CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE - HPLC) pdf

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA 
(CLAE) 
 
 A cromatografia é uma técnica físico-química de separação de substâncias. 
Ocorre através da distribuição de componentes de uma mistura ao longo de duas fases 
que estão em contato entre si. 
 Para que isso ocorra, quando a fase móvel (FM) se desloca sobre a fase 
estacionária (FE), os componentes da mistura interagem e são seletivamente retidos pela 
FE, resultando numa migração diferencial dos componentes. 
 A CLAE também pode ser chamada de cromatografia líquida de alta velocidade, 
alta pressão, alto desempenho ou alta resolução. 
 As principais vantagens da CLAE em relação à cromatografia em coluna 
clássica são: análises quantitativas, pouco tempo de execução (minutos), versatilidade, 
automação, alta resolução, alta eficiência e sensibilidade. Por outro lado, apresenta 
algumas limitações, tais quais o alto custo de instrumentação e manutenção, difícil 
análise qualitativa, falta de um detector universal sensível e necessidade de mão de obra 
qualificada e experiente. 
 É bastante empregada na análise de combustíveis alterados, no controle de 
qualidade de medicamentos e alimentos, na análise de elementos traços e resíduos. 
 
Vantagens Desvantagens 
Menor tempo de análise Alto custo da instrumentação 
Alta resolução Alto custo da operação 
Resultados quantitativos Pouco usada para análises qualitativas 
Boa sensibilidade Falta de detector universal sensível 
Versatilidade Necessidade de experiência no manuseio 
Automação 
 
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A amostra utilizada em CLAE 
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 Antes de inseri-la no equipamento, é necessário conhecer as características dos 
compostos da amostra a ser analisada. Deve ser levado em conta: 
 
Número de compostos presentes Estrutura química 
Peso molecular Valores do pKa 
Espectro UV Concentração dos compostos 
Solubilidade da amostra Compatibilidade com a fase móvel 
 
 Às vezes as amostras necessitam de diluição antes da injeção ou algum pré-
tratamento, a fim de remover interferentes que venham a prejudicar a coluna ou outra 
parte do cromatógrafo. 
 A amostra deve ser homogênea e representativa de todo o material. Deve ser 
preferencialmente preparada na FM. 
 O seu tamanho não deve exceder de 1 a 10µg do soluto por grama do 
empacotamento. 
 Uma etapa importantíssima de pré-tratamento é a filtração. Para tal, são 
recomendados filtros com porosidade de 0,25 a 2µm. Se necessário, utilizar uma bomba 
a vácuo para facilitar a passagem da amostra. 
 
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Resolução 
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 Os dois picos grandes são de solutos retidos na coluna, enquanto que o pico 
menor representa um soluto não retido que atravessa a coluna na mesma velocidade da 
fase móvel. 
 Embora um pico no cromatograma possa ser identificado pelo seu tempo de 
retenção (tR), por causa da sua variação com o comprimento da coluna e o fluxo da fase 
móvel, é melhor identificar os picos usando-se fator de capacidade (k): 
 
 
 
 
 Os fatores de retenção devem estar entre 1 e 10, pois se forem muito baixos, 
significa que não são adequadamente resolvidos. Se forem muito altos, os tempos de 
análise serão muito longos. 
 A separação de dois picos é descrito pelo fator de seletividade ou de separação 
(α). O α é calculada pela razão dos dois fatores de seletividade: α = k2 / k1. 
 
 A equação geral da resolução é a seguinte: 
 
 Quanto maior o tempo que o soluto gasta para atravessar a coluna, maior a 
dispersão da banda. Dizemos que a eficiência é maior quando a dispersão é menor, isto 
é, quando o soluto gasta menos tempo para ser eluído. 
 A eficiência da coluna é medida em pratos teóricos (N). Quanto maior o número 
de pratos teóricos ou a altura equivalente a um prato (H), maior a sua eficiência. N = L / 
H. Este é o parâmetro utilizado para avaliar o desempenho da coluna. 
 A teoria hidrodinâmica estabelece a relação entre a altura equivalente a um prato 
teórico (H) com a dinâmica do fluxo, as propriedades da FM e da FE. É a chamada 
Relação de Van Deemter. 
 
 
 
 
 
 Nesse caso, o u é a velocidade do gás* de arraste (*a equação foi desenvolvida 
para cromatografia a gás, mas aplica-se perfeitamente à CLAE). 
 A é o alargamento dos picos. O valor de A pode ser diminuído utilizando 
colunas bem empacotadas/recheadas, pequenas e com partículas uniformes e pequenas. 
 B é a difusão molecular do soluto na fase móvel. Quanto maior a difusão, maior 
o alargamento da banda. Uma menor velocidade da FM aumenta o tempo disponível 
para difusão. Portanto, quanto menor a velocidade da FM, maior o tempo do soluto 
dentro da coluna. 
 
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Colunas usadas em CLAE 
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 As colunas são constituídas de um pedaço de tubo de algum material inerte, de 
diâmetro interno uniforme e capaz de resistir às pressões em que será usado. 0 aço 
inoxidável é o mais usado entre todos os materiais. O comprimento varia de 10 a 50 cm. 
 A capacidade da coluna e determinada pelo seu comprimento, diâmetro e 
material de recheio. 
 A pré-coluna é uma coluna pequena com o mesmo recheio ou similar da camada 
porosa usada na coluna. Coloca-se entre o injetor e a bomba ou entre o injetor e a 
coluna. As pré-colunas com esta finalidade geralmente são de 3 - 10 cm de 
comprimento com o mesmo diâmetro interno da própria coluna, para que apresentem as 
mesmas características de separação. 
 Os solventes devem ter um alto grau de pureza para evitar a contaminação da 
coluna. Outro cuidado importante e que os solventes devem ser filtrados, em filtros de 
0.2 μm, para retirar partículas sólidas, que podem riscar o pistão ou a válvula injetora ou 
mesmo entupir os tubos do sistema. 
 A sílica é um composto inorgânico formado por átomos de silício (Si) ligados 
entre si por átomos de oxigênio (ligações siloxano). Por possuir alta dureza, resiste às 
altas pressões exigidas na CLAE. A preparação da sílica vai interferir nas suas 
características. 
 
 Por ser polar, a sílica não é recomenda para FM aquosa. As partículas de sílica 
podem ser esféricas ou irregulares, conforme a figura abaixo: 
 
 
 Existe um processo químico denominado capeamento, que consiste na ligação 
dos grupos silanóis com grupos funcionais, reduzindo a polaridade da sílica. A figura 
abaixo traz um exemplo de uma preparação de uma sílica quimicamente modificada (C-
18). 
 
 
 As colunas em CLAE podem ter seu tempo de vida útil reduzido pela presença 
de espaços vazios (sedimentação ou dissolução da FE), pelo acúmulo de FM ou 
amostra. A presença de um topo vazio causará aumento do Volume Morto e, 
consequentemente, perda de eficiência. Mudanças súbitas de pressão, quedas e choque 
térmico podem causar degradação dessa coluna. 
 A pré-coluna aumenta a vida útil da coluna, ao reduzir impurezas e materiais que 
pudessem causar algum dano ao cromatógrafo. 
 
Cromatografia em Fase Reversa (CFR) 
 Suas colunas são eficientes, estáveis e reprodutivas. Também são resistentes e 
têm maior probabilidade de gerar separação satisfatória. A cromatografia de fase reversa 
traz a FE menos polar que a FM. 
 Por outro lado, compostos muito hidrofóbicos acabam ficando retidos na FE e 
devem necessitar de uso de condições não-aquosas. Compostos hidrofílicos (polares) 
eluem primeiro. 
 A retenção da amostra é ajustada pela forçado solvente, através da preparação 
de um gradiente, ou por sua composição. Em CFR, quanto menor a polaridade, maior é 
a força do solvente. A retenção ainda varia com o tamanho da coluna e a 
hidrofobicidade do grupo da fase ligada – quanto maiores essas propriedades, maior o 
tempo de retenção. 
 
Cromatografia em Fase Normal (CFN) 
 Na CFN, a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, ao contrário da CFR. 
Geralmente a FE é um composto inorgânico e a FM não contém água, mas uma mistura 
de solventes orgânicos. A retenção da amostra aumenta quando a polaridade da fase 
móvel diminui. 
 É indicada quando se quer recuperar quantidades significantes de amostra, 
quando a amostra é dissolvível em solvente apolar, quando a amostra é fortemente 
retida em CFR, quando a amostra se decompõe em solução aquosa etc. 
 Por outro lado, em CFN o número de pratos teóricos é menor e o custo é mais 
elevado. 
 
 
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Fases Móveis utilizadas em CLAE 
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 Álcool, metanol, e todos os compostos que têm viscosidade inferior a um, são 
considerados ótimos quanto à viscosidade e, portanto aumentam a facilidade de 
bombeamento. Os hidrocarbonetos, nesse aspecto, são ótimos mesmo para homólogos 
com 8 ou mais átomos de carbono. Em uma mistura de solventes, a viscosidade 
geralmente não varia linearmente com a composição, mas sim com suas características 
de polaridade ou de possibilidade de formação de pontes de hidrogênio. 
 A viscosidade é uma propriedade que afeta a queda de pressão dentro da coluna 
(a queda de pressão é proporcional à viscosidade), porém, afeta também a sua 
eficiência, pois a fase quanto mais viscosa for, mais afetará o coeficiente de difusão da 
substância analisada, acarretando uma perda considerável na eficiência de separação. 
 Também é importante observar a compatibilidade do solvente com o tipo de 
detector utilizado. Os solventes também devem ser miscíveis entre si, em caso de 
gradiente. 
 O solvente deve ser ultrapuro. Tanto para não prejudicar e entupir a coluna, 
quanto para não gerar ruídos na leitura. No preparo da fase móvel deve-se filtrar o 
solvente (trabalhar com filtro Millipore) e desgaseificá-lo. Deixar o solvente no frasco 
dentro de banho ultrassom por um período de tempo específico de cada solução. 
 Quando se trabalha com solução tampão a atenção deve ser redobrada. Não 
deixar o sistema parado quando se trabalha com tampão, pois pode cristalizar sal na 
região do pistão da bomba. Ao se reiniciar o trabalho, esse sal cristalizado pode 
danificar o corpo do pistão. 
 Para a separação de várias substâncias contidas numa mistura, geralmente não é 
possível escolher uma FM que consiga separar todos os compostos satisfatoriamente. 
Então, para obter um bom cromatograma é preciso aumentar o valor de k para os picos 
que saem primeiro. Para isso, utilizar uma fase móvel mais fraca e diminuir os valores 
de k para as que saem depois, aumentando a força da fase móvel. Portanto, podemos 
lançar mão de um eluição gradiente, de forma binária, isto é, com dois solventes na 
composição. 
 A eluição gradiente é recomendada em casos de k muito grande, ou seja, quando 
a substância tem muita retenção pela coluna. Porém, nem sempre é possível realizar 
uma eluição gradiente, pois é mais complicada e às vezes o cromatógrafo não é capaz de 
realizar a separação desta maneira. Além disso, pode aumentar o tempo da corrida e 
nem sempre os detectores (como o por índice de refração) são capazes de interpretar. 
 
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Tipos de materiais utilizados na Fase Estacionária da CLAE 
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Partículas mais utilizadas na cromatografia de líquidos: 
 
 O tamanho da partícula controla o processo de difusão das moléculas da amostra 
ao penetrar e sair dos poros da partícula. Quanto maior o tamanho da partícula porosa, 
mais lento o processo de difusão e, como conseqüência, mais lenta a transferência de 
massa entre a fase estacionária e a fase móvel. Isto acontece porque, à medida que 
aumenta o tamanho da partícula, aumenta também a profundidade dos poros e 
conseqüentemente a amostra demora mais tempo para sair destes poros profundos. Ao 
mesmo tempo deve-se considerar que um aumento da vazão da fase móvel, para obter-
se análises rápidas, faz com que as moléculas da amostra nesta fase migrem 
rapidamente, em comparação com as da fase estacionária (independente dos poros). Isto 
resulta no alargamento dos picos. Conforme diminui o tamanho da partícula, a 
profundidade dos poros diminui e a saída dos poros acontece mais rapidamente, 
permitindo obter análises rápidas, sem perda na eficiência. 
 Outros tipos de materiais utilizados são partículas esféricas, geralmente vítreas, 
não porosas, recobertas por uma camada muito fina de um adsorvente poroso. Este tipo 
de material e denominado de película de camada porosa, de porosidade superficial ou de 
centro não poroso. 
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Equipamento para CLAE 
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Reservatório 
 Pode ser uma garrafa de solvente bem limpa (não indicada para troca iônica) ou 
frasco de polietileno. Deve ter a tampa perfurada para a passagem do tubo de PTFE, que 
conduzirá a FM até à bomba. As fases móveis polares têm tendência a dissolver 
oxigênio e outros gases. Se esses gases são liberados dentro do equipamento, formam 
bolhas e podem afetar o funcionamento do detector e a eficiência da coluna, além de 
gerar ruídos no cromatograma. Por esse motivo é necessário remover os gases 
dissolvidos na fase móvel. Em muitos equipamentos, o próprio reservatório está 
condicionado a efetuar a remoção, por exemplo, pela aplicação de vácuo no reservatório 
e agitação da fase móvel sob ação de ultra-som e/ou aquecimento. O problema da 
formação de bolhas tem sido reduzido pela adição de um filtro na saída do detector, o 
que restringe um pouco a vazão e produz uma pequena pressão na cela do detector, 
impedindo a formação de bolhas. 
 Também é de extrema importância filtrar a FM antes que ela entre na bomba. Os 
solventes, incluindo a água, devem ser de grau CLAE, isto é, ultrapuros. 
 
Sistema de Bombeamento 
 A função da bomba é transportar a fase móvel através da estacionária, com fluxo 
constante. O interior das bombas não deve ser prejudicado por nenhum solvente. 
 A bomba tem que proporcionar uma vazão razoável através da coluna, para que 
a análise não seja lenta, e uma vazão constante, para não atrapalhar o sistema de 
detecção. Existem 2 tipos de bombas com fluxo constante: reciprocante e tipo seringa. 
 
a) Seringa – Chamadas também de êmbolo ou de deslocamento contínuo. Possuem um 
êmbolo ou pistão que é deslocado de forma contínua e uniforme por um motor de 
precisão, comprimindo o líquido contido em uma câmara de volume constante. O 
líquido flui através de uma abertura na mesma câmara. Vantagem: fluxo constante e 
contínuo, sem pulsos. Desvantagem: reservatório de solvente limitado e alto custo. 
b) Bombas reciprocantes – São as mais utilizadas. Funcionam através do movimento de 
um pistão que empurra a FM, movido por um motor elétrico. Escoam volumes 
constantes de forma não contínua, isto é, pulsante. Operam mediante o movimento de 
um pistão. E através de um sistema de válvulas que alternadamente se abrem e fecham, 
onde se enche e esvazia, de modo alternativo, uma pequena câmara. O selo do pistão é 
um disco de teflon fixo no interiordo corpo da bomba, feito de aço inoxidável 
quimicamente resistente. Existem dois tipos de válvula, Na primeira a esfera funciona 
através da força da gravidade. E na segunda a válvula tem uma mola metálica. A mola 
mantém a válvula fechada até que a pressão desenvolvida pela bomba force a contração 
da mola, possibilitando a passagem do solvente. Além disso, a mola impede que a 
válvula abra em baixas pressões. Vantagens: vazão com volume constante, capacidade 
de alimentação contínua do sistema, facilidade na mudança da fase móvel e o trabalho 
com pequenos volumes. Desvantagens: vazão pulsante e não uniforme e contínua. 
Existem também as bombas com duplo pistão. 
 
Injetores 
 Antes se utilizava uma micro seringa para injetar a amostra. Atualmente 
utilizam-se as válvulas. A alça de amostragem (loop) das válvulas pode ser interna ou 
externa. As alças externas são tubulações de volume preciso que podem ser trocadas. As 
válvulas possuem duas posições: load (amostra injetada e excesso descartado) e inject (a 
válvula se abre e a FM é empurrada na coluna). 
 As válvulas para amostragem são fabricadas somente de material inerte, como 
teflon e aço inoxidável, e seu desenho é tal que resistem a pressões muito elevadas. 
 
 
 
 
Detectores 
 A sua função é monitorar a FM que sai da coluna. A saída do detector é um sinal 
elétrico proporcional a alguma propriedade da fase móvel e/ou do soluto, como a 
capacidade de absorver UV (soluto) ou seu índice de refração (soluto e solvente). 
 Um detector ideal para a CLAE deve ter: alta sensibilidade (relação entre o sinal 
produzido e a quantidade detectada), linearidade (resposta diretamente proporcional à 
concentração do soluto), baixo limite de detecção, resposta rápida a todos os solutos, 
Ball check valves - 
Válvulas de Checagem 
insensibilidade a mudanças na temperatura e na vazão da fase móvel, resposta 
independente da fase móvel, resposta que aumente linearmente com a quantidade do 
soluto, não destruição do soluto, segurança. 
 Os detectores podem ser universais (detectam qualquer modificação na amostra, 
como o IR) ou seletivos, (detectam apenas determinados componentes, como o UV). 
 Existem dois tipos de detectores de luz ultravioleta: o de comprimento de onda 
variável (espectrofotômetros), que é de aplicação mais variada e sensível e também é 
mais caro, e o chamado fotométrico que funciona com um ou dois comprimentos de 
onda fixos. Este último é sensível, econômico e mais que suficiente para se conseguir 
bons resultados com todos os compostos que absorvem luz no comprimento de onda em 
que ele funciona, além de ser insensível a variações de vazão e °C. 
VER A LEI DE BIER 
a) Detectores de Comprimentos de onda fixos: operam em um comprimento de onda de 
254 nm e um de 280 nm, resultado da absorbância de luz em 254 nm e da emissão de 
luz em 280 nm por uma substância fosforescente. Quando se aplica gradiente na fase 
móvel e ela apresenta variação significativa de absorbância para o UV, é necessário 
utilizar a cela de referência para compensar esta variação. 
b) Detectores de Comprimentos de onda variáveis UV-VIS: cobrem a faixa de 190-800 
nm através de monocromador que seleciona o comprimento de onda desejado do feixe 
de luz emitido pelas lâmpadas de deutério (UV) ou tungstênio (VIS). Tem maior 
sensibilidade e seletividade, uma vez que o pesquisador pode escolher o comprimento 
de onda que deseja. Também permite obter o espectro de absorbância de cada 
componente em separado. 
c) Fotodiodos (DAD): Seletivos a determinados comprimentos de onda, permitem 
levantar o espectro da substância durante a eluição. Este detector é denominado detector 
de rede de diodos (diode array detector). Um detector por DAD permite a leitura 
simultânea em diferentes comprimentos de onda durante uma única corrida. Principio: 
após passar por uma amostra, a radiação é dispersada por uma grade fixa e depois desce 
sobre uma rede de diodos. É um método mais rápido que os convencionais, além de 
poder reduzir os ruídos. 
 
 
 
d) Detectores por Índice de Refração (IR): é o 2º mais usado. Este detector acompanha 
continuamente a diferença de índice de refração entre a fase móvel pura e o efluente que 
sai da coluna contendo os componentes da amostra. A resposta deste detector é 
universal (dá resposta a quase todos os componentes da amostra) e sua sensibilidade é 
moderada, geralmente da ordem de micrograma (10
-6
 g). É bem recomendado para 
substâncias que muito pouco absorvem no UV ou visível e para amostras 
desconhecidas. É sensível à temperatura, à vazão e mudanças na composição da fase 
móvel (impedindo o uso de gradiente). 
e) Detectores por Fluorescência: Muito sensível. Específico para substâncias que 
fluorescem. Em boas condições é possível detectar quantidades da ordem de picogramas 
(10
-12
 g), sendo indicada para elementos traços. Precisa de atenção na escolha da FM, 
para que não interfira nos resultados. 
f) Outros: eletroquímicos, por absorbância no infravermelho, de radioatividade, de 
espectrometria de massas etc.