Biologia Molecular I - Recombinação homóloga, Recombinação sítio específica e Transposição do DNA

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Rafaela Bilhão 
19/05/2022 
BIOLOGIA MOLECULAR I 
RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA; RECOMBINAÇÃO 
SÍTIO-ESPECÍFICA E TRANSPOSIÇÃO DO DNA 
RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA 
→ as quebras de dupla-fita no DNA são 
relativamente frequentes e não forem corrigidas 
as consequências para a célula serão desastrosas 
→ o principal mecanismo usado para corrigir as 
quebras de dupla-fita na maioria das células é a 
recombinação homóloga. Alguns tipos celulares 
também usam um mecanismo mais simples como 
a junção de extremidades não homólogas (NHEJ) 
→ em células eucariotas, a recombinação 
homóloga é essencial para o reparo de quebras do 
DNA e de forquilhas de replicação em colapso. 
esse papel de reparo cromossômico e reinício da 
replicação é a principal função da recombinação 
homóloga na maioria das células somáticas dos 
organismos complexos 
→ necessário ter cromossomos homólogos 
→ ocorre durante a meiose; pode ocorrer em 
qualquer etapa celular 
→ crossing-over 
→ as etapas fundamentais da recombinação 
homóloga, que aparecem em todos esses 
modelos, incluem: 
1. alinhamento de duas moléculas de DNA 
homólogas. A "homologia" refere-se a 
sequências de DNA idênticas ou 
praticamente idênticas em uma região de 
pelo menos 100 pb. Apesar do alto grau de 
similaridade, as moléculas de DNA podem 
ter pequenas regiões de sequências 
diferentes e podem, por exemplo, carregar 
diferentes variantes de sequências, 
conhecidas como alelos, para o mesmo 
gene 
2. introdução de quebras no DNA. Assim que 
as quebras são formadas, as extremidades 
das quebras são processadas para gerar 
regiões de DNA de fita simples 
3. invasão de fita. Pequenas regiões inicial de 
pareamento de bases são formadas entre 
as duas moléculas de DNA recombinantes. 
Esse pareamento ocorre quando uma 
região de DNA de fita simples, originária de 
uma molécula parental, pareia com a sua 
fita complementar da molécula de DNA de 
dupla-fita homóloga. Esse evento é 
chamado invasão de fita, Como resultado 
do processo de invasão de fita, regiões de 
DNA dúplex novo são geradas; este DNA, 
que frequentemente contém algumas 
bases malparadas, é chamado 
heterodaplex de DNA 
4. formação da junção de Holliday. Uma vez 
que o pareamento tenha ocorrido, as duas 
moléculas de DNA ficam unidas pela 
formação de um cruzamento das fitas de 
DNA, em uma estrutura chamada junção 
de Holliday. Uma junção de Holliday pode 
se mover ao longo do DNA pela repetição 
de quebra e formação de pares de bases. A 
cada vez que a junção se movimenta, pares 
de bases são rompidos nas moléculas de 
DNA parentais, enquanto pares de bases 
idênticos são formados na molécula 
intermediária recombinante. Esse 
processo é chamado migração de 
ramificação 
5. resolução da junção de Holliday. O 
processo para regenerar moléculas de DNA 
e, portanto, finalizar a troca genética é 
chamado resolução. A resolução pode ser 
realizada de duas maneiras, por clivagem 
da junção de Holliday ou (em eucariotos) 
por um processo de "dissolução". No 
primeiro, o corte das fitas de DNA na 
junção de Holliday regenera dois dúplices 
se- parados. Como será visto, a escolha de 
qual dos pares de fitas de DNA na junção 
de Holliday será clivado durante a 
resolução tem grande impacto sobre a 
extensão da permuta de DNA que ocorre 
entre as duas moléculas recombinantes. 
No segundo processo (alternativo), a 
refolução é alcançada pela dissolução, um 
tipo de mecanismo de 
convergência/colapso, que será descrito 
de maneira mais detalhada a seguir 
 
→ não ocorre síntese de DNA 
→ é um mecanismo de reparo 
→ sempre começa com a quebra do DNA 
 
 
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→ as enzimas que catalisam a invasão da fita são 
chamadas de proteínas de permuta de fitas 
 
 
→ a resolução de junções de Holliday é um passo 
essencial para finalizar a troca genética 
 
 
 
→ a finalização da recombinação requer a 
resolução da junção de Holliday, por meio da 
clivagem das fitas de DNA próximas ao sítio de 
cruzament; esta reação separa as duas moléculas 
recombinantes de DNA e, desta forma, finaliza a 
troca genética. A resolução pode ocorrer de duas 
maneiras e gerar duas classes distintas de 
produtos de DNA. os pares alternativos de sítios de 
clivagem DNA ocorrem durante a resolução dessa 
ramificação simples de DNA gerada pela troca 
entre duas moléculas de DNA dúplex semelhantes. 
Para tornar esses sítios de clivagem mais fáceis de 
serem visualizados, a junção de Holliday é 
"girada", originando uma estrutura plana 
quadrangular, sem fitas cruzadas. As duas fitas 
com mesma sequência e polaridade devem ser 
clivadas; as duas escolhas alternativas para os 
sítios de clivagem estão marcadas como sítio 1 e 
sítio 2. os sítios de clivagem marcados com 1 
ocorrem nas duas fitas de DNA compostas 
inteiramente por DNA de uma das duas fitas 
parentais de DNA. Caso essas fitas sejam clivadas 
e, a seguir, covalentemente ligadas (a segunda 
reação, catalisada pela DNA-ligase) as moléculas 
resultantes são referidas como produtos de 
recombinação "entrelaçados", porque os dois 
dúplices originais estão conectados, de maneira 
que regiões das moléculas de DNA parentais estão 
covalentemente unidas por uma região de dúplex 
híbrida. a geração de produtos desse 
entrelaçamento resulta no rearranjo dos genes 
que flanqueiam o sítio de recombinação. Portanto, 
esse tipo de recombinante também é chamado de 
produto de crossing over. Em contrapartida, o par 
alternativo de sítios de clivagem na junção de 
Holliday está nas duas fitas de DNA que contêm 
regiões de sequência de ambas as moléculas 
parentais Após a resolução e a junção covalente 
das fitas nesses sítios, as moléculas de DNA 
resultantes contêm uma região ou "emenda" de 
DNA híbrido. Essas moléculas são, então, 
conhecidas como produtos emendados. Nestes 
produtos, a recombinação não resulta no 
reagrupamento dos genes adjacentes ao sítio de 
clivagem inicial. Essas moléculas são, portanto, 
conhecidas como produtos sem crossing over 
→ via de reparo de quebra de dupla-fita: essa via 
começa com a introdução de uma quebra de 
dupla-fita em uma das moléculas de DNA 
homólogas do dúplex. O outro dúplex permanece 
intacto. Após a introdução da quebra de dupla-fita 
 
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uma enzima cliva o DNA degrada a molécula de 
DNA quebrada, gerando regiões de DNA de fita 
simples. Esse processamento produz extensões de 
fita simples, conhecidas como caudas de DNA de 
fita simples, nas moléculas quebradas de DNA; 
essas caudas de DNA de fita simples terminam em 
extremidades 3’. Em alguns casos ambas as fitas 
em uma quebra de DNA de dupla-fita são 
processadas; em outros casos, apenas a fita que 
termina em 5’ é degradada 
 
 
→ existem outros mecanismos para o reparo de 
quebra de fita dupla: União de extremidades não-
homólogas (NHEJ) – regiões de fita simples são 
removidas por nucleases; lacunas são preenchidas 
pela DNA-polimerase; as duas extremidades são 
unidas 
→ origens de quebra cromossômica: 
• radiação ionizante e outros agentes que 
quebram o DNA 
• forquilha de replicação parada 
→ máquinas proteicas de recombinação 
homóloga: os organismos de todos os tipos 
codificam enzimas que catalisam as etapas 
bioquímicas da recombinação. Em alguns casos, 
membros de famílias de proteínas homólogas 
desempenham a mesma função em todos os 
organismos. Em contrapartida, outras etapas da 
recombinação são catalisadas por classes 
diferentes de proteínas em diferentes organismos, 
mas com o mesmo resultado geral 
→ proteínas que promovem a recombinação na E. 
coli é conhecida como sistema RecBCD 
 
→ etapas do processamento do DNA pela 
RecBCD: a enzima RecBCD processa moléculas de 
DNA quebradas para gerar as regiões de DNA fita 
simples. A RecBCD também auxilia a posicionar a 
proteína de permuta de fitas RecA sobre essas 
extremidades de DNA de fita simples. As múltiplas 
atividades enzimáticas de RecBCD permitem uma 
“chance de escolha” à bactéria – recombinar com 
ou destruir as moléculasde DNA que entram na 
célula. A RecBCD é composta por três subunidades 
(os produtos dos genes recB, recC e recD) e 
apresenta as atividades de DNA-helicase e 
nuclease. Esse complexo liga-se às moléculas de 
DNA no sítio de quebra de dupla-fita e percorre o 
DNA, utilizando a energia da hidrólise de ATP. 
Como resultado de sua ação, o DNA é 
 
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desenrolado, com ou sem o acompanhamento da 
destruição nucleolítica de uma ou de ambas as 
fitas de DNA. As atividades de RecBCD são 
controladas por elementos de sequência de DNA 
específicos conhecidos como sítios Chi (do inglês, 
crossover hot spot instigator). Os sítios Chi foram 
descobertos porque estimulam a frequência de 
recombinação homóloga. As subunidades RecB e 
RecD são DNA-helicases, ou seja, enzimas que 
usam a hidrólise do ATP para desnaturar e 
desenrolar os pares de base do DNA. A subunidade 
RecB contém uma helicase 3'-5' e possui também 
um domínio de nuclease multifuncional que digere 
o DNA à medida que se move. RecD é uma helicase 
5'-3', e RecC atua no reconhecimento de sítios Chi. 
Mas como as várias subunidades dessa máquina 
multifuncional complexa trabalham juntas para se 
mover ao longo do DNA, e o que ocorre de fato 
quando o complexo encontra um sítio Chi? Vários 
estudos, incluindo os baseados em técnicas de 
molécula única, mostraram que os "motores" 
helicases RecB e RecD se movem de maneira 
independente ao longo de fitas opostas do dúplex 
de DNA e com velocidades diferentes. Juntos, eles 
são capazes de "dirigir" o complexo RecBCD ao 
longo do DNA em velocidade superior a 1.000 pb 
por segundo! Sítios Chi no DNA atuam como uma 
"válvula molecular" para regular as atividades das 
helicases e, portanto, a velocidade de 
translocação do DNA 
 
→ função do sítio Chi: proteger o DNA exógeno e 
recombinar 
→ RecA – organiza-se sobre o DNA de fita simples 
e promove a invasão da fita; membro fundador de 
uma família de enzimas denominada proteínas de 
permuta de fitas; o pareamento envolve a 
procurar por combinações de sequências entre 
duas moléculas, bem como a geração de regiões 
de pareamento de bases entre essas moléculas; 
ligaraão cooperativa; pareamento de apenas 15 
bases dispara sinal para a permuta de fitas 
→ RuvAB – reconhece especificamente as junções 
de Holliday e promove a migração de ramificação 
→ RuvA – é uma proteína de ligação ao DNA 
específica para a junção de Holliday, que 
reconhece a estrutura da junção de DNA 
independentemente da sua sequência. A RuvA 
reconhece e liga-se às junções de Holliday e 
recruta a proteína RuvB para o local 
→ RuvB – é uma ATPase hexamérica, semelhante 
às helicases hexaméricas envolvidas na replicação 
do DNA. A ATPase RuvB fornece a energia para 
promover a permute de pares de bases que 
movimenta o ponto de ramificação do DNA 
→ RuvC – cliva fitas de DNA específicas na junção 
de Holliday para finalizar a recombinação. A 
resolução por RuvC ocorre quando esta reconhece 
a junções de Holliday e cliva especificamente as 
duas fitas de DNA homólogas que apresentam a 
mesma polaridade. Essa clivagem resulta em 
extremidades de DNA que terminam com grupo 
5’-fosfato e 3’-OH que podem ser diretamente 
unidos pela DNA-ligase. A clivagem ocorre apenas 
em sítios conformo o consenso 5’-A/T-T-T-G/C 
→ funções da recombinação homóloga: 
• Procariotos: 
- reparo de quebras de fita dupla 
- reiniciar as forquilhas de replicação obstruídas 
- recombinação do DNA da célula com o DNA 
inserido por fago ou conjugação 
• Eucariotos: 
- reparo de quebras de fita dupla 
 
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- reiniciar as forquilhas de replicação obstruídas 
- segregação cromossômica durante a meiose 
- alterar uma sequência de DNA em um local 
específico do cromossomo, sendo utilizado para 
controlar a expressão gênica 
→ a proteína Spo11 – cliva o DNA em vários locais 
cromossômicos, com pouca seletividade de 
sequência, mas em um período bastante 
específico durante a meiose – ocorre exatamente 
quando os cromossomos homólogos replicados 
começam a parear – faz recombinação meiótica 
 
→ a proteína MRX processa as extremidades 
clivadas do DNA, permitindo a adição de proteínas 
de permuta de fitas 
 
→ diversas proteínas atuam em conjunto na 
recombinação meiótica: Rad51 e Dmc1 
→ reparo na quebra da dupla fita de DNA: 
eucarioto: recombinação homóloga – restrito a 
fase S e G2; união de extremidades não-
homólogas – todo o ciclo 
→ alternância do tipo acasalante: Os genes de 
tipos acasalantes codificam reguladores de 
transcrição. Esses reguladores controlam a 
expressão de genes-alvo, cujos produtos definem 
cada tipo celular. Os genes de tipos acasalantes 
expressos em uma determinada célula são 
encontrados no locus de tipo acasalante locus 
MAT, mating-type locus) dessa célula. Assim, em 
células tipo a, o gene a1 está presente no locus 
MAT, enquanto em células do tipo a, os genes a1 
e a2 estão presentes no locus MAT. Nas células 
diplóides, ambos os conjuntos de genes que 
controlam os tipos acasalantes são expressos. Os 
reguladores codificados pelos genes de tipos 
acasalantes, junto com outros encontrados nos 
três tipos celulares, atuam em várias combinações 
para garantir que o padrão correto de genes seja 
expresso em cada tipo celular 
 
 
 
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RECOMBINAÇÃO SÍTIO-ESPECÍFICA 
→ acontece principalmente em procariotos 
→ recombinação sítio-específica ocorre em 
sequências específicas no DNA alvo 
→ variabilidade genética 
→ recombinases: complexo DNA-proteína 
(complexo sináptico) 
→ uma característica fundamental dessas reações 
é que o segmento de DNA que será deslocado 
contém elementos de sequência curtos, chamados 
de sítios de recombinação, onde ocorre a troca de 
DNA 
 
→ a recombinação sítio específica pode gerar três 
tipos diferentes de rearranjos de DNA: (1) inserção 
de um segmento de DNA em um sítio especifico 
(como ocorre durante a integração do DNA do 
bacteriófago x), (2) remoção, ou deleção, de um 
segmento de DNA, ou (3) inversão de um 
segmento de DNA. O resultado da recombinação - 
inserção, remoção ou inversão do DNA - depende 
da organização dos sítios de reconhecimento da 
recombinase na molécula (ou moléculas) de DNA 
que participa(m) do processo. Para entender 
como a organização dos sítios de recombinação 
determina o tipo de rearranjo de DNA, deve-se 
analisar os elementos de sequência dos sítios de 
recombinação de maneira mais detalhada. Cada 
sítio de recombinação está organizado como um 
par de sequências de reconhecimento da 
recombinase, posicionadas de forma simétrica. 
Essas sequências de reconhecimento flanqueiam 
uma pequena sequência assimétrica central, 
conhecida como região de crossing over, onde 
ocorrem a clivagem e a religação do DNA. Como a 
região de crossing over é assimétrica, um 
determinado sítio de recombinação sempre 
apresenta uma polaridade definida. As 
orientações dos dois sítios presentes em uma 
única molécula de DNA serão relacionadas entre si 
como uma repetição invertida ou uma repetição 
direta. A recombinação entre dois sítios invertidos 
inverterá o segmento de DNA entre os dois sítios. 
Em contrapartida, a recombinação pelo mesmo 
mecanismo, porém, entre sítios de repetição 
direta, removerá o segmento 
 
 
→ existem duas famílias de recombinases sítio-
específicas conservativas: as serino-recombinases 
e as tirosino-recombinases. A formação de um 
intermediário proteína-DNA covalente durante a 
clivagem do DNA é fundamental para o 
mecanismo utilizado por ambas as famílias. Nas 
serino-recombinases, a cadeia lateral de um 
resíduo de serina, presente no sítio ativo da 
proteína, ataca uma ligação fosfodiéster específica 
no sítio de recombinação. Essa reação introduz 
uma quebra de fita simples no DNA e, 
simultaneamente, origina uma ligação covalente 
entre o resíduo de serina e um fosfato desse sítio 
de clivagem do DNA. Da mesma maneira, nas 
tirosino-recombinases, é a cadeia lateralde um 
resíduo de tirosina do sítio ativo que ataca e se liga 
ao DNA 
 
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→ as serino-recombinases introduzem quebras de 
dupla-fita no DNA e permutam as fitas para 
realizar a recombinação 
→ tirosino-recombinases quebram e ligam um par 
de fitas DNA por vez 
→ funções biológicas da recombinação sítio-
específica: inversão de um segmento do DNA pode 
possibilitar a expressão de dois genes alternativos; 
auxiliar na manutenção da integridade estrutural 
de moléculas de DNA circulantes durantes os 
ciclos de replicação do DNA; a recombinação 
homólogo e divisão celular 
TRANSPOSIÇÃO DO DNA 
→ a transposição é uma forma particular de 
recombinação que desloca determinados 
elementos genéticos móveis que são chamados 
elementos transposição ou transposons 
→ o deslocamento ocorre pela recombinação 
entre as sequências de DNA posicionadas nas 
extremidades do elemento de transposição e uma 
sequência do DNA da célula hospedeira 
→ o deslocamento pode ocorrer com ou sem 
duplicação do elemento 
→ em alguns casos a reação de recombinação 
envolve um intermediário temporário de RNA 
→ em geral, quando os elementos de transposição 
de deslocam, eles apresentam pouca seletividade 
de sequência na escolha dos sítios de inserção. 
Como resultado, os transposons podem se inserir 
dentro de genes, alterando completamente a 
função destes na maioria das vezes. Eles também 
podem se inserir dentro de sequências gênicas 
reguladoras, onde sua presença pode provocar 
alterações na expressão do gene. Essas perdas de 
função e alterações na expressão gênica levaram à 
descoberta dos elementos de transposição 
 
→ muito frequente em eucariotos 
 
→ pegado de DNA que pode migrar outras partes 
do DNA 
 
→ eventos que sempre levam a mutação 
 
→ Existem três classes principais de elementos de 
transposição: 
• Transposons de DNA 
• Retrotransposons semelhantes à vírus – 
essa inclui os retrovírus. Esses elementos 
móveis também são chamados de 
retrotransposons de repetição terminais 
longa (LTR) 
• Retrotransposons com poli(A) – esses 
elementos também são chamados de 
retrotransposons não virais 
 
→ os transposons de DNA possuem sequências de 
DNA que atuam como sítios de recombinação e 
genes que codificam proteínas que participam na 
recombinação. Os sítios de recombinação estão 
situados nas duas extremidades do elemento de 
transposição e estão organizados como 
sequências repetidas invertidas. As recombinases 
responsáveis pela transposição são normalmente 
chamadas de transposases. Os transposons de 
DNA possuem um gene que codifica a sua própria 
transposase 
 
→ Os transposons de DNA que possuem um par de 
repetições terminais invertidas e o gene da 
transposase têm tudo de que necessitam para 
promover a sua própria transposição. Esses 
elementos são chamados transposons 
autônomos. Entretanto, os genomas também 
apresentam muitos segmentos de DNA móveis, 
ainda mais simples, conhecidos como transposons 
não autônomos. Estes elementos possuem apenas 
as repetições invertidas terminais, ou seja, as 
sequências que atuam em cis, necessárias para a 
transposição. Em uma célula que tenha também 
um transposon autônomo, codificando uma 
 
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transposase que reconhecerá as repetições 
terminais invertidas, o elemento não autônomo 
poderá sofrer transposição. Entretanto, na 
ausência desse transposon "auxiliar" (para 
fornecer a transposase), os elementos não 
autônomos permanecem estáticos, incapazes de 
deslocar-se 
→ transposase se liga ao DNA e um complexo 
DNA-ptn (complexo sináptico ou transposossomo) 
 
 
 
 
 
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