Aula 1 - Amostras e espectrofotometria em exames bioquimicos

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METODOS ANALÍTICOS EM BIOQUÍMICA CLINICA
ESPECTROFOTOMETRIA
(REAÇÕES COLORIMÉTRICAS E CINÉTICAS)
Prof: DIMAS JOSE CAMPIOLO
FASES DE REALIZAÇÃO DE EXAMES
	Fase pré-análitica
	Preparo do Paciente
	Coleta do Material
	Preparo e armazenamento da amostra biológica
	Fase analítica
	Fase pós-analítica
*
MATERIAL BIOLÓGICO (AMOSTRAS):
Sangue total
 Soro
Plasma
 Líquidos cavitários
 Urina
 Líquor
 Esperma, etc...
TUBOS DE COLETA A VÁCUO
Tubo para Coleta Sangue a Vácuo
(5) 
(inversões)
(3-4)
(8)
(8)
(8)
Cor da tampa (nome)
Finalidade
Anticoagulante
Tubo para Sorologia (seco)
Não
Possui partículas de sílica 
micronizada e gel de separação ou
Esferas de poliestireno
Separar soro
Dosagens Bioquímicas
e Imunológicas
Tubo para coagulograma
Citrato trissódico (3,2% ou 3,8%)
1 parte citrato para 9 partes de sangue 
Coagulação
Tempo e atividade 
protrombina (TPAP)
Tempo de Tromboplastina
Antitrombina III
Tubo para plasma
Heparina (lítica, amônica ou sódica)
Parede revestida com heparina ou
barreira de gel
Separar plasma
Dosagens de vários
parâmetros
Tubo para hematologia
EDTA-K2 ou EDTA-K3 ou EDTA 8%
Hemograma, Plaqueta
HT/Hb, eletroforese de Hb
Hb glicosilada
Tubo para Glicemia
Anticoagulante/Estabilizador
oxalato de potássio/fluoreto de sódio
EDTA/fluoreto de sódio
Heparina (sódica ou lítica)/fluoreto sódio
Dosagem glicose
Teste Tolerância Glicose
Teste Tolerância Insulina
Prova sobrecarga lactose
	Soro	Plasma
	Uso de anticoagulantes	Não	Sim
	 Consumo de fatores da coagulação e fibrinogênio pela ativação da coagulação	Sim	Não
(Quando colhido com citrato)
	 Quantidade líquida separada	Menor	Maior
	 Probabilidade de ocorrência de hemólise	Maior	Menor
	 Tempo de espera para separação da parte líquida	Maior
- 60 minutos
sem ativador do coágulo
- 30 minutos
com ativador do coágulo	Menor
- 5 minutos para cair a temperatura
	 Exames	Sorologia: (Chagas, HIV, Hepatite, VDRL. etc..) Dosagens bioquímicas etc..	Hemograma, Provas de coagulação, tipagens, eletroforese de hemoglobina etc...
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	Método de análise baseado em medidas de absorção de radiação eletromagnética. 
	 Espectrofotometria Óptica
	Comprimento de onda corresponde a luz visível ou ultra-violeta: 
	faixa entre aproximadamente 180 a 800 nm
Espectrofotometria
*
	Vários fenômenos podem ocorrer com a radiação luminosa, como: reflexão, refração, espalhamento ou ser absorvida pelo material.
Absorção de Radiação
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ESPECTROFOTOMETRO
		O espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. 
		Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca). 
	 A espectrofotometria  podem ser  conceituadas como um procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz).
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ESPECTROFOTÔMETRO
	 A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho; 
	 Quando luz passa através de uma amostra ou quando ela é refletida de uma amostra, a quantidade de luz absorvida é a diferença entre a radiação incidente (I0) e a radiação transmitida (I).
	 A quantidade de luz absorvida é expressa tanto como transmitância ou absorbância.
	COMPONENTES BÁSICOS DA FOTOMETRIA
	 Fonte de energia elétrica
	 Fonte de energia radiante
	Lâmpada de Tunstênio – UV próximo e visível
	Lâmpada de Hidrogênio – região do UV
	 Monocromador
	 Porta Cubetas
	Quadradas
	Redondas
	 Detectores: E° radiante transmitida em E° elétrica
	 Circuito medidor: E° elétrica emitida e medido em A e/ou T
ESPECTROFOTOMETRO
MEDIDAS
	Leitura em Transmitância
	Leitura em Absorbância
	Leitura em Concentração
	Transmitância é a fração da luz incidente em um comprimento de onda específico, que passa por uma amostra de matéria.
T = P / P0
TRANSMITÂNCIA
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TRANSMITÂNCIA
 A intensidade de uma absorção pode ser expressa em Transmitância (T) definida como T=P/P0 onde:
 P0: Intensidade da energia radiante que incide na amostra 
 P: intensidade da radiação que emerge da amostra.
Obs: A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada:
	É a capacidade do material em absorver radiações em frequência específica. 
A = - log10 T
ABSORVÂNCIA
Absorbância
A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada:
Relação entre a concentração de uma solução e a luz absorvida. A solução 20g/l absorve o dobro da solução 10g/l.
solução 10 g/l
Po
PT1
solução 20 g/l
PT2
Po
feixe de luz de
intensidade Po
A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através das amostras:
Po
PT1
Po
PT2
3 cm
feixe de luz de
intensidade po
1 cm
LEI DE LAMBERT-BEER
	A Lei de Lambert-Beer: a absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre  absorbância ou densidade ótica  e concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração.
 Quando a E°radiante atravessa uma solução, a quantidade de E° transmitida  com:
	-  espessura atravessada (LEI DE LAMBERT);
	-  da concentração ou intensidade da cor da solução (LEI DE BEER);
“LEI DE LAMBERT-BEER”
A relação entre E emergente/ E° incidente indica a transmitância da solução.
 
Representação gráfica da Lei de Beer, para soluções de KMnO4 em 545 nm e um caminho óptico de 1 cm.
	Em %Transmitância (%T versus c)
b) Em Absorbância (A versus c)
 
(C = Concentração em mg/L)
INSTRUMENTAÇÃO 
O que é luz? Luz é uma onda eletromagnética. Uma onda é caracterizada pela velocidade com que se propaga, a intensidade, e o comprimento de onda (ou a frequência). Em um determinado ponto no espaço, o que varia rapidamente (umas 1014 vezes por segundo) são campos elétricos e magnéticos. 
	Cor 	Comprimento de onda (nm) 	Cor 	Comprimento de onda (nm) 
	Ultravioleta 	<400 	Amarelo 	570-590 
	Violeta 	400-450 	Alaranjado 	590-620 
	Azul 	450-500 	Vermelho 	620-760 
	Verde 	500-570 	Infravermelho 	>760 
INSTRUMENTAÇÃO 
Se a luz passa em uma solução onde não há absorção nenhuma, a absorvância será zero e a transmitância será 100.
ESPECTRO UV
O espectro UV está dividido em 3 partes: 
UVC (< 280nm), UVB (280–320nm), UVA (320–400nm). 
	UVA – Luz Negra – 320:400 nm
	Bronzeado;
	Formação da catarata;
	UVB – Região do eritema – 280:320nm
	Região potencialmente carcinogênica;
	Protetores solares;
	UVC – Bactericida e Germicida - < 280 nm
	Protegidos pela camada de ozônio;
	Lâmpadas de vidro bloqueiam completamente esses raios;
“Uma solução AZUL absorve o VERMELHO com maior intensidade e portanto deve-se escolher a porção vermelha para medida da solução azul”
OBJETIVO:
“Utilizar uma faixa no espectro na qual a E° radiante seja absorvida ao máximo ou aproximadamente”
 Faixa visível do Espectro Eletromagnético Radiante. 
	Comprimento de onda 
(nm)	Cor 
absorvida	 Cor da solução 
 analisada
	380 – 430	Violeta	Amarelo – verde
	430 – 475	Azul	Amarelo
	475 – 495	Verde – azul	Laranja
	495 – 505	Azul – verde	Vermelho
	505 – 555	Verde	Púrpura
	555 – 575	Amarelo – verde	Violeta
	575 – 600	AMARELO	AZUL
	600 – 620	Laranja	Azul – verde
	620 - 700	Vermelho	Verde - azul
METODOLOGIAS:
SEGUNDO PRODUTO FORMADO
AGLUTINAÇÃO
COLORIMÉTRICA
PRECIPITAÇÃO
	REAÇÃO DE PONTO FINAL:
	Aquelas reações que formam produtos cuja concentração chega a um ponto máximo permanecendo estável por um certo tempo;
SEGUNDO PROCEDIMENTO TÉCNICO
REAÇÃO DE CINÉTICA CONTÍNUA:
	Reações que utilizam medidas contínuas da formação de produtos;
	REAÇÕES CINÉTICAS DE TEMPO FIXO:
	Reações que utilizamum tempo fixo de incubação sendo a formação de produtos interrompida por qualquer processo.
	REAÇÃO DE CINÉTICA DE 2 PONTOS: Útil para diminuir tempo de reação, eliminar interferentes.
ESPECTROFOTOMETRIA
 APLICAÇÃO CLINICA
	Espectro de absorção
	Curva de calibração
	Dosagem de amostra
 APLICAÇÕES DA FOTOMETRIA EM ANÁLISES BIOQUÍMICAS
 
A principal finalidade de uma medida espectrofotométrica, nas regiões do ultravioleta e visível, é avaliar quantidades.
Assim, é extremamente importante efetuar uma rigorosa calibração visando obter resultados exatos.
 
Para obter-se uma curva de calibração alguns aspectos devem ser considerados como: 
	 A escolha de uma solução padrão ( Ex:proteina-Albumina)
	 O estabelecimento de um branco adequado 
	 A seleção da área espectral.
Solução padrão 
Constitui parte integrante da análise quantitativa no laboratório e usada na dosagem de amostra desconhecida. 
Uma solução padrão apresenta concentração exata de uma substância conhecida, que servirá como referência na determinação fotométrica de concentrações desconhecidas desta mesma substância. 
Uma solução padrão tem grande importância no preparo da curva de calibração.
Exemplo: uma solução padrão de albumina 10 mg/ml
Isto significa que foram pesados 10 mg de albumina que a seguir foram dissolvidas em 1 ml de água ou outro solvente.
 Preparo de uma curva padrão (ou calibração)
O preparo da curva de calibração é de grande importância e deve ser bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas próprias curvas de calibração e interpretar os resultados obtidos.
 
Para se obter o valor da concentração de substâncias cuja concentração se desconhece, é necessário estabelecer uma relação entre a absorbância desta solução em diferentes concentrações com as suas concentrações.
 Isto se chama curva de calibração (curva padrão).
BR
 2 
 4 
 6 
 8 
10mg/ml
	Preparar uma série de padrões exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada. Usar o padrão recomendado para o método a ser calibrado. 
2. Dosar todos os padrões de acordo com a técnica recomendada. Efetuar as leituras colorimétricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A, além do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de absorção espectral previamente realizada.
3. Obter os valores de Absorbância.
4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbância (ordenada) com as concentrações dos padrões (abcissa). 
 Examinar bem os pontos e decidir se eles serão cobertos por uma linha reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traçar uma curva de modo que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva não deve ser traçada de ponto a ponto, mas interpolando através dos pontos.
5. Examinar a curva traçada, avaliando se ela tem sensibilidade correta 
 A curva padrão ideal deve ter ângulo aproximado de 45° 
Uma boa curva padrão
 Dosagem de proteínas totais de uma amostra
Determinar a concentração amostra recorrendo à curva padrão de proteínas totais na
 1,0 ml da amostra
 4,0 ml do reagente de biureto
 Esperar 10 minutos
 Ler contra o Branco
Amostra
 Conc. ?
 O USO DE FATOR DE CALIBRAÇÃO (FC)
È um artifício usado rotineiramente e seu cálculo é feito como:
 concentração padrão
FC =  
 absorbância padrão 
A absorvância da luz a cada comprimento de onda é diretamente proporcional à concentração da solução contida na cubeta. Esta linearidade deixa de ocorrer a concentrações muito elevadas da substância, podendo nesses casos diluir previamente a amostra a medir. 
Linearidade da reação