Relatório 2 - Biologia Molecular - Teste de Ames

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Centro de Ciências Biológicas e da Saúde - CCBS
Instituto Biomédico - IB
Departamento de Genética e Biologia Molecular
Biologia Molecular
Teste de Ames
Ana Clara Rodrigues Percegoni e Yve Marques Barcellos Caire
Biomedicina
1º semestre - 2022
Prática 3 27/06/2022
RIO DE JANEIRO 2022
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Introdução
Sabe-se que a mutagenicidade é o potencial que algumas substâncias possuem de
induzir algum tipo de mutação, tendo um potencial gerador de câncer e podendo ser
transmitidas, via hereditariedade, para as gerações futuras. As mutações podem
ocorrer de diferentes maneiras, sendo elas através de grandes deleções ou
rearranjos de DNA; de quebras ou de rearranjos cromossômicos; do ganho ou da
perda de cromossomos inteiros; de mutações gênicas pontuais, referentes a
modificação de apenas uma única base nitrogenada ou a uma ou poucas bases
inseridas ou excluídas do DNA (esses tipos de mutações gênicas pontuais são a
causa de muitas doenças genéticas humanas).
O conhecimento do potencial genotóxico de um composto é uma informação
essencial para as agências regulatórias, a fim de mediarem os riscos deles para com
o homem e com o ambiente. Diferentes testes genotóxicos detectam mutações
gênicas e cromossômicas. Dentre eles, o teste do micronúcleo fornece informações
primárias, em nível cromossômico, sobre os danos no DNA causados por agentes
químicos e físicos. Os micronúcleos são originados a partir de parcelas acêntricas
dos cromossomos (efeito clastogênico) ou de cromossomos inteiros que não
completaram a fase anafásica, referente a migração das cromátides, da divisão
celular (efeito aneugênico).
O teste de Ames é um dos ensaios padrões mais utilizados atualmente, tendo um
importante papel na toxicologia genética como um gerador de dados a respeito da
mutagenicidade e do potencial de induzir mutações genéticas de variadas
substâncias, visando avaliar a segurança delas quando em contato com o ser
humano. Esse teste é exigido pelas principais agências reguladoras do mundo,
como a EMA, a FDA, a ANVISA, entre outras. Dentro dos elementos que podem ser
testados estão, os agrotóxicos, os medicamentos, os cosméticos, os aditivos
alimentares, as amostras ambientais, a triagem de genotoxicidade para novas
moléculas que estão sendo desenvolvidas, etc. Além disso, ele tem sido cada vez
mais utilizado para detectar compostos mutagênicos em amostras ambientais como
a água, o ar, os elementos oriundos por combustão, etc.
Quando um teste tem resultado positivo, significa que o composto é sim mutagênico,
podendo atuar como agente cancerígeno, ou seja, ele serve como uma estimativa
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do potencial carcinogênico. Entretanto, o teste de Ames tem uma eficácia de 90% e
é mais mais conveniente e rápido do que os testes padrões realizados em animais,
como em ratos e camundongos, levando em consideração o valor embolsado para a
realização e o tempo que demora para que os resultados sejam vistos.
A curva de resposta do teste de Ames, utilizando diferentes tipos de concentrações
da substância, é sempre linear, mostrando que não há concentração limite para a
mutagênese. Tendo esse fator benéfico, o próprio Bruce Ames se disse contrário à
extrapolação linear da dose-resposta utilizada nos testes feitos através de sistemas
animais, pois os resultados poderiam marcar falsos positivos causados por doses
artificialmente altas quando comparadas a doses mais baixas utilizadas em produtos
de exposição humana.
Falando um pouco sobre a metodologia criada por Ames e seus colaboradores em
1973, desenvolvida na Universidade de Berkeley - Califórnia, o teste utiliza a
Salmonella typhimurium com mutações pré-existentes no operon dos genes que
produzem a histidina, tornando-a incapaz de crescer e formar colônias por conta
própria, precisando absorver o aminoácido do meio ambiente (no exemplo do teste,
do meio de cultura). A partir do momento em que a bactéria utilizada não consegue
produzir histidina por conta própria, ao sofrer uma mutação que causa a reversão da
função do seu gene produtor, a formação do aminoácido será restaurada e a
Salmonella passará, consequentemente, a crescer no meio de cultura sem a
histidina. Quando observado que a quantidade das colônias crescidas em placas
com a substância teste é superior à quantidade existente nas placas controle (sem a
substância teste), o resultado é considerado positivo para a mutagenicidade.
Para a avaliação do potencial mutagênico das substâncias, o Guia OECD 471 –
Ensaio de Mutação Reversa em Bactéria (OECD, 2020), recomenda o uso de um
conjunto de diferentes linhagens da Salmonella typhimurium. Sendo assim, a TA100
e a TA1535, são usadas para detectar os mutagênicos que induzem as substituições
de pares de bases; a TA1537, a TA97, a TA97a ou a TA98, são usadas para detectar
os mutagênicos que geram o deslocamento de quadros de leitura, inserções e
deleções; a Escherichia coli WP2 uvrA, a E. coli WP2 uvrA (pKM101) ou a S.
typhimurium TA102, são usadas para detectar os mutágenos indutores de danos
oxidativos. Após as substâncias obterem resultados negativos para todas as
linhagens recomendadas pelo guia da OECD, tanto na presença quanto na ausência
de uma fonte externa de histidina, é que são consideradas, verdadeiramente, “Ames
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negativas”. Entretanto, embora a Salmonella typhimurium seja a melhor opção para
a realização atual do teste, ela é um procarioto, portanto não é o modelo perfeito
pois possui características metabólicas e genéticas diferentes da dos seres
humanos. Por isso, para gerar resultados o mais confiáveis possíveis, a fração S9
do fígado de rato é utilizada para simular o metabolismo hepático dos mamíferos,
podendo avaliar o potencial mutagênico dos metabólitos formados.
Vale ressaltar que os mutagênicos identificados no teste de Ames não são
necessariamente cancerígenos, sendo necessário a realização de outros tipos de
testes para detectar qualquer potencial cancerígeno identificado.
Objetivos
Os objetivos deste experimento prático foram a realização do Teste de Ames em um
produto selecionado, e verificar se o mesmo apresentaria potencial mutagênico.
Materiais e Métodos
Reagentes
● Cultura bacteriana de Salmonella enterica sorovar Typhimurium (-HIS) (1-2 x
10^9 cel/mL)
● Tampão fosfato
● Solvente (água da torneira)
● Top ágar
● Creme hidratante facial Lipikar da La Roche Posay (Amostra a ser testada)
Materiais
● Placas de petri
● Pipetas automáticas (1000 ul e 500 ul)
● Bico de bunsen
● Tubos de ensaio (9)
● Estante para tubos de ensaio
● Becker
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Metodologia
Inicialmente, foi realizado um teste de dissolução em água do produto testado
(Creme hidratante Lipikar - La Roche Posay). Adicionou-se uma pequena
quantidade de creme em um Becker, e um pouco de água da torneira, e uma
agitação manual constante foi realizada até que o creme fosse totalmente diluído na
água (que ocorreu de forma bem sucedida).
Em seguida, se iniciaram os preparativos dos controles negativos e dos testes. Os
controles positivos já haviam sido preparados previamente pelo professor.
Foram adicionados 100 µL de solvente em 3 tubos de ensaio, e 100 µL de amostra
em 3 outros tubos.
Foram adicionados 500 µL de tampão fosfato em todos os tubos, e por fim, 2 mL de
top agar com traços de histidina e biotina entre 42 e 45 graus celsius em cada tubo.
A seguir, os tubos foram incubados em agitação manual por 20 minutos. Ao término
deste período, o conteúdo dos tubos foi vertido em placas de petri com ágar mínimo,
as placas foram identificadas como (-) para controle negativo ou ‘’teste’’ para
amostra. As placas foram incubadas em estufa a 37 graus celsius por 72h, e os
resultados foram verificados na semana seguinte ao dia da realização do
experimento.
Resultados e Discussão
Se espera nos resultados de um teste de Ames uma cultura de controle negativo
com pouco crescimento em comparação com o controle positivo, e o teste (caso a
amostra seja mutagênica) devido a ausência de histidina no meiode cultura,
substância essencial para o crescimento da bactéria, que e knockout para o gene
produtor de histidina.
Em nosso teste, houve crescimento considerável da cultura de controle negativo, o
que pode ser explicado pelo solvente utilizado no teste, água da torneira. A água
encanada do Rio de Janeiro distribuída pela CEDAE, por vezes, tem a presença de
contaminantes que podem ser potencialmente mutagênicos. Se tivéssemos utilizado
água destilada estéril no teste, provavelmente não teríamos essa intercorrência.
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Imagens 1-3: Controles negativos (1-3)
(autoral).
Porém, mesmo com este fato, foi possível notar que as placas contendo o teste com
a amostra usada tiveram um crescimento bacteriano ainda maior do que as de
controle negativo contendo apenas o solvente, como mostra a imagem. Confirmando
o resultado de possível mutagenicidade para a amostra selecionada.
Não foi possível realizar contagem de colônias, que se encontravam extremamente
numerosas tanto no controle negativo, quanto no teste.
Conclusão
Foi possível concluir através deste experimento que o teste de Ames tem grande
utilidade para se realizar testes de mutagenicidade sem o uso de modelos animais,
sendo mais fácil, mais barato, e de resultados mais rápidos do que nesses modelos.
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Se tem a desvantagem de não se saber exatamente a dose que causa a
mutagenicidade no caso desse teste, porém, para avaliação de caráter qualitativo, o
mesmo é extremamente efetivo e útil.
Referências
● Liliana Sofia Dias Gonçalves. “Teste de Ames: Contributo para o estudo da genotoxicidade
das águas” Mestrado em Biologia Humana e Ambiente - UNIVERSIDADE DE LISBOA
(2016). Disponível em:
<https://repositorio.ul.pt/bitstream/10451/26282/1/ulfc120761_tm_Liliana_Gon%C3%A7alve
s.pdf>. Acesso em: 17 de julho de 2022.
● ”Freitag Laboratórios implanta o Teste Salmonella/Microssoma AMES detecção de
Genopatoxicidade.“ - Freitag Laboratórios. Disponível em:
<https://freitag.com.br/blog/freitag-laboratorios-implanta-o-teste-salmonella-microssoma-a
mes-deteccao-de-genopatoxicidade/>. Acesso em: 17 de julho de 2022.
● Deise J. Kolling et al. “PADRONIZAÇÃO IN VITRO DA TÉCNICA DO MICRONÚCLEO
EM CÉLULAS VERO PARA DETECÇÃO DE GENOTOXICIDADE”. Laboratório de
Virologia Aplicada da UFSC / LVA. Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis,
SC - Julho/2006. Disponível em:
<http://www.sbpcnet.org.br/livro/58ra/senior/resumos/resumo_1406.html>. Acesso em: 17
de julho de 2022.
● “Teste de Ames”. Stringfixer. Disponível em: <https://stringfixer.com/pt/Ames_test>.
Acesso em: 17 de julho de 2022.
● [5]“Mutagenicidade”. EPSJV - Fiocruz. Disponível em:
<https://www.epsjv.fiocruz.br/mutagenicidade>. Acesso em: 17 de julho de 2022.