RELATÓRIO ENZIMAS

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CINÉTICA ENZIMÁTICA EM PLACA DE 96 
POÇOS 
 
 
 
 
 
 
Alunos: Ester Ferreira, Melinda Belletti e Reginaldo Sousa 
Disciplina: Bioquímica 
Professoras: Ana Claudia Schiefler e Fernanda Kamp 
Turma: PMQ – 351 
Data de realização da prática: 14/06/2022 
Data de entrega do relatório: 12/07/2022 
Avaliação: 
 
CRITÉRIO: 
NOTA: 
Apresentação 
Introdução 
Objetivos 
Métodos 
Resultados 
Discussão 
Bibliografia 
TOTAL: 
I Introdução: 
Enzimas são proteínas cuja a principal função é acelerar, em sistemas 
biológicos, as reações químicas em condições termodinamicamente desfavoráveis. 
Para uma proteína ser considerada uma enzima, ela precisa possui as seguintes 
características: ter eficiência catalítica, alto grau de especificidade, acelerar as 
reações de 106 a 1012 vezes mais do que as não- catalisadas, não se alterar ou ser 
consumida durante a catalização, não alterar o euilíbrio químico e ter sua atividade 
regulada geneticamente ou por metabolismo. 
 
II Objetivos: 
Gerais: construir uma curva padrão de PNP, fazer uma curva de substrato e 
observar a influência do inibidor. Específicos: a curva padrão foi feita visando a 
analisar se a preparo e o manuseio estava sendo feito corretamente; a curva de 
substrato feita para verificar como a enzima interage com o substrato e em seguida, 
a do inibidor, feito para parar a atividade enzimática e ver como ele influencia na 
ação da enzima. 
 
III Materiais e Métodos: 
 
• Materiais: 
Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5; 
Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5; 
Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 10 mM em tampão água tipo III; 
Solução tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, 8,5, 9,5; 
Solução de Na2HPO4 ___mM em tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5 (sol. Tampão Tris-Pi-HCl); 
Soluções tampão borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5; 
Soluções tampão citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5, e 7,5; 
Solução de NaOH 2 M; 
Solução de enzima: fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1) μg/mL; 
Pipetador automático 20-100μL; 
Pipetador automático 200-1000μL; 
Tubos de ensaio; 
Vortex; 
Placa de 96 poços para leitor de elisa; 
Leitor de elisa; 
Banho de gelo (0°C) 
Banho-maria (25°C) 
Banho-maria (37°C) 
Banho-maria (68°C) 
 
• Métodos: 
 Construção da curva padrão de PNP 
Ao iniciar, direcionou-se até a bancada, onde estavam as soluções de PNP 
(produto), PNPP (substrato), Enzima, Inibidor, tampão de Tris-HCl com pH 9,5 e 
NaOH. E com o auxílio de uma pipeta e um pró-pipete transferiu-se para um tubo 
de ensaio 3 mL de PNP, 15 mL de tampão, 6,0 mL de NaOH, com um tubo de 
ensaio envolto por papel laminado para proteger da luz, transferiu-se 5 mL de 
substrato PNPP, 1 mL de Enzima e 2 mL de inibidor. Com a ajuda de uma 
micropipeta de 200 micro litros transferiu-se 75 ųL de solução padrão para o tubo 
1, para o tubo 2 foi transferido 150 ųL, 225 ųL para o tubo 3, para o tubo 4 
utilizou-se 300 ųL, para o tubo 5 transferiu-se 375 ųL, para o tubo 6 utilizou-se de 
duas vezes da capacidade da micropipeta, totalizando 400 ųL adicionando 50 ųL e 
para o tubo 7 intercambiou 525 ųL. Com o tubo de ensaio denominado branco 
transportou-se com uma micropipeta de capacidade 1000 ųL, 800 ųL da solução de 
Tris-HCl com pH 9,5 em seguida para o tubo 1 transfegou-se 725 ųL, para o tubo 2 
verteu-se 650 ųL, para o tubo 3 diferiu-se 575 ųL, para o tubo 4 deslocou-se 500 
ųL de solução, para o tubo 5 retirou-se 425 ųL, para o tubo 6 deslocou-se 350 ųL e 
para o tubo 7 transladou-se 275 ųL. Após a adição do tampão foi homogenizado 
manualmente cada tubo separadamente. Após a homogeneização foi transferido 
com a ajuda de uma micropipeta de 200 ųL, sua capacidade total para cada tubo, 
incluindo o branco da solução de NaOH e homogeneizado manualmente cada tubo 
separadamente. Aguardou-se o curso temporal de 15 minutos e transferiu-se 200 
ųL para uma placa de 96 poços utilizando 8 poços para leitura posterior em 405 
nm, onde podemos observar o resultado obtido da curva padrão. 
 
 
 
Tubo nº 
Solução Padrão 
de PNP(μL) 
Tampão Tris-HCL 
pH 9,5 (μL) 
Solução de 
NaOH 2M 
(μL) 
B 0 800 200 
1 75 725 200 
2 150 650 200 
3 225 575 200 
4 300 500 200 
5 375 425 200 
6 450 350 200 
7 525 275 200 
 
Curva do Substrato e Inibidor 
Com a ajuda de micropipetas transferiu-se alíquotas das soluções indicadas para 
os tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, as soluções de 
Enzima e NaOH foram adicionadas posteriormente. Utilizando uma micropipeta, 
adicionou-se a solução de enzima aos tubos 1 a 13 em intervalos de 5 segundos, 
determinando o horário exato de início do ensaio e, em seguida homogeneizou-se 
os tubos manualmente. No tubo denominado branco a enzima só foi adicionado 
após a adição da solução de NaOH. Posteriormente incubou-se todos os tubos em 
temperatura ambiente por 15 minutos, após esse intervalo adicionou-se a solução de 
NaOH aos tubos 1 a 13 em intervalos de 5 segundos entre cada tubo, paralisando a 
reação da enzima. Homogeneizou-se os tubos manualmente. Ao final utilizou-se 
uma micropipeta de 200 ųL para transferência de seu volume total a uma placa de 
96 poços para leitura posterior em 405 nm, utilizando o tubo "branco" como 
referência de calibração para o aparelho. 
 
 
 
 
 
 
IV Resultados 
 
G – CONSTRUÇÃO DE UMA CURVA PADRÃO DE PNP: 
Através da leitura realizada no Leitor de Elisa, encontrou-se os valores de 
absorbância, onde foi possível realizar a construção da curva padrão da enzima 
Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) e analisar seu comportamento. 
Foi necessário calcular o número de mols de PNP em cada tubo de ensaio 
para que o gráfico da curva padrão pudesse ser feito. Para realizar esse cálculo foi 
utilizado a fórmula: Ci .Vi = Cf . Vf. 
Solução padrão de PNP = 0,1 mM Volume 
final no tubo de ensaio = 1000 μL 
 
• Tubo 1: 
 Ci .Vi = Cf . Vf 
0,1 x 75 = Cf x 1000 
Cf = 0,075mM ou 7,5 nm/L 
• Tubo 5: 
Ci .Vi = Cf . Vf 
0,1 x 375= Cf x 1000 
 Cf = 0,0375 mM ou 37,5 nm/L 
 
• Tubo 2: 
Ci .Vi = Cf . Vf 
0,1 x 150 = Cf x 1000 
Cf = 0,015 mM ou 15 nm/L 
 
• Tubo 6: 
Ci .Vi = Cf . Vf 
0,1 x 450 = Cf x 1000 
 Cf = 0,045 mM ou 45 nm/L 
 
• Tubo 3: 
Ci .Vi = Cf . Vf 
0,1 x 225 = Cf x 1000 
Cf = 0,0225 mM ou 22,5 nm/L 
 
• Tubo 7: 
Ci .Vi = Cf . Vf 
0,1 x 525 = Cf x 1000 
 Cf = 0,0525 mM ou 52,5 nm/L 
 
• Tubo 4: 
Ci .Vi = Cf . Vf 
0,1 x 300 = Cf x 1000 
Cf = 0,030 mM ou 30 nm/L 
 
 
 
 
0.6 
y = 0,0009x - 0,0045 
R² = 0,9981 
0.5 
0.4 
0.3 
0.2 
0.1 
0 
0 100 200 300 400 500 600 
-0.1 
 
 
Para representar os dados obtidos nos cálculos, montou-se uma tabela. 
 
 
Tubo N° N mols de 
PNP (x) 
ABS 
405nm(Y) 
B 0 0 
1 7,5 0,055 
2 15 0,134 
3 22,5 0,209 
4 30 0,272 
5 37,5 0,356 
6 45 0,404 
7 52,5 0,481 
 
 
Com esses valores também é possível encontrar a equação da reta. 
y = ax + b 
 
 
K – CURVA DE SUBSTRATO: 
Assim como na construção da curva padrão de pnp, também foi realizada a leitura dos 
valores de absorbância, da curva padrão de substrato, no Leitor de Elisa. A partir dos valores 
das absorbâncias e das concentrações, montou-se uma tabela, o que permitiu realizar o cálculo 
de velocidade das reações. 
 
 
 
Tubo 
Tampão 
Tris-HCl 
pH 9,5 
(μL) 
PNPP 1 
mM (μL) 
Enzima 
(μL) 
Solução de 
NaOH 2M 
(μL) 
Abs 
(405nm) 
B 725 25 50 200 0,053 
1 725 25 50 200 0,103 
2 700 50 50 200 0,114 
3 675 75 50 200 0,136 
4 650 100 50 200 0,157 
5 600 150 50 200 0,172 
6 550 200 50 200 0,185 
7 500 250 50 200 0,199 
8 450 300 50 200 0,209 
9 375 375 50 200 0,220 
10 300 450 50 200 0,230 
11 225 525 50 200 0,239 
12 150 600 50 200 0,251 
13 75 675 50 200 0,260 
 
 
Para realizar o cálculo da velocidade, utilizou-se a equação da reta que foi encontrada 
aorealizar a curva padrão de PNP (y = 0,0009x) e calculou-se o valor de x da equação. Ao 
encontrar o valor de x, esse valor foi dividido por 15, pois foi o tempo, em minutos, que ocorreu 
a reação da amostra. Através desse cálculo, encontrou-se o valor da velocidade em μM/min. 
 
0,0053 = 0,0009x 
 
x = 0,0053 / 0,0009 
x = 5,889 μM 
 
 
5,889 / 15 = 0,3926 μM/min. 
I – INFLUÊNCIA DO INIBIDOR: 
Resultado do ensaio da Influência do Inibidor 
 
Tubo 
Tampão 
Tris-HCl 
pH 9,5 
(μL) 
PNPP 1 
mM (μL) 
Inibidor 
(μL) 
Enzima 
(μL) 
Solução 
de 
NaOH 
2M (μL) 
Abs 
(405nm) 
B 650 25 75 50 200 0,052 
1 650 25 75 50 200 0,071 
2 625 50 75 50 200 0,086 
3 600 75 75 50 200 0,096 
4 575 100 75 50 200 0,111 
5 525 150 75 50 200 0,122 
6 475 200 75 50 200 0,137 
7 425 250 75 50 200 0,142 
8 375 300 75 50 200 0,159 
9 300 375 75 50 200 0,164 
10 2255 450 75 50 200 0,179 
11 150 525 75 50 200 0,190 
12 75 600 75 50 200 0,207 
13 0 675 75 50 200 0,224 
 
 
 
 
V Discussão 
Podemos vizualizar o resultado obtido na curva padrão, onde obtivemos um 
R=0,9981 que é considerado um mensurando ótimo, ao fazermos os procedimento 
do substrato e inibidor onde a enzima necessitava de uma temperatura em torno de 
36-37ºC não obtivemos o resultado no gráfico, utilizamos a temperatura ambiente e 
acreditamos que esse tenha sido o erro em um dia álgido. Chegamos a conclussão 
que a enzima utilizada é uma importante catalisadora no sistema imuno o qual 
possui uma temperatura basal em 36,8-37,5ºC. Com isso a coloração da formação 
dos produtos variava em tons de amarelos distintos e labirínticos.