Aula 4 - HPLC

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CONTROLE DE QUALIDADE DE 
PRODUTOS FARMACÊUTICOS
Profa. Dra. Aline Perissinato
Curso de Farmácia – 7° período
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Definições
• A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a
serem separados são distribuídos entre 2 fases:
- Fixa e de grande área superficial denominada fase estacionária (FE)
- Móvel com um fluído que percola através da fase estacionária denominada
fase móvel (FM)
• É uma técnica cromatográfica que utiliza como FM um líquido e
equipamentos sofisticados para separar os componentes de uma amostra
pela interação comum entre FE e FM.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Definições
• A pressão alta é utilizada para forçar a passagem dos solventes pelas
colunas contendo partículas finas que proporcionam separações muito
eficientes.
• É uma técnica bastante versátil. Esta versatilidade deve-se ao fato do HPLC
ser ao mesmo tempo uma técnica de análise e separação.
• Na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre
devido às diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a FM e a FE.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Mecanismo de separação cromatográfica
• A separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciadas
entre os analitos componentes da mistura, FE e FM.
FM FE
amostra
FASE MÓVEL
FASE
ESTACIONÁRIA
AMOSTRA
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Mecanismo de separação cromatográfica
• A separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciadas
entre os analitos componentes da mistura, FE e FM.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Mecanismo de separação cromatográfica
Adsorção Absorção
(partição)
Líquido/gás sólido Líquido sólido
+
+
+
-
-
Líquido/gás líquido
Líquido/gás gel/sólido
Troca Iônica Permeação
(exclusão)
Bioafinidade
Interações Iônicas
Interações Intermoleculares
Ligação de Hidrogênio
Dipólo/dipólo
Dipólo/dipólo induzido
Dipólo induzido/dipólo induzido
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase estacionária
• Coluna cromatográfica;
• Colunas usuais:
- Comprimento 30 a 300 mm;
- Tamanho de partícula 1,5 a 5 µm.
• Caracterização das partículas:
- Tipo;
- Dimensões (diâmetro);
- Natureza e tamanho dos poros;
- Área superficial.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase estacionária
• Pré-coluna: proteger a coluna contra contaminação química com a mesma
fase da coluna instalada.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase estacionária
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase estacionária
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase estacionária
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase móvel
• Pura, livre de partículas e gases;
• Baixa toxicidade;
• Solubilizar a amostra;
• Não degradar e nem dissolver a FE;
• Baixa viscosidade;
• Compatível com o detector usado.
Exemplos:
- Soluções aquosas de sais;
- Solução tampão;
- Solventes orgânicos: hexano, heptano,
clorofórmio, isopropanol, acetonitrila,
metanol, acetato de etila;
- Mistura de dois ou mais solventes
Para ácidos:
- Ajustar pH entre 2 e 5 com HAc, H3PO4,
tampões fosfato;
Para bases:
- Ajustar pH entre 7 e 8 com NH4POH,
trietilamina, fosfatos alcalinos.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase móvel: modos de eluição
• Eluição isocrática: composição da FM não varia durante a eluição.
• Eluição gradiente: composição da FM varia durante a eluição.
• Quanto mais se varia a FM menos
reprodutível o método de análise.
• Em amostras muito complexa com
tempos de retenção longos deve usar
gradiente.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase móvel: modos de eluição
Condições ISOCRÁTICAS
ótimas para conjuntos de picos
GRADIENTE:
5-90% ACN
14 min
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase normal x Fase reversa
• Fase normal
- FE contém grupos polares ciano, propil ou aminopropil quimicamente
ligados à sílica;
- FM é menos polar (hexano, diclorometano, éter de petróleo).
Fase reversa
- FE contém grupos apolares C-18, C-8, C6;
- FM é mais polar (metanol, acetonitrila, água e tampões).
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase normal x Fase reversa
Coluna Tipo Faixa de trabalho
C 18, RP18, ODS Fase reversa pH 2 a 8 
(ideal entre 4 e 7)
Nitrila, CN Fase normal ou 
reversa 
pH 2 a 8
(ideal entre 4 e 7)
Amino, NH2 Fase normal ou 
reversa 
pH 2 a 8
(ideal entre 4 e 7)
Diol Fase normal pH 2 a 7
Sílica gel Fase normal pH 2 a 7
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase móvel: força de eluição
• Quanto maior a força do eluente,
mais rápido é a eluição do soluto
através da coluna
• Esta força indica a facilidade do
solvente para formar ligação de
hidrogênio com as moléculas a
serem separadas
• Quanto maior a força de eluição,
maior é a interação FM-FE e, menor
é a retenção do analito.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase móvel: força de eluição
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase móvel: força de eluição
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase normal
• Apresenta alguns problemas, como:
- Baixa reprodutibilidade na separação: a coluna pode estar mais ou menos
saturada em água (umidade);
- Encaudamento de picos: menor N, possivelmente devido a maior difusão
na FE;
- Solvent demixing: na mistura de solventes, os mais polares formarem uma
camada sob a sílica, alterando a proporção dos solventes na FM. Demora
em obter equilíbrio.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Fase reversa
• Vantagens:
- FM menos tóxicas e de menor custo: modificador orgânico + água;
- Boa estabilidade;
- Rápido equilíbrio após troca de solventes;
- Compatível com gradiente;
- Análises rápidas.
• Desvantagens:
- Problemas de retenção de compostos básicos;
- Intervalo de pH: 2< pH > 8.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Número de pratos teóricos (N)
- Expressa a eficiência da coluna;
- Relação entre o tempo de permanência
do analito na coluna e alargamento de
bandas;
- N > 2000;
- Quanto maio tr, maior N;
- Quanto menor W, maior N.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Número de pratos teóricos (N)
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Número de pratos teóricos (N)
tR =s
wb >
wb <
N = 16 . tR 
2
wb
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Número de pratos teóricos (N): como aumentar a eficiência?
• Colunas bem empacotadas;
• Colunas com maior comprimento (L);
• Fluxos menores;
• Menor tamanho de partículas da FE;
• Menor viscosidade da FM e menor temperatura;
• Amostra contendo moléculas pequenas.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Resolução (Rs)
- Sempre usar par de picos;
- Indica a qualidade de separação;
- Rs > 1,25 (ou 1,5).
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Fator de retenção (k)
- Relação da distribuição entre a FM e FE
- 0,5 < k < 20
- Maior o k, maior afinidade pela FE
k = tR - tM
tM
> k > tR
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Resolução (Rs) e força de retenção (k): como aumentar?
• Alteração da FM – controlar força de eluição;
• Composição da FE;
• Temperatura.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Resolução (Rs) e força de retenção (k): como aumentar?
ε
k
Rs
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Fator de cauda ou assimetria (T)
- Pico simétrico (T=1);
- 0,5 < T < 2
- Erros de integração
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Conformidade do sistema – System Suitability
Fator de cauda ou assimetria (T)
Ideal BroadFronting Tailing Doublet
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
O
O
(a) e (b) - tempo de análise curto; Rs baixa; FM “forte”; k pequeno
(c) - tempo de análise curto; Rs na linha de base; pico 1 pouco definido: tR1 ≈ t0
(d) e (e) - tempo de análise longo; Rs na linha de base; pico 5 muito largo na base (e)
FM ideal  40-45% metanol (entre c e d)
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Instrumentação
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Instrumentação
• Reservatório de solventes
- Filtração;
- Degaseificação;
- Capacidade: 1-2 L;
- Os reservatórios devem ficar 50 cm acima da bomba;
- Material: vidro (âmbar ou incolor), aço inox ou plástico resistente a solentes
orgânicos (PTFE);
- Captação da FM;
- Tampa.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Instrumentação
• Bombas de alta pressão
- Função: proporcionar fluxo constante e reprodutível;
- Proporcionar vazão livre de pulsações;
- Ter resposta rápida a alterações de fluxo e composição;
- Pressão máxima: 700 atm (10000 psi).
Medidores e controladores de pressão:
- Aumento de pressão: bloqueio da tubulação ou da coluna;
- Baixa pressão: vazamentos.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Instrumentação
• Injetores
- Amostra deve ser aplicada na coluna pressurizada na forma de uma banda
estreita;
- Alça de amostragem ou loop: comprimento e diâmetro interno definem o
volume.
Injetor manual
Load: carregar a amosta no
loop e a FM vai para a coluna
Inject: envia a amostra para a
coluna passando a FM pelo
loop
Injetor automático
Maior comodidade
DPR < 5% Vial
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Instrumentação
• Colunas cromatográficas
• Forno de coluna
- Aumentando a temperatura as substâncias terão mais afinidade pela fase
móvel, mudando o tempo de retenção (diminui). Para controlar a
temperatura se utiliza o forno de coluna.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Instrumentação
• Detector
- Emite um sinal quando o analito sai (elui) da coluna;
- Este sinal é transformado em um pico no cromatograma.
Principais tipos de detectores:
- Índice de refração (IR);
- UV-Vis;
- Arranjo de diodos (DAD);
- Fluorescência;
- Espectrômetro de massa (EM).
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Instrumentação
• Detector
Características desejáveis:
- Alta sensibilidade e baixo limite de detecção;
- Baixo nível de ruído;
- Ampla faixa de linearidade;
- Confiável e reprodutível;
- Insensibilidade à mudanças de FM e T;
- Resposta rápida e linear a alterações de concentrações dos solutos.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Desenvolvendo um método analítico por HPLC
• Escolha do detector: ver estrutura química dos analitos a serem separados,
procurar na literatura;
• Escolha da coluna: se os analitos tiverem diferenças nas partes polares,
usar coluna polar (Si, CN, NH2). Se os analitos tiverem diferenças nas partes
apolares, usar coluna apolar (C18, fenil, RP8) e fase reversa;
• Escolha da FM: deve dissolver a amostra, ser compatível com FE e detector,
ter seletividade;
• Amostra: dissolver em FM e ser capaz de filtrar em pelo menos filtro de
0,45 µm;
• Ajustar parâmetros do sistema.
OBRIGADA!!