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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ – UFPI CENTRO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA– CCN DEPARTAMENTO DE QUÍMICA DISCIPLINA: QUÍMICA ANALITÍCA INSTRUMENTAL CURSO: FARMÁCIA DOCENTE: PROF. DR. HERBERT DE SOUSA BARBOSA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FERRO EM MEDICAMENTO EMPREGANDO ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO MOLECULAR UV/Vis DISCENTES: LIANA SOUSA PERES CARLOS MATEUS DE SOUSA SOARES CINTIA REGIS DA SILVA REIS Teresina/PI, Novembro de 2021 SUMÁRIO RESUMO------------------------------------------------------------------------------------------------------------3 1.INTRODUÇÃO--------------------------------------------------------------------------------------- 4 2.Objetivos------------------------------------------------------------------------------------------------6 2.1.Objetivo Geral --------------------------------------------------------------------------------------6 2.2.Objetivos Específicos-----------------------------------------------------------------------------6 3.PARTE EXPERIMENTAL--------------------------------------------------------------------------7 3.1.Materiais e Reagentes----------------------------------------------------------------------------7 3.2.Procedimento Experimental---------------------------------------------------------------------7 4.RESULTADOS E DISCUSSÃO-------------------------------------------------------------------9 5.CONCLUSÕES--------------------------------------------------------------------------------------16 Referências bibliográficas---------------------------------------------------------------------------17 Anexos----------------------------------------------------------------------------------------------------18 RESUMO O ferro é um mineral indispensável para a saúde e detém uma dupla origem: a endógena e a exógena, adquirida por meio da dieta. Quando em baixas concentrações no organismo, pode ser necessário o uso de medicamentos para suplementar essa carência. Em uma amostra de medicamento, foi realizada a determinação do teor de ferro presente empregando espectrofotometria de Absorção Molecular UV/Vis. Foram obtidos 36,4 mg de ferro na amostra, enquanto que a concentração esperada do medicamento era de 40,07mg. Logo, o medicamento apresenta um teor de ferro de apenas 81,70% em relação ao determinado pelo fabricante. 3 1.INTRODUÇÃO O ferro é um mineral importante para a saúde, aproximadamente 40mg de ferro por dia são necessários para a utilização interna do organismo humano, principalmente para substituição da hemoglobina. Parte desta quantidade é proveniente da reciclagem dos suplementos de ferro existentes no próprio organismo (Carpenter CE & Mahoney A.). No entanto, a deficiência nutricional desse mineral no organismo é bastante comum, na anemia ferropriva, condição na qual o conteúdo de hemoglobina (Hb) no sangue está abaixo dos níveis considerados normais para o sexo, faixa etária, estado fisiológico e altitude, segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS). A anemia é um problema de saúde mundial que atinge tanto os países desenvolvidos quanto os em desenvolvimento, possuindo uma maior prevalência neste último, com grandes resultados para a saúde humana, bem como sociais e econômicas, desenvolvimento (WHO, 2002). Está associada a inúmeras consequências para o indivíduo como palidez, anorexia, apatia, irritabilidade, diminuição da atenção e deficiências psicomotoras (CARVALHO et al, 2006). Essa deficiência pode estar associada a uma má absorção do organismo do ferro que é ingerido no estado ferroso e absorvido pelo organismo no estado férrico, ou, pode estar associada a uma insuficiente ingestão de ferro. Em certos casos é necessária a suplementação com medicamentos à base de ferro em forma de cápsula, comprimido, pó ou gel, sendo o sulfato ferroso ou sulfato ferro II, é o mais estudado. O sulfato ferroso pode ser encontrado comercialmente na forma cristalizada e não cristalizada, apresentando as seguintes fórmulas monohidratadas (FeSO4 .H2O), bi ou dihidratada (FeSO4 .2H2O), heptahidratada (FeSO4 .7H2O) (MENDONÇA, 2006). Esse composto é solúvel em água, apresenta maior biodisponibilidade relativa dado que somente 10-20% do ferro consegue ser absorvido, e é um composto moderadamente instável, podendo reduzir a qualidade do alimento veículo (HUMA et al, 2007). Como forma de analisar a concentração de ferro presente em medicamentos, como o sulfato ferroso em questão, é empregada a espectrofotometria de absorção molecular (UV-VIS), que se baseia na absorção de radiações de determinado comprimento de onda por moléculas e íons (SKOOG et al,2006). A análise de ferro por espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis parte do princípio que o ferro não absorve radiação na região ultravioleta e na região visível e para que fosse possível ser feita essa análise é necessário fazer uma reação química do ferro com agente complexante (fenantrolina) e o complexo formado pela reação tem uma cor vermelho-alaranjado, que absorve na região visível do espectro eletromagnético, e com isso pode analisar o ferro visto que a proporção de Fe para o complexo formado Fe(II)-Fenantrolina é de 1:1. A partir das informações fornecidas no equipamento é possível construir um espectro de absorção, que é um gráfico da absorbância versus o comprimento de onda , e neste é possível identificar o comprimento de onda onde obteve a maior absorbância, desse modo é possível gerar a equação da reta e a partir do teste T, avaliar a exatidão do resultado por meio da determinação se concentração 4 do ferro presente informada pela bula em um determinado medicamento equivale com o valor da concentração na prática. Essas determinações nas formulações farmacêuticas são importantes para garantir que os medicamentos apresentem as concentrações preconizadas para assegurar níveis séricos de ferro adequado ao restabelecimento da concentração normal de hemoglobina. Logo, é bastante relevante a realização de teste de determinação desse teor, já que em medicamentos que estejam fora dos padrões estabelecidos podem ser sugeridos cuidados na escolha da embalagem, locais apropriados, temperatura e umidade adequados, para que não venham a interferir na qualidade do medicamento. 5 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL ● Determinar o teor de ferro total presente em medicamento utilizando a Espectrofotometria de Absorção Molecular UV/Visível. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ● Interpretar o espectro de absorção e a curva de calibração; ● Determinar a concentração de ferro utilizando a Espectrofotometria de Absorção Molecular UV-visível; ● Verificar a lei de Beer e suas inferências a respeito da absorbância; ● Analisar se a concentração final da amostra de ferro por comprimido possui a mesma concentração que apresenta na bula do medicamento, por meio do teste t. 6 3. PARTE EXPERIMENTAL Materiais e Reagentes ● Medicamento a base de ferro FeNH4(SO4)2.H2O ; ● Cubeta de vidro; ● Água Destilada; ● Água Deionizada; ● Papel absorvente macio; ● Almofariz; ● Pistilo; ● Balão volumétrico de 50, 100 e 250 mL; ● Béquer de 100 mL; ● Papel de filtro; ● Pipeta; ● Chapa aquecedora; ● Espectrofotômetro de absorção UV-Vis; ● Fenantrolina(0,25g); ● Ácido Ascórbico(1g); ● Ácido Sulfúrico (H2SO4) concentrado; ● Tampão Acetatode Sódio/Ácido Acético; ● Solução do branco (10 mL de tampão acetato, 2 mL de solução de 1,10 fenantrolina, 4 mL de solução de ácido ascórbico). Procedimento Experimental ● Preparou-se 250 mL de solução padrão de ferro II (50 mg/L) a partir de FeNH4(SO4)2.H2O contendo 3 mL de H2SO4 concentrado; ● Preparou-se 100 mL de solução de 1,10 fenantrolina 0,25% (m:v), dissolvido em H2O a quente; ● Preparou-se 100 mL de solução de ácido ascórbico a 1 % (m:v); d) 100 mL de solução tampão acetato 0,5 mol/L, pH 4,7; ● Calculou-se os volumes de solução padrão de ferro II (50 mg/L), por diluição, necessários para preparar 50 mL de soluções nas concentrações: 1, 2, 3, 4 e 5 mg/L; ● Adicionou-se o volume adequado ao preparo das soluções, em balões volumétricos de 50mL; ● Foi adicionado a cada balão os seguintes reagentes, respectivamente, 10 mL de tampão acetato, 2 mL de solução de 1,10 fenantrolina, 4 mL de solução de ácido ascórbico e foi acertado o menisco com água destilada; ● Preparou-se uma solução do branco contendo todos os reagentes mencionados no procedimento anterior com exceção do analito que é o Fe (II); ● Lavou-se a cubeta de vidro, que é o compartimento que é colocada na amostra, com água deionizada, e posteriormente, lavou-se novamente 3 vezes, com pequenas porções da solução do branco; ● Preencheu-se a cubeta com a solução do branco, fechou-se e foi enxugado com papel absorvente macio; ● Ligou-se o espectrofotômetro para medidas, em 400 nm (comprimento de onda inicial a ser medido), para que fosse obtida a forma de leitura em absorbância; 7 ● Colocou-se a cubeta contendo o branco no espectrofotômetro e ajustou-se o zero de absorbância, pressionando a tecla Cal, para que quando for colocada a solução de ferro considere apenas a absorbância devido a formação do complexo Fe (II)-Fenantrolina; ● Repetiu-se o procedimento anterior substituindo a solução do branco pela solução padrão de ferro (II) a 3 mg/L em outra cubeta e foi anotado o valor da absorbância; ● Mudou-se o comprimento de onda para 405 nm e foi ajustado novamente o zero de absorbância; ● Colocou-se a cubeta com a solução de ferro (II) e foi anotado o valor da absorbância; ● Repetiu-se o procedimento alterando-se os valores de comprimento de onda a intervalos de 5 nm, até chegar a 600 nm; ● Obteve-se as leituras de absorbância dos comprimentos de ondas que vai de 400 nm até 600 nm para o complexo Fe (II)- Fenantrolina; ● Construiu-se um espectro de absorção no Excel, em que comprimento de onda corresponde ao eixo x e absorbância eixo y; ● Obteve-se a curva analítica de calibração; ● Determinou-se o teor de ferro no medicamento, através da amostra de um medicamento à base de (FeNH4(SO4)2H2O), com dose de Fe 40,07 mg/comprimido, segundo o fabricante; ● Pulverizou-se 3 comprimidos do medicamento com auxílio do almofariz e pistilo; ● Utilizou-se um béquer de 100 mL e foi medido a massa de 12 mg de amostra suficiente para preparar 100 mL de uma solução, cuja concentração final de ferro foi de 120 mg/L; ● Dissolveu-se a massa do medicamento no próprio béquer, por intermédio da adição de 10 gotas de H2SO4 concentrado, a fim que a concentração, em 100 mL, fosse 0,1 mol/L; ● Transferiu-se quantitativamente a solução para o balão filtrando-a em papel filtro; ● Retirou-se uma alíquota desta solução da amostra para preparar uma solução de Fe cuja concentração estivesse na região central da faixa de concentração da curva de calibração (2,5 mg/L); ● Adicionou-se a solução do procedimento anterior 10 mL de tampão acetato, 2mL de solução de fenantrolina, 4 mL da solução de ácido ascórbico e acertou- se o menisco com água destilada; ● Preparou-se mais duas soluções a partir dos comprimidos triturados e repetiu- se o procedimento descrito. 8 4.RESULTADOS E DISCUSSÃO Primeiramente foi preparada uma solução padrão de ferro II (50 mg/L), a partir FeNH4(SO4)2 .H2O contendo 3 mL de H2SO4 concentrado. Foi necessário calcular os volumes dessa solução, por diluição, necessários para o preparar padrões de 50 mL de soluções com as concentrações desejadas de 1, 2, 3, 4 e 5 mg/L, que foi 1, 2, 3, 4 e 5 mL, respectivamente. Nesse sentido, foi necessário realizar cuidadosamente a preparação de padrões, pois esses necessitam ser preparados de forma exata e seu estado químico precisa ser idêntico àquele do analito na amostra e também devem ser estáveis com relação à sua concentração, pelo menos durante o processo de calibração. Caso esses padrões não venham a ser feitos certos um erro sistemático pode ocorrer se existir alguma tendência no modelo de calibração (SKOOG et al, 2006). Foi preparado também a solução do branco, solução está contendo todos os reagentes, com exceção do ferro II. Como o equipamento utilizado foi um espectrofotômetro de feixe único, fez-se necessário colocar a solução do branco no espectrofotômetro para que esse possa aplicar radiação na solução e descontar qualquer sinal que seja referente a solução de branco, essa leitura do branco é um procedimento usado para tarar o equipamento. Ademais, foi adicionado a cada balão de 50 mL, o volume adequado ao preparo das soluções, e foi adicionado os seguintes reagentes,respectivamente, 10 mL de tampão acetato; 2 mL de solução de 1,10 fenantrolina; 4 mL de solução de ácido ascórbico em cada uma das 5 soluções padrões.Tendo em vista isso, essas reações precisaram acontecer em meio tamponado, isso porque esse tampão é adequado para formação do complexo Fe(II)-fenantrolina(Figura I), pois se não tivesse tampão a reação aconteceria mas com o passar do tempo poderia ter perda de informação pois dependendo da variação do pH do meio pode desfavorecer a formação do complexo, dessa forma, é melhor tamponar o meio para que possa manter o complexo formado ao longo da análise, pois esse complexo formado pode sofrer perturbações do meio seja de temperatura, pH, dentre outros podendo a vir separar. A fenantrolina é o agente complexante e só consegue formar o complexo com Fe2+, então qualquer quantidade de Fe3+ que possa está presente na amostra foi reduzida pelo ácido ascórbico para Fe2+ e esse sim pode formar o complexo com a fenantrolina. Logo, o ácido ascórbico é utilizado para se comportar como agente redutor para que todo o Fe3+ presente seja reduzido para Fe2+ e assim após a emissão forma complexo com a fenantrolina. É necessário a formação desse complexo pois como a proporcionalmente é de 1:1 consegue-se determinar o teor de ferro a partir da resposta que o instrumento gera pelo complexo Fe2+-Fenantrolina que possui cor vermelho- alaranjado. 9 Figura I. Ilustração da formação do complexo de Fe2+ com a o-fenantrolina. Além disso, quando vai fazer estudo do analito na técnica de espectrofotometria a de absorção molecular UV/Vis é necessário primeiramente construir um gráfico chamado ‘’Espectro de Absorção’’ o qual é obtido pela emissão de luz branca através da amostra, e a absorção se dá justamente devido ao fato das moléculas poderem ser excitáveis, porque apresentam elétrons que podem ser promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de luz. Então, quando um composto é submetido a leitura de absorbâncias ao longo de uma faixa de onda eletromagnética, podemos adquirir informações referentes a capacidade desse composto em absorver luz, onde no gráfico vai ser relacionada o sinal analítico da absorbância representada no eixo Y e o eixo X tem-se a variação comprimento de onda,ou seja, o espectro de absorção faz a leitura de absorbância em vários comprimentos de onda para saber em qual comprimento de onda obtém-se a maior resposta do analito no equipamento.Sendo que no maior comprimento de onda tem-se os menores desvios associados à lei de Beer, e com isso assim aplicar análise quantitativa,ou seja, ´´dizer concentração´´, e para dizer concentração do ferro na amostra faz a calibração do método vai seguir o mesmo princípio do método dos mínimos quadrados. De acordo com a lei de Beer para uma radiação monocromática, a absorbância é diretamente proporcional à concentração da espécie absorvente (SKOOG et al, 2006). Diante do gráfico de espectro de absorção feito no excel para os comprimentos de ondas e a respectiva absorbância analisadas a partir dos valores da tabela 1, o comprimento que teve maior resposta de absorbância foi de 510 nm, pois teve absorbância de 1,113 (Figura II). Tabela 1 - Comprimento de onda X Absorbância para o Complexo Fe (II)- Fenantrolina Comprimento de onda/ nm Absorbância 400 0,330 405 0,395 410 0,420 415 0,505 10 420 0,520 425 0,570 430 0,620 435 0,655 440 0,688 445 0,720 450 0,740 455 0,772 460 0,802 465 0,839 470 0,875 475 0,920 480 0,940 485 0,960 490 0,970 495 0,985 500 1,042 505 1,095 510 1,113 515 1,093 520 1,022 525 0,970 530 0,860 535 0,742 540 0,653 545 0,554 550 0,450 555 0,330 11 560 0,233 565 0,195 570 0,163 575 0,107 580 0,098 585 0,082 590 0,044 595 0,039 600 0,030 Figura II. Espectro de absorção para o complexo Fe (II)-Fenantrolina. Posteriormente, foi feita a curva de calibração no Excel (Figura III) que possibilita determinar a quantidade de ferro na amostra do fármaco e para isso foi obtido os valores da absorbância para cada uma das soluções de Fe (II) no máximo de comprimento de onda encontrado que foi de 510 nm, utilizando como “branco” uma solução contendo todos os reagentes adicionados, menos o Fe (II). Com isso foi tirado a média das absorbâncias 1 e 2 obtidas (tabela 2), em que na concentração de 1 mg/L o valor da absorbância foi de 0,24; na concentração de 2 mg/L o valor da absorbância foi de 0,425; na concentração de 3 mg/L o valor da absorbância foi de 0,64; na concentração de 4 mg/L o valor da absorbância foi de 0,825 e por fim na concentração de 5 mg/L o valor da absorbância foi de 1,045. 12 Tabela 2 - Concentração de Ferro X absorbância Concentração (mg/L) Abs. 1 Abs. 2 Média das abs. 1,0 0,25 0,23 0,240 2,0 0,42 0,43 0,425 3,0 0,65 0,63 0,640 4,0 0,83 0,82 0,825 5,0 1,05 1,04 1,045 A curva de calibração relaciona a concentração do analito no eixo X e no eixo Y o sinal analítico de resposta do equipamento que no caso da prática é a absorbância e é preparada colocando- se os dados em forma de gráfico ou ajustando-os por meio de uma equação matemática adequada que é y=ax + b, como a relação linear utilizada no método dos mínimos quadrado e essa relação matemática é denominada modelo de regressão (SKOOG et al, 2006). A equação da reta obtida no experimento em questão foi y= 0,201x + 0,032(Figura III). Figura III. Curva de Calibração Além disso, foi obtido o coeficiente de correlação (R²) que é uma medida da fração da variação total em y e que pode ser explicada pela relação linear entre x e y, ou seja, é um parâmetro que mostra o quão os pontos observados estão em relação a reta e quanto mais próximo de 1 melhor o modelo linear explica as variações de y (SKOOG et al, 2006). Desse modo, o valor obtido de R² foi de 0,9992, com isso 13 percebemos que com esse valor de R² ele está bem próximo de 1 o modelo linear consegue explicar as variações de y. Posteriormente, foi feita a determinação da quantidade de ferro na amostra do fármaco, por meio da utilização da equação da reta obtida pelo método de calibração e aplicação para cada sinal de absorbância de 0,566; 0,458 e 0,443, obteve-se concentração de 2,66 mg/L; 2,12 mg/L e 2,04 mg/L, respectivamente. Tabela 3 - Concentração de ferro total no medicamento Amostra (mg/L) Absorbância 2,66 0,566 2,12 0,458 2,04 0,443 Em seguida, foi feita a média dessas concentrações que foi de 2,27 mg/L, dessa maneira a concentração de ferro presente na amostra é diferente se comparado com a do fabricante de 2,5 mg/L, que foi obtida por meio da diluição pois como o aparelho não faz a leitura do valor de 120 mg/L teria que fazer essa diluição e para isso foi utilizado 4,8 L até obter a concentração final de 2,5 mg/L. Tendo em vista o fator de diluição de 48(120/2,5), os valores da concentração anteriores seriam de 127,68 mg/L (2,66 x 48), de 101,76 mg/L (2,12 x 48) e de 97,92 mg/L (2,04 x 48), e diante dessas concentrações foi realizado o desvio padrão que foi de 16,19; para posterior aplicação na fórmula do teste t. Foi feito também o desvio padrão da amostra que foi de 0,3373, para que assim fosse calculado o desvio padrão relativo, que é uma medida estatística que vai descrever a distribuição dos dados no que diz respeito à média e o resultado foi de 0,1486. Bem como também foi calculado o erro relativo que é uma grandeza que relaciona o erro absoluto e o valor aproximado conforme os resultados apresentados na tabela 4. Adiante, realizou-se o teste t que é uma ferramenta estatística utilizada constantemente para expressar intervalos de confiança e para a comparação de médias para decidir se existe uma diferença com significado estatístico entre elas, dessa maneira, o teste t é utilizado para avaliar a exatidão do resultado. O t calculado foi de - 1,18 e o t tabelado - 4,30, com isso o valor do t calculado é maior que o t tabelado, logo, existe diferença significativa entre o valor médio (109 mg/L) obtido pela multiplicação da média obtida anteriormente de 2,27 mg/L x 48 (fator de diluição) e o valor de referência utilizado na comparação (120 mg/L), a um nível de confiança de 95%. Dessa maneira, foi possível ser feita a determinação do teor de ferro no medicamento, tendo em vista a dose de Fe2+ por comprimido de 40,07 mg e concentração da solução de 120 mg/L foi realizado uma relação com a média obtida da amostra que foi de 109 mg/L, com isso a massa de ferro encontrada foi de 36,4 14 mg, salientando assim diferença se comparada com a do fabricante. De modo que, o teor de ferro encontrado é de 81,70%. Tabela 4 - Erro relativo de cada amostra Amostra (mg/L) Erro relativo 2,66 6,4% 2,12 -15,2% 2,04 -18,4% 15 5.CONCLUSÕES Conclui-se que a concentração final da amostra de ferro por comprimido, tendo em vista a concentração de ferro teórico que foi determinada mediante informações da massa do comprimido e do teor de ferro contido na bula possui diferente concentração se comparada a que apresenta na bula do medicamento. Isso porque por intermédio do teste T obtido que o t calculado é maior que o t tabelado, com isso há diferenças significativas das médias analisadas. A massa de ferro encontrada na amostra foi de 36,4 mg enquanto a determinada pelo fabricante era de 40,07mg. Logo, o medicamento apresenta apenas 81,70% do teor de ferro esperado. 16 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS SKOOG,A. et al. Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8º edição norte- americana. São Paulo: Editora Thomson,2006. BREITKREITZ, M. C.; SOUZA, A. M. DE; POPPI, R. J. A didactic chemometrics experiment for design of experiments (DOE): evaluation of experimental conditions in the spectrophotometric determination of Iron II witho-phenanthroline. A tutorial, part III. Química Nova, v. 37, n. 3, 2014. CARVALHO, M.C; BARACAT, E.C.E; SGARBIERI, V.C. Anemia Ferropriva e Anemia de Doença Crônica: distúrbios do metabolismo de ferro. Revista de Segurança Alimentar e Nutricional, Campinas. Vol. 13 n. 2: 54-63, 2006. Carpenter CE & Mahoney A. Contributions ofheme andnonheme iron to human nutrition. CritRev Food Sc Nutr 1992; 31: 333-367. MENDONÇA, J.E. Estudo da viabilidade sensorial do enriquecimento com ferro, de vários produtos derivados de soja e a quantificação de seus teores em isoflavonas. 84 f. Dissertação (Mestrado em Alimentos e Nutrição) - Programa de Pós-graduação em Ciências dos Alimentos, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2006 HUMA, N.;SALIM-UR-REHMAN; ANJUM,F.M.; MURTAZA, M.A.; SHEIKH,M.A. Food fortification strategy - preventing iron deficiency anemia: a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v.47, p. 259-265,2007. World Health Organization. The World Health Report 2002: Reducing risks, promoting healthy life. Geneva, World Health Organization, 2002. Disponível em: <https://apps.who.int/iris/handle/10665/67454>. Acesso em: 26 out.2021. 17 ANEXOS 18 19 20 21
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