ELISA-prática

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Fisiologia Animal / Geral 
Teste	
  	
  imunoenzimá-co	
  
Imunoensaio	
  que	
  usa	
  an-corpos	
  específicos	
  para	
  detectar	
  an-génios	
  e	
  an-corpos	
  
Alois	
  Alzheimer,	
  1906	
  
•  Forma	
  mais	
  frequente	
  de	
  demência	
  nos	
  países	
  industrializados;	
  
•  Morte	
  e	
  atrofia	
  neuronal;	
  
•  Caracterizada	
  por	
  perturbações	
  de	
  memória	
  e	
  
	
  e	
  de	
  linguagem.	
  
August	
  Deter	
  (55	
  anos)	
  
Doença	
  de	
  Alzheimer	
  (DA)	
  
1864-­‐1915	
  
Normal AD 
Factor	
  de	
  risco	
  para	
  a	
  DA	
  de	
  início	
  tardio;	
  este	
  
alelo	
   apenas	
   aumenta	
   o	
   risco	
   de	
   o	
   indivíduo	
  
vir	
   a	
   desenvolver	
   a	
   doença,	
   indicando	
  
exisPrem	
   outros	
   factores	
   ambientais	
   e	
  
genéPcos	
  no	
  desenvolvimento	
  da	
  DA.	
  
 DA	
  com	
  início	
  precoce	
  está	
  associada	
  a	
  mutações	
  nos	
  genes	
  que	
  codificam	
  para	
  APP	
  
(proteína	
  precursora	
  da	
  B-­‐amilóide),	
  presenilina	
  1	
  e	
  presenilina	
  2;	
  
 DA	
  com	
  início	
  tardio	
  está	
  associada	
  a	
  mutações	
  do	
  gene	
  ApoE.	
  
 AD Statistics…. 
•  AD	
  is	
  the	
  most	
  common	
  cause	
  of	
  demenPa	
  among	
  people	
  age	
  65	
  and	
  older.	
  
•  ScienPsts	
  esPmate	
  that	
  around	
  4.5	
  million	
  people	
  now	
  have	
  AD.	
  
•  For	
  every	
  5-­‐year	
  age	
  group	
  beyond	
  65,	
  the	
  percentage	
  of	
  people	
  with	
  AD	
  doubles.	
  
What	
  is	
  AD?	
  
•  By	
  2050,	
  13.2	
  million	
  older	
  Americans	
  are	
  expected	
  to	
  have	
  AD	
  if	
  the	
  current	
  
numbers	
  hold	
  and	
  no	
  prevenPve	
  treatments	
  become	
  available.	
  
Forecast	
  of	
  Alzheimer’s	
  Disease	
  Prevalence	
  in	
  the	
  U.S.	
  
2030 2050 2000 
Inside the Human Brain 
The	
  Hallmark	
  of	
  Alzheimer’s	
  Pathology:	
  
Amyloid	
  Plaques	
  and	
  Neurofibrillary	
  Tangles	
  in	
  Brain	
  
Amyloid	
  Plaques	
  contain	
  large	
  
amounts	
  of	
  a	
  42	
  amino	
  acid	
  
pepPde	
  termed	
  “β-­‐amyloid”,	
  or	
  
Aβ42	
  	
  	
  
The	
  best	
  present	
  hypothesis:	
  
β-­‐amyloid	
  itself	
  is	
  the	
  iniPal	
  cause	
  
of	
  the	
  pathophysiology	
  that	
  leads	
  
to	
  demenPa.	
  Amyloid	
  plaques	
  
probably	
  contribute	
  to	
  the	
  later	
  
stages	
  of	
  pathology	
  
Neurofibrillary	
  tangles:	
  rich	
  in	
  cytoskeletal	
  proteins,	
  
especially	
  the	
  microtubule-­‐associated	
  protein	
  named	
  “tau”.	
  	
  	
  
In	
  the	
  tangles:	
  heavily	
  phosphorylated	
  proteins,	
  	
  
which	
  may	
  cause	
  aggregaPon	
  and	
  precipitaPon	
  of	
  the	
  
cytoskeleton,	
  
Plaques and Tangles: The Hallmarks of AD 
AD and the Brain 
Plaques –"are dense, insoluble deposits of protein and cellular material "
"outside and around the neurons. �
Tangles – "are insoluble twisted fibers that build up inside the nerve cell. �
Amyloid-­‐β	
  Deposi6on	
  
[Senile	
  Plaque]	
  
Tau	
  Phosphoryla6on	
  
[Neurofibrillary	
  Tangles]	
  
Normal 
AP = amyloid plaques. 
NFT = neurofibrillary tangles 
AD 
AP 
NFT 
6 
Neurons have an internal support structure partly made up of microtubules. A 
protein called tau helps stabilize microtubules. In AD, tau changes, causing 
microtubules to collapse, and tau proteins clump together to form 
neurofibrillary tangles. �
Neurónio	
  normal	
  
Neurónio	
  	
  em	
  	
  Alzheimer	
  
O	
  Alzheimer	
  no	
  Cerébro	
  
Neurofibrillary	
  tangles	
  
Amyloid	
  plaque	
  
Amyloid plaques and neurofibrillary tangles: 
hallmarks in Alzheimer’s disease 
Legenda: Azul – Regiões com excesso de Tau-Fosforizada. 
 Pontos Vermelhos – Placas Amilóides. 
•  Avaliação	
   neurofisiológica	
   efectuada	
   com	
  
auxílio	
  de	
  baterias	
  de	
  testes	
  padronizados;	
  
•  TAC;	
  ressonância	
  magnéPca	
  (RM);	
  PET	
  
•  	
  Exame	
  clínico	
  cuidadoso	
  
•  ELISA	
  (Enzyme-­‐linked	
  immunosorbent	
  assay)	
  
Diagnós6co	
  da	
  Doença	
  de	
  Alzheimer	
  
PET	
  (positron	
  emission	
  tomography)	
  
PET (positron emission tomography) scans show differences in brain 
activity between a normal brain and a brain affected by Alzheimer’s 
disease. Blue and black in the images above denote inactive areas. 
Normal	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Alzheimer	
  
Metabolism	
  is	
  the	
  primary	
  source	
  of	
  oxidants	
  
DiagnósPco	
  
•  Avaliação	
   neurofisiológica	
   efectuada	
   com	
   auxílio	
   de	
   baterias	
   de	
   testes	
  
padronizados;	
  
•  TAC	
  ou	
  ressonância	
  magnéPca	
  (RM);	
  
•  	
  Exame	
  clínico	
  cuidadoso.	
  
•  ELISA	
  (Enzyme-­‐linked	
  immunosorbent	
  assay)	
  
Teste	
  	
  ELISA	
  
	
  Enzyme-­‐linked	
  	
  Immunosorbent	
  	
  Assay	
  
•  Teste	
   imunoenzimáPco	
   que	
   detecta	
   a	
   presença	
   de	
   um	
   anPcorpo	
   ou	
   de	
   um	
  
anPgénio	
  em	
  uma	
  amostra	
  (ex:	
  detecção	
  e	
  quanPficação	
  da	
  proteína	
  Tau	
  no	
  
líquido	
  cefalorraquidiano);	
  
•  Presença	
  de	
  níveis	
  elevados	
  da	
  proteína	
  Tau	
  no	
  líquido	
  cefalorraquidiano	
  em	
  
doentes	
  de	
  Alzheimer;	
  
•  Teste	
  directo	
  e	
  indirecto.	
  
ELISA	
  	
  —	
  Teste	
  directo	
  para	
  detectar	
  anPgénios	
  
Parte	
  Experimental	
  
•  Etapas	
  
1ª	
  -­‐	
  Adição	
  de	
  amostras	
  
-­‐  	
  	
  	
  Ligação	
  dos	
  anPgénios	
  aos	
  poços;	
  	
  
2ª	
  -­‐	
  Adição	
  de	
  anPcorpo	
  primário	
  
-­‐  	
  	
  Ligação	
  do	
  anPcorpo	
  primário	
  ao	
  anPgénio;	
  
3ª	
  -­‐	
  Adição	
  do	
  anPcorpo	
  secundário	
  
-­‐  	
  	
  	
  Ligação	
  dos	
  anPcorpos	
  secundários	
  aos	
  anPcorpos	
  primários;	
  
4ª	
  -­‐	
  Adição	
  do	
  substrato	
  para	
  a	
  enzima	
  
-­‐  	
  	
  	
  Desenvolvimento	
  de	
  cor;	
  
Parte	
  	
  Experimental	
  
•  Poços	
  incolores	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Resultado	
  negaPvo	
  	
  
•  Poços	
  azuis	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Resultado	
  posiPvo	
  
Controlo	
  posiPvo	
   Controlo	
  
negaPvo	
  
LCR	
  
ObjecPvos	
  
•  Consolidar	
   conhecimentos	
   relaPvo	
   à	
   doença	
   de	
  
Alzheimer;	
  
•  Aplicar	
  a	
  técnica	
  de	
  ELISA;	
  
•  Conhecer	
   as	
   potencialidades	
   e	
   debilidades	
   dos	
  
testes	
  de	
  diagnósPco	
  para	
  a	
  doença	
  de	
  Alzheimer.	
  
Beta-amyloid Plaques 
Amyloid precursor protein (APP) is the 
precursor to amyloid plaque. 
1.	
   	
  APP sticks through the neuron 
 membrane. 
2.	
   	
  Enzymes cut the APP into fragments 
 of protein, including beta-amyloid. 
3.	
   	
  Beta-amyloid fragments come together 
 in clumps to form plaques. 
AD and the Brain 
In AD, many of these clumpsform, 
disrupting the work of neurons. This 
affects the hippocampus and other areas 
of the cerebral cortex. 
Imaging	
  Brain	
  Amyloid	
  in	
  Alzheimer’s	
  Disease	
  	
  
tracers:	
  	
  
PIB	
  —	
  to	
  detect	
  amyloid	
  plaques	
  
and	
  
FDG	
  —	
  to	
  determine	
  regional	
  cerebral	
  glucose	
  rate	
  
Healthy	
  
volunteer	
  
FDG-­‐PIB:	
  healthy	
  volunteer	
  and	
  AD	
  pa6ent	
  
AD	
  
paPent	
  
FDG	
   PIB	
  
Brain	
  Disorders	
  (Alzheimer’s)	
  
  PET	
  scans	
  show	
  a	
  very	
  
consistent	
  diagnosPc	
  parern	
  
for	
  Alzheimer’s	
  disease,	
  where	
  
certain	
  regions	
  of	
  the	
  brain	
  
have	
  decreased	
  metabolism	
  
early	
  in	
  the	
  disease.	
  In	
  fact,	
  
this	
  parern	
  osen	
  can	
  be	
  
recognized	
  several	
  years	
  
before	
  a	
  physician	
  is	
  able	
  to	
  
confirm	
  the	
  diagnosis	
  and	
  is	
  
also	
  used	
  to	
  differenPate	
  
Alzheimer’s	
  from	
  other	
  
confounding	
  types	
  of	
  
demenPa	
  or	
  depression.	
  
Age	
  
21	
  
67	
  
59	
  
21	
  	
   67	
  
PIB	
  uptake	
  in	
  healthy	
  volunteers	
  
Age	
  
67	
  
59	
  
68	
  
79	
  
67	
   68	
  
PIB:	
  Healthy	
  volunteers	
  and	
  Alzheimer	
  pa6ents	
  
Amyloid-­‐β	
  Deposi6on	
  
[Senile	
  Plaque]	
  
Tau	
  Phosphoryla6on	
  
[Neurofibrillary	
  Tangles]	
   Neuronal	
  death/D
ysfunc6
on:	
  
D
em
en6
a	
  
Tau	
  Phosphoryla6on	
  
[Neurofibrillary	
  Tangles]	
  
Amyloid-­‐β	
  Deposi6on	
  
[Senile	
  Plaque]