Aula 2 - Principios das Tecnicas Analiticas - Fotometria, Espectrometria, Eletroforese e Turbidimetria. - Profa. Thiara Manuele

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Aula 2: Princípios das Técnicas Analíticas: Fotometria, 
Espectrometria, Eletroforese e Turbidimetria.
Profa. Thiara Manuele
ESPECTROFOTOMETRIA 
NAS ANÁLISES 
BIOQUÍMICAS
• Ao longo da história da humanidade várias áreas do conhecimento
foram sendo aperfeiçoadas, os conhecimentos de física e química
permitiram o desenvolvimento de inúmeras técnicas e metodologias
analíticas que se difundem hoje a todos os laboratórios do campo de
análises clínicas.
• O emprego de técnicas físico-químicas serve tanto à química quanto
à biologia e tem permitido reduzir a maioria dos fenômenos celulares
a termos moleculares.
• Por meio do uso da espectrofotometria as análises clínicas foram
beneficiadas enormemente com os métodos quantitativos.
Fonte: Alencar, 2016.
Cor e Luz
• Num conceito simples, cores são
dependentes diretas da luz. Não vemos
as cores de fato, vemos a cor como efeito
da luz brilhando sob um objeto.
• Quando uma luz branca brilha em um
objeto, este pode ser refletido,
absorvido ou transmitido.
Cor e LuzCor e Luz
Cor e LuzCor e Luz
• A cor de um objeto depende da luz que é refletida por ele.
• Quando iluminado por luz branca, o objeto absorve todas as cores com exceção da luz que
é refletida.
Cor e Luz
• O vidro transmite a maior parte da luz que
entra em contato com ele, portanto, este
parece incolor.
• A neve reflete toda a luz e aparenta ser
branca.
• Uma roupa preta absorve praticamente toda a
luz, assim se torna preta.
• Muitos objetos parecem ser coloridos porque
sua estrutura química absorve certos
comprimentos de onda de luz e reflete outros.
Cor e Luz
• Quando a luz branca passa através de
um prisma (um objeto transparente
triangular), as cores que formam a luz
branca se dispersam em sete bandas
de cor.
• Sete cores constituem a luz branca,
sendo estas: vermelho, laranja,
amarelo, verde, azul, índigo e
violeta.
Cor e Luz
• A variação de
cor de um
sistema que
sofre uma
alteração na
concentração de
algum
componente é a
base da análise
colorimétrica.
FOTOMETRIA E 
ESPECTROFOTOMETRIA
• A fotometria e a
espectrofotometria estudam a
medição das grandezas relativas
à emissão, à recepção e à
absorção da luz.
• Na bioquímica clínica, medidas
espectrofotométricas são
essenciais para a compreensão
de disfunções metabólicas
desencadeadas por alguma
patologia.
Fonte: Alencar, 2016.
FOTOMETRIA E 
ESPECTROFOTOMETRIA
• Os métodos bioquímicos quantitativos
tem aplicações principalmente nas
determinações das quantidades de
lipídeos totais, bilirrubina, albumina,
creatinina, ureia, ácido úrico, amônia,
amilase, fosfatase alcalina, fosfatase
ácida, aminotransferase, glutamina
transferase, creatinina quinase, cálcio,
fósforo, magnésio ferro sérico entre
outros.
• Inúmeras doenças puderam ter suas
fisiopatologias conhecidas e também
passaram a serem diagnosticadas pelo
uso de técnicas colorimétricas
aplicadas à espectrofotometria.
Fonte: Alencar, 2016.
FOTOMETRIA E 
ESPECTROFOTOMETRIA
Absorbância
Transmitância
• Um fotômetro isola um comprimento de
onda específico de luz usando filtros.
• Espectrofotômetros permitem a
medição no espectro de todos os
comprimentos de onda de luz
visíveis e não apenas ondas pré-
especificadas.
FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetro
TRANSMITÂNCIA
• A transmitância consiste na medida da luz transmitida. Quando um raio de luz
monocromática de intensidade inicial definida incide sobre uma solução colorida,
a intensidade da luz emergente é menor que a luz incidente, ou seja, parte da luz
foi absorvida.
Espectrofotômetro
ABSORVÂNCIA
• A absorvância, por sua vez, consiste na medida da luz absorvida, onde mede-se
a intensidade de luz absorvida por uma solução corada pela redução da medida
da intensidade da luz transmitida.
Curva de calibração
Curva de calibração
Espectrofotômetro
LEI DE BOUGUER-LAMBERT
• Bouguer e, em seguida, Lambert investigaram a relação entre a
diminuição da intensidade de luz e a espessura do meio absorvente.
• Ao incidir-se um raio de luz sobre diversas camadas opticamente
homogêneas e de espessuras conhecidas, observa-se uma
proporção direta entre a espessura das camadas e o logaritmo da
transmissão, ou a transmissão da luz decresce logaritmicamente
com o aumento linear da espessura da camada.
• Tem-se, então, uma relação direta entre a absorvância e a
espessura da camada. Quanto maior a espessura da camada,
maior a absorvância, e menor a transmitância.
Espectrofotômetro
LEI DE BEER-LAMBERT
• A lei de Beer-Lambert, ou simplesmente Lei de Beer, afirma que a
concentração de uma substância é diretamente proporcional à
quantidade de luz absorvida ou inversamente proporcional ao logaritmo
da luz transmitida.
• Na prática laboratorial, a aplicação quantitativa da Lei de Beer é
realizada pelo emprego de espectrofotômetros, onde são lidas as
absorvâncias de uma solução teste e de uma solução padrão de
concentração conhecida (após submetida a reações apropriadas), e a
concentração do teste é calculada a partir da seguinte fórmula:
[Amostra] = Absorvância do teste x [Padrão] / Absorvância do padrão
ELETROFORESE
• A eletroforese é uma
técnica analítica utilizada
na análise
de macromoléculas como
proteínas e ácidos
nucléicos. Essa técnica foi
descoberta e empregada
pela primeira vez em 1937
por Arne Tisélius um
bioquímico sueco.
ELETROFORESE
• A técnica consiste na migração de
moléculas em função da aplicação de
um campo elétrico.
• A princípio a mostra é aplicada em gel e
a fonte de eletroforese cria a corrente
elétrica que ocasiona a sua migração,
quanto maior a molécula, mais lento é
este processo, assim, moléculas de
diferentes tamanhos realizam este
trajeto de um pólo a outro em tempo e
velocidades distintos.
• A distância que o fragmento percorreu é
comparada a um padrão e as bandas
irão guiar o pesquisador durante a
análise. Para a visualização, é utilizado
um corante que sob a luz UV de um
transiluminador emite fluorescência e
permite a leitura das bandas.
EQUIPAMENTO E REAGENTES USADOS 
NA ELETROFORESE
• Agarose ou poliacrilamida
• Cuba e fonte de eletroforese
• Tampão de eletroforese
• Marcador de peso molecular
• Corante fluorescente – corante safer ou brometo de etídio
• Transiluminador UV ou LED
EQUIPAMENTO E REAGENTES USADOS NA ELETROFORESE
Turbidimetria
• O método turbidimétrico, foi inicialmente descrito em 1942 por Foster num estudo de
dosagem de Penicilina avaliando a inibição do crescimento de Staphylococcus aureus.
• É utilizado para mensurar a concentração de partículas grandes, que não podem ser
mensuradas por meio de espectroscopia de absorção.
• Nefelometria: mais sensível, baseada na quantidade de luz dispersa entre as partículas e
por isso a sensibilidade é maior, já que a quantidade de luz dispersa é maior que a luz
transmitida em uma solução túrbida.
Turbidimetria
• Pode ser aplicada na quantificação da concentração de proteínas em
líquidos biológicos, como urina e líquido cerebroespinal (LCE),
hemoglobina glicada, complexos antígeno-anticorpo, além de
pesquisa de Proteína-Creativa (PCR).
• Vantagens: rapidez, facilidade operacional, medida objetiva da
resposta e exatidão.
• Desvantagens: incluem a necessidade de equipamento de leitura da
resposta, ausência da identificação de contaminação grosseira ou
coloração da amostra que interfira na leitura fotométrica.