Aula_cromatografia_I-2022

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DISCIPLINA
IC -363 - CROMATOGRAFIA
Departamento de Química –
Instituto de Química
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Profa Rosane Nora Castro- sala 52 -PQ
nora@ufrrj.br
Bibliografia básica: COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO,P.S. 
Fundamentos de Cromatografia. Campinas: Unicamp, 2006 Rosane Nora- -2017
Histórico : Cromatografia
 Mikhail Semenovik Tswett (1872-1919) - separação de
pigmentos vegetais em zonas com cores distintas.
(khroma [cor] + graphein [escrever] - grego). 
 Em 1901, o botânico russo Mikhail Tswett defendeu sua
dissertação de mestrado na Universidade de Kazan, sob o
título: “Um estudo físico-químico do grão de clorofila.
Experimentos e análises”.
Lápide de Tswett na cidade russa de 
Voronezh, onde se lê a inscrição: 
“͞Ele inventou a cromatografia, 
separando moléculas mas unindo 
pessoas”
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Nota
Interação da amostra/mistura sendo separada em duas fases: FE e FM. Essas duas fases são imiscíveis, ou seja, não interagem/não se reconhecem/sem atividade química.
A amostra em si, que se deseja separar que precisará ter maior afinidade pela FE ou pela FM. Sendo assim, quanto maior afinidade pela FE, maior será o tempo necessário para a mesma sair da coluna. E quanto maior for a afinidade pela FM, mais rapidamente a mistura sairá da coluna.
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 Em 1906 o botânico russo M. Tswett descreveu
suas experiências na separação de pigmentos
extraídos de plantas.
 O experimento usou coluna preenchida com CaCO3
como adsorvente e solvente orgânico para a
separação das substâncias.
Khromatos = cores 
Graphos = descrever
FM- Éter de 
petróleo
CaCO3- FE
Método físico-químico de separação de componentes de uma mistura,
que envolve a distribuição diferencial destes em um sistema
heterogêneo bifásico: FASE ESTACIONÁRIA e a FASE MÓVEL.
Cromatografia
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Os componentes da mistura adsorvem-se com as partículas de sólido
devido a interação de diversas as forças intermoleculares. O composto
terá uma maior ou menor adsorção, dependendo das forças de interação,
que variam na seguinte ordem:
formação de sais > coordenação > ligação de hidrogênio > dipolo-dipolo > 
Van der Waals.
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Nota
CaCO3 = adsorvente, FASE ESTACIONÁRIA.
Éter de petróleo = solvente, FASE MÓVEL.
Duas fases que não se misturam.
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Nota
FIXA
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SE MOVIMENTA.
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CO2, gás que se comporta como líquido. 
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A cromatografia pode ser dividida em diferentes tipos,
conforme algumas características, por exemplo:
– objetivo da separação: analítica ou preparativa;
– natureza de fase móvel: líquida ou gasosa; Prado et al, Aplicação e modificação química da sílica gel obtida de areia. Quim. Nova, Vol. 28, No. 3, 
544-547, 2005 .
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Cromatofolhas para CCD
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Nota
Objetivo analítico: ANALISAR (pureza)- CCD

Objetivo preparativo: ISOLAR determinado componente - CCDP

Cromatografia em papel é somente com objetivo analítico. 
Coluna aberta - preparativa.
Gasosa - analítica

Forma de execução (finalidade) e a quantidade de amostra a ser analisada definirá qual método cromatográfico que será utilizado.
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Nota
FM - gás
FE - líquido
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Nota
FE - sólido
FM - gás ou líquido
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Nota
Apresenta característica de um liquido -> gel. Mas não possui a característica do liquido em escorrer/molhar.
É um filme, que é depositado na parede do tubo/coluna. 
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Cromatografia de Adsorção
 fase estacionária – sólida
 fase móvel (eluente) – líquida ou gasosa
 tendência da substância em aderir a uma superfície de um sólido polar 
Ex: cromatografia em camada fina, alguns tipos de cromatografia em coluna 
 adsorventes mais comuns: gel de sílica, alumina, florisil (FE inorgânicas), 
poliamidas, Sephadex (exclusão/adsorção) (FE orgânicas)
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Poder adsorvente da sílica (adsorvente polar):
 maior afinidade = maior retenção = menor Rf
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Nota
Adsorvente inorgânico sólido -> silicato
Polar - presença de um grupo chamado silanol (Silício + -OH), faz ligações de hidrogênio fortemente/momento dipolo.
Possui afinidade por água, de fácil retirada (aquecimento em estufa).

Eluente - menos polar que a sílica (apolar)
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Nota
Afinidade com a sílica aumentando, quem é mais polar ficara mais agarrado.
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Nota
Mais polar
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Nota
Menos polar.
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Nota
Fator de retenção = distancia percorrida pela amostra / distância percorrida pelo solvente.
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Polaridade dos solventes
TIPOS DE SEPARAÇÃO
Rosane Nora- 2020
• Os princípios físico-químico básicos de separação 
são:
– Adsorção: O soluto é retido pela superfície da fase estacionária
(sólida) através de interações químicas ou físicas.
– Partição: O soluto se dissolve na parte líquida que envolve a
superfície do suporte cromatográfico.
– Troca iônica: O íon da amostra se liga à carga fixa (grupo
funcional) da fase estacionária.
– Exclusão moléculas: As moléculas são separadas por
tamanho, havendo retenção das menores.
– Bioafinidade: Ocorre uma ligação molecular específica e
reversível entre o soluto e o ligante fixado à fase estacionária.
– HILIC: emprega uma FE mais polar do que em FR-HPLC e FM
com pouca concentração de água ou tampão, sendo
normalmente > 70% em solvente orgânico
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Nota
Líquido - Líquido -> FE e FM
ex.: papel

CC, CCDA e HPLC
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Sólido - Líquido -> FE - FM
CC, CCD, HPLC
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Nota
Adsorvente com carga - Líquido -> FE e FM
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Adsorvente que separa por tamanho (peneira) - Líquido -> FE e FM
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Nota
Adsorvente possui ligantes (proteínas) - Líquido -> FE e FM
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Nota
Hibrido - partição e adsorção
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Mais polar.
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Nota
Menos polar.
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Nota
Mistura entre solventes = os mesmos precisam ser miscíveis entre eles.
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 fase estacionária – líquida
 fase móvel – líquida ou gasosa
 Baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes
da amostra na fase móvel (liquida) e na fase estacionaria (liquida).
ex: cromatografia em papel, gás-líquido, HPLC
 adsorventes mais comuns: C-8 e C-18 (FR); -NH2 (FN)
Cromatografia de Partição
Os diversos componentes da amostra 
devem apresentar diferentes valores de 
coeficiente de partição para que ocorra a 
separação.
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Partição: Tipos de adsorventes e aplicações
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Nota
Hidrocarbonetos = se ligam a sílica tornando-a um "filme", líquido. 

- grupos lipofílicos. 
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Nota
Partição: fase normal e fase reversa

Fase reversa: FE (menos polar) - FM (mais polar)

Adsorção:
Fase normal / sílica: FE sólido (mais polar) - FM (menos polar)
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 PARTIÇÃO: Quando se utiliza silica-gel derivatizada com grupos
polares (ciano, amino, diol, fenila), tais fases estacionárias podem ser
utilizadas tanto para cromatografia em fase normal ou em fase reversa.
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Cromatografia de Troca Iônica
Processo de cromatografia que separa íons e moléculas polares com base em sua afinidade c
om a resina da coluna trocadora de íons.
A fase estacionária é altamente carregada, e solutos com cargas de sinais contrários a esta
são seletivamente adsorvidos na fase móvel.
 FE constituída de uma resina poliestireno entrecruzadacom divinilbenzeno,
a qual são ligados grupos iônicos:
Resinas aniônicas – (Res-NR3+)
Resinas catiônicas – (Res-SO3
-)
 Os solutos adsorvidos podem ser subsequentemente eluídos por deslocamento com outros
íons, com o mesmo tipo de carga, porém com maior força de interação com a fase
estacionária.
A) Proteínas com cargas negativas diferentes se 
ligam à resina de troca catiônica
B) Através do incremento de concentração de 
sal, proteínas com carga negativa mais fraca 
eluem primeiro
C) Com concentrações de sal cada vez mais 
altas, as proteínas mais fortemente carregadas 
eluem por último.
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Nota
Partição de fase normal.
FE (mais polar) - FM (menos polar)

- grupos hidrofílicos 
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Nota
Ela é positiva, atrai anions. 
- Sal de amônio quartenário.
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Nota
- Atrai cations, negativa. 
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Nota
Polímeros carregados, interação eletrostática = troca de cargas. 
Coluna aberta e em HPLC
Podem ser utilizadas mais de uma vez.
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Cromatografia de Exclusão por Tamanho
.As separações ocorrem através da diferença no tamanho das moléculas.
 Fase estacionária é um gel, constituído por macromoléculas que tem ligações
cruzadas.
 Coluna recheada com material inerte cujos poros tem tamanho controlado.
https://www.priyamstudycentre.com/2022/02/size-exclusion-
chromatography.html
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 Géis de dextrana (Sephadex)
 Géis de poliacrilamida
 Géis de agar e agarose
Tipos de recheios usados em cromatografia por exclusão
Ex: O Sephadex é um biopolímero de 
hidroxipropil da dextrana entrecruzada
Sephacryl ( dextrana +bis-acrilamia- 50µm
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Nota
Primeiro se separa as moléculas de peso maiores. As moléculas menores passam mais vezes por dentro dos poros, ficando mais tempo retidas. 

- como se fosse um processo de filtração. 
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Nota
GPC x GFC: ambas são exclusão, com diferença na fase móvel. 

GPC - cromatografia de permeação em gel. FM - solvente orgânico. 

GFC - cromatografia de filtração em gel.
FM - aquosa. 
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Nota
Coluna aberta ou em HPLC
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 Fase móvel líquido
 Fase estacionária sólida
 Propriedades biológicas e funcionais 
Rosane Nora- 2020
 separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante 
 géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
Cromatografia de Afinidade
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Número de publicações científicas obtidas através da busca do termo
“hydrophilic interaction chromatography” no portal ISI/Web of Science de 1990
até 2014
CROMATOGRAFIA POR INTERAÇÕES HIDROFILICAS (HILIC)
 Introduzida por Alpert na década de 90 (hydrophilic interaction
chromatography). Alpert; J.Chromatography, 499 (1990) 177-196
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HPLC 
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Cromatográfica por Interação Hidrofílica (HILIC) 
 HILIC - conceito relativamente novo na cromatografia de partição.
• Considerada cromatografia de fase normal devido à alta polaridade da
superfície do gel empregado. FE polar e FM menos polar
• O material de base pode ser sílica ou polímero, e pode ser modificado com
diferentes funcionalidades polares, como amida, amina, diol e ciano.
• Comparada à cromatografia normal, a FM usada para HILIC é muito
semelhante à de Fase Reversa ; mistura de água (pequena quantidade) e
solvente orgânico (acetonitrila >70%).
• Compostos hidrofílicos que eram "muito polares" para serem retidos pela Fase
Reversa podem ser analisados por HILIC usando uma fase móvel semelhante à
que seria usada na fase reversa.
•HILIC é comumente usada para separação de carboidratos, em especial os
sacarídeos, que são hidrofílicos.
Collins et al, Quim. 
Nova, Vol. 39, No. 2, 
210-220, 2016
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• O termo HILIC deve ser empregado se o solvente de eluição forte for a água e
o mecanismo de retenção for a partição.
• Vantagens que esta modalidade de separação apresenta em relação à
cromatografia líquida em FN e FR:
 melhor solubilidade dos compostos polares, que usualmente possuem
baixa solubilidade nos solventes apolares empregados em FN;
 possibilidade de ser empregada em análises com detecção por EM, uma
vez que a ionização usando uma FM orgânica apolar não é facilmente
alcançada;
 a ordem de eluição dos compostos em HILIC é mais ou menos oposta à
ordem de eluição em FR, HILIC retém melhor os compostos que são
problemáticos de se analisar em FR;
 alta detectabilidade nas análises por EM devido à alta porcentagem de
solvente orgânico polar empregada nas FM para HILIC;
 separações mais rápidas devido a menor viscosidade da FM.
 Redução do preparo da amostra
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Nota
FE - líquido.
- Coluna / adsorvente polar com um solvente polar 

Hibrido = partição, troca ionica, e de fase reserva. 

HPLC
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Ex. sílica porosa como suporte, sendo esta
modificada com grupos funcionais polares tais
como sulfo alquil betaína (Zwiteriônica)
Mecanismos de Separação
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Classificação Métodos Fase Estacionária Tipo de interação
Líquido – líquido 
ou Partição
Líquido adsorvido em 
um sólido
Partição entre 
líquidos imiscíveis
Cromatografia 
Líquida
Fase líquida -
ligada
Espécies 
quimicamente 
ligadas a uma 
superfície sólida
Partição entre 
líquidos e 
superfícies ligadas
Líquido – sólido ou 
adsorção
Sólido Adsorção
Troca Iônica Resina de Troca 
Iônica
Interação iônica
Exclusão por 
tamanho ou gel de 
filtração
Líquido em interstício 
de sólido polimérico 
ou gel polimérico 
Partição ou filtração
CL Interação 
Hidrofílica (HILIC)
Fases Polares 
líquidas, Iônicas, 
Zwiteriônicas
Partição líquido-
líquido
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Modos de Separação na CL
Filtração em Gel –
Aquosa
Permeação em Gel –
Orgânica
Poliestireno
SílicaExclusão por 
Tamanho
Compostos de alto 
peso molecular
Polímeros
Aquosa/Tampão
Resina de Troca 
Catiônica ou
Aniônica
Troca Iônica
Íons inorgânicos
Solventes 
Orgânicos
Sílica, Amino,
Ciano, DiolFase Normal
Não solúveis em água
Água/Reagente 
orgânico 
de par iônico
C18, C8Par Iônico
Iônicos
Ácidos
Bases
Água/Modificadores
orgânicos
C18, C8, C4
Ciano, AminoFase Reversa
Neutros
Ácidos fracos
Bases fracas
Fase MóvelFases EstacionáriasModoCompostos
Polares
Interação
Hidrofílica (HILIC)
(FN aquosa)
Sílica, amino, Ciano, 
Diol, Zwiteriônicas
Solvente Orgânico/ 
com pequena 
quantidade de água
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Tipos de Cromatografia:
 Planar : 
- cromatografia em camada delgada analítica (CCDA ou TLC)
- cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP)
- cromatografia em papel (CP)
- Centrífuga (Chromatotron)
 Cromatografia em coluna: coluna- aberta ou fechada
- coluna aberta (gravidade e “flash”)
- cromatografia em fase gasosa (CGAR)
- cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
 diâmetro interno do tubo(preparativa/ analítica)
 estado físico da F.M.(gas/líquido/supercrítico)
 fase estacionária (líquido/sólido)
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