Resumo Citometria de Fluxo

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Beatriz Carvalho Pontes 
Ao realizar um teste na citometria de fluxo, a 
máquina de citometria irá avaliar na célula 
susceptivelmente tamanho, complexidade 
(há grânulos?), e fluorescência (vinda da 
ligação com anticorpos monoclonais 
específicos + fluorocromo). O fluorocromo 
do anticorpo é excitado e libera uma luz, da 
qual será captada pela máquina. 
 
É pelo desvio de luz causado pelo lazer que 
se sabe o tamanho da célula (SSC). 
A complexidade se dá de forma parecida, 
uma vez que a luz é dispersada pelos 
grânulos da célula é quem irá determinar o 
quão granuloso aquela célula é (FSC). 
 
Ambas as análises são essenciais para o 
desenvolvimento do gráfico de citometria de 
fluxo, e ambos gráficos são lidos pelo 
aparelho através do lazer “Blue”. 
A máquina de citometria de fluxo realiza 
leituras dentro do spectro RGB - RED (3 
luzes), GREEN (2 luzes) e BLUE (5 luzes), ao 
mesmo tempo. O leitor ainda identifica 
também cada pertencente à sua coloração 
devido ao seu comprimento de onda emitido 
pela célula, o que as vezes pode resultar em 
cores sobrepostas, uma vez que alguma 
célula pode-se ter um comprimento similar a 
outra. Frente há este overlap de cores, é 
resolvido por compensação de single colors 
– separa-se a mesma amostra em 2 tubos. 
- 
Na prática: Passa-se um BID (controle) na 
máquina + sangue + anticorpo monoclonal. 
Todos são já pré-estabelecidos e possuem um 
resultado já esperado. O painel do software 
do controle mostra todos os lasers que há no 
equipamento, isto é, até quantas cores a 
máquina é capaz de capturar. 
Quando partimos para a amostra + 
anticorpo monoclonal marcado com 
fluorófo. 
 
Normalmente, em protocolos de anticorpos 
monoclonais, dá-se uma medição além do 
necessário. Para que a célula não fique 
extremamente marcada e acabe-se 
perdendo amostra, é aconselhável usar um 
valor de diluição. 
Beatriz Carvalho Pontes 
Após isso, centrifuga-se a amostra de acordo 
com o protocolo que o laboratório irá seguir. 
Adiciona-se então tampão de lise, para que 
hemácias não interfiram na análise. A lise é 
realizada tanto no tubo com anticorpos 
marcados quanto no tubo com anticorpos 
não marcados. 
Há uma diluição em PBS para melhor 
visualização e então obtém-se um resultado. 
Na leitura dos resultados, é considerado 
positivo de 10 para frente. 
A título de curiosidade... 
- Tem como bloquear canais de luz para ler 
apenas um fluxo/filtro específico! 
- Além disso, células mesenquimais possuem 
autofluorescência. 
 
A lado, imagens esquematizadas para maior 
compreensão do funcionamento interno de 
um equipamento para uma Citometria de 
Fluxo: