita uma purificação, mas com o
rompimento celular ainda tem restos
celulares.
É feita a concentração do volume de
sobrenadante e faz a “limpeza” por:
- Ultrafiltração (aparelho), ou
- Precipitação (substância química
que interage com o produto para
que ele precipite.
4) Purificação de alta resolução:
Pega o sobrenadante concentrado para
fazer a purificação.
É mais cara, pois realmente purifica o
grupo.
Utiliza-se cromatografias (colunas com um
gel que ao adicionar o sobrenadante ele
tem afinidade com o produto), podendo
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utilizar até mais do que uma no processo,
sendo elas:
- Exclusão molecular: também
chamada de “permeação em gel”,
utiliza um gel poroso que faz com
que as moléculas menores
permeiem as bolinhas de gel e
retarda sua chegada ao final da
coluna, separando por peso
molecular.
Como é a bolinha de gel
- Troca iônica: o gel faz a separação
por cargas.
Ex.: um gel que é + retém proteínas
- fazendo com que elas demorem
para passar. Para tirar a ligação
faz um banho com uma substância
que inibe a ligação iônica.
- Interação hidrofóbica: o gel
hidrofóbico retém substâncias
hidrofóbicas e as hidrofílicas saem
mais rápido da coluna. É usado
quando se sabe que tem
substâncias hidrofóbicas e
hidrofílicas.
- Afinidade: é o último a ser utilizado
por ser o mais caro. Utiliza
principalmente para anticorpos.
Baseia-se em características
biológicas específicas para cada
produto, sendo a mais específica.
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Para soltar o substrato se utiliza
um banho de pH diferente para no
fim soltar o substrato.
Exemplos de ligantes para
cromatografia por afinidade:
COMO SABER O MOMENTO DE
PARAR?
Usando eletroforese!
5) Tratamentos finais:
É feita a liofilização ou a cristalização do
produto puro obtido, sendo a diferença:
- Liofilização: tira H2O e fica em pó
- Cristalização: não tira H2O e fica em
pó
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