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Autor: Prof. Luiz Carlos Martins das Neves
 Profa. Maria Lúcia A. Nunes Vieira
 Prof. Marco Roberto Marcomini
 Profa. Margarida Szurkalo
 Profa. Regiani Maria Leopoldina Martins Sandrini
Colaboradores: Prof. Juliano Rodrigo Guerreiro
 Prof. José Carlos Morilla
Métodos Instrumentais 
de Análise
Professores conteudistas: Luiz Carlos Martins das Neves / Maria Lúcia A. Nunes Vieira / 
Marco Roberto Marcomini / Margarida Szurkalo / 
Regiani Maria Leopoldina Martins Sandrini
Luiz Carlos Martins das Neves
Graduado (2000) em Engenharia Química 
pelo Centro Universitário da Fundação 
Educacional Inaciana (FEI), possui mestrado 
(2003) e doutorado (2006) na área de Tecnologia 
Bioquímico-farmacêutica pela Faculdade de 
Ciências Farmacêuticas da Universidade de São 
Paulo (FCF-USP) e pós-doutorado (2009) em 
Biotecnologia pela Escola de Engenharia de Lorena 
da Universidade de São Paulo (EEL-USP). É professor 
titular dos cursos presencial e semipresencial 
de Farmácia, Ciências Biológicas, Biomedicina 
e Nutrição da Universidade Paulista (UNIP) e 
professor líder das disciplinas de Matemática 
Aplicada, Bioestatística, Bromatologia, Química 
Geral, Estudos Disciplinares, Físico-química e 
Métodos Instrumentais de Análise.
Maria Lúcia A. Nunes Vieira
Graduada (1987) em Química pelo Instituto 
de Química da Universidade de São Paulo 
(IQ-USP). Professora titular na Universidade 
Paulista (UNIP), leciona nos cursos de Farmácia, 
Biomedicina e Nutrição em São Paulo desde 
2017. Possui mestrado (1994) em Engenharia 
Química – ênfase em Alimentos e doutorado 
(2000) em Engenharia Química – ênfase em 
Corrosão, pela Escola Politécnica da Universidade 
de São Paulo (Poli-USP). Tem mais de 20 anos 
de experiência como docente de nível superior, 
atuando nas disciplinas de Química Geral, Físico-
química, Matemática Aplicada, Bioestatística, 
Métodos Instrumentais de Análise e Bioquímica. 
Professora de pós-graduação em Química 
Tecnológica pelo Centro Universitário Unifieo. 
Marco Roberto Marcomini
Professor do curso de Farmácia da 
Universidade Paulista (UNIP) desde março de 2019, 
tendo ministrado as disciplinas de Biossegurança, 
Matemática Aplicada, Bioestatística, Química 
Geral, Química Analítica, Métodos Instrumentais 
de Análise e Práticas Educativas em Educação. 
Possui bacharelado (1989), licenciatura (1993) e 
mestrado (1994) em Química pela Universidade 
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Unesp). 
Desde 2001 atua como professor de disciplinas 
presenciais e em ensino a distância. 
Margarida Szurkalo
Graduada no curso de Bacharel em Química 
com Atribuição Tecnológica e no curso de 
Licenciatura em Química pela Faculdade 
de Filosofia, Ciências e Letras de São Bernardo 
do Campo (FASB). Possui pós-graduação em 
Formação em EaD pela Universidade Paulista 
(UNIP) e mestrado em Tecnologia Nuclear 
pelo Instituto de Pesquisas Energéticas e 
Nucleares (IPEN) da Universidade de São 
Paulo (USP). Professora adjunta na UNIP nos 
cursos de Farmácia, Biomedicina e Biologia, 
em diversas disciplinas, como: Química Geral, 
Físico-química, Matemática Aplicada, Física 
Aplicada, Bioestatística, Química Orgânica, 
Bioética, Biossegurança, Química Analítica e 
Métodos Instrumentais de Análise. Professora 
no ensino a distância dos cursos de Farmácia e 
Licenciatura em Química.
Regiani Maria Leopoldina Martins 
Sandrini
Graduada (2000) em Engenharia Química 
pelo Centro Universitário da Fundação de Ensino 
Inaciano (FEI), licenciada (2002) em Química 
e especialista (2010) em Didática do Ensino 
Superior pela Faculdade Oswaldo Cruz, possui 
mestrado (2016) em Ciência e Tecnologia Química 
com ênfase em Físico-química pela Universidade 
Federal do ABC (UFABC). É integrante do 
Grupo de Estudos de Superfícies (GESUP), 
com experiência em eletroquímica interfacial 
em monocristais e em análise eletroanalítica. 
Professora nos cursos de Farmácia e Biomedicina 
na Universidade Paulista (UNIP) desde 2013, 
ministra aulas nas disciplinas de Matemática 
Aplicada, Bioestatística, Química Geral, Físico-
química, Química Orgânica e Química Analítica.
© Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma e/ou 
quaisquer meios (eletrônico, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem 
permissão escrita da Universidade Paulista.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
N513m Neves, Luiz Carlos Martins das.
Métodos Instrumentais de Análise / Luiz Carlos Martins das 
Neves... [et al]. – São Paulo: Editora Sol, 2020.
284 p., il.
Nota: este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e 
Pesquisas da UNIP, Série Didática, ISSN 1517-9230.
1. Espectrofotometria. 2. Calibração. 3. Cromatografia. I. Neves, Luiz 
Carlos Martins das. II. Vieira, Maria Lúcia A. Nunes. III. Marcomini, Marco 
Roberto. IV. Szurkalo, Margarida. V. Sandrini, Regiani Maria Leopoldina 
Martins. VI. Título.
CDU 616-082
U508.65 – 20
Prof. Dr. João Carlos Di Genio
Reitor
Prof. Fábio Romeu de Carvalho
Vice-Reitor de Planejamento, Administração e Finanças
Profa. Melânia Dalla Torre
Vice-Reitora de Unidades Universitárias
Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez
Vice-Reitora de Pós-Graduação e Pesquisa
Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez
Vice-Reitora de Graduação
Unip Interativa – EaD
Profa. Elisabete Brihy 
Prof. Marcello Vannini
Prof. Dr. Luiz Felipe Scabar
Prof. Ivan Daliberto Frugoli
 Material Didático – EaD
 Comissão editorial: 
 Dra. Angélica L. Carlini (UNIP)
 Dr. Ivan Dias da Motta (CESUMAR)
 Dra. Kátia Mosorov Alonso (UFMT)
 Apoio:
 Profa. Cláudia Regina Baptista – EaD
 Profa. Deise Alcantara Carreiro – Comissão de Qualificação e Avaliação de Cursos
 Projeto gráfico:
 Prof. Alexandre Ponzetto
 Revisão:
 Elaine Pires
 Jaci de Paula
 Kleber Souza
 Willians Calazans
Sumário
Métodos Instrumentais de Análise
APRESENTAÇÃO ......................................................................................................................................................9
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................................ 10
Unidade I
1 ESPECTROFOTOMETRIA ................................................................................................................................. 11
1.1 História da espectrofotometria ...................................................................................................... 11
1.2 Introdução ............................................................................................................................................... 14
1.3 Fundamentos ......................................................................................................................................... 16
1.3.1 Natureza eletromagnética da luz ..................................................................................................... 16
1.3.2 Radiação eletromagnética .................................................................................................................. 16
1.4 Instrumentação ..................................................................................................................................... 24
1.4.1 Espectrofotômetro ................................................................................................................................. 25
1.4.2 Precauções relacionadas ao manuseio de cubetas ................................................................... 34
1.5 Lei de Lambert-Beer ............................................................................................................................ 34
2 CALIBRAÇÃO E CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS ....... 39
2.1 Métodos de calibração ....................................................................................................................... 39
2.1.1 Limite de detecção .................................................................................................................................40
2.1.2 Sensibilidade ............................................................................................................................................. 40
2.1.3 Seletividade ............................................................................................................................................... 40
2.1.4 Precisão ....................................................................................................................................................... 40
2.1.5 Faixa de concentração .......................................................................................................................... 40
2.2 Calibração por padrão externo ....................................................................................................... 41
2.3 Calibração por padrão interno ........................................................................................................ 41
2.4 Calibração por adição de padrão ................................................................................................... 42
2.5 Sinais, ruído e razão sinal-ruído ..................................................................................................... 42
2.6 Curva analítica ....................................................................................................................................... 42
2.7 Aplicação da espectrofotometria na área farmacêutica e obtenção da curva de 
calibração em métodos espectrofotométricos ................................................................................ 45
3 FLUORIMETRIA ................................................................................................................................................. 47
3.1 Luminescência (fluorescência e fosforescência) ...................................................................... 47
3.2 Processos de desexcitação dos elétrons ...................................................................................... 49
3.3 Fatores que influenciam na fluorescência ................................................................................. 53
3.3.1 Influência da estrutura molecular ................................................................................................... 53
3.3.2 Temperatura .............................................................................................................................................. 55
3.3.3 Solvente ...................................................................................................................................................... 55
3.4 Relação entre fluorescência e concentração das espécies (espectrofluorimetria) ...............56
3.5 Equipamentos para a espectrofluorimetria ............................................................................... 60
3.5.1 Fontes de radiação ................................................................................................................................. 60
3.5.2 Seletores de comprimento de onda ................................................................................................ 61
3.5.3 Filtros e monocromadores de excitação ........................................................................................ 61
3.5.4 Cubetas ....................................................................................................................................................... 61
3.5.5 Monocromadores de emissão ............................................................................................................ 61
3.5.6 Detectores .................................................................................................................................................. 62
3.6 Aplicações da espectrofluorimetria .............................................................................................. 62
3.6.1 Aplicação na área farmacêutica ....................................................................................................... 63
4 ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA ........................................................................................ 64
4.1 Introdução ............................................................................................................................................... 64
4.2 Fundamentos da técnica ................................................................................................................... 64
4.3 Um pouco da história da técnica................................................................................................... 64
4.4 Fundamentos da emissão e da absorção de luz ...................................................................... 66
4.5 Espectrômetro de absorção atômica ............................................................................................ 72
4.5.1 Fonte de radiação ................................................................................................................................... 73
4.5.2 Sistema de atomização ........................................................................................................................ 74
4.5.3 Monocromador ........................................................................................................................................ 77
4.5.4 Detector ...................................................................................................................................................... 78
4.6 Interferências ......................................................................................................................................... 78
4.7 Aplicações da espectrometria de absorção atômica .............................................................. 79
Unidade II
5 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ........................................................................................... 86
5.1 Introdução à cromatografia ............................................................................................................. 86
5.2 Cromatografia em papel .................................................................................................................... 88
5.2.1 Como é feita a cromatografia em papel ....................................................................................... 88
5.2.2 Aplicação na área farmacêutica ....................................................................................................... 92
5.3 Cromatografia em camada delgada ............................................................................................. 93
5.4 Características das fases móvel e estacionária ........................................................................ 93
5.4.1 Fase móvel ................................................................................................................................................. 93
5.4.2 Fase estacionária ..................................................................................................................................... 95
5.5 Instrumentação básica ....................................................................................................................... 95
5.6 Técnica de separação .......................................................................................................................... 96
5.6.1 Preparação da placa............................................................................................................................... 98
5.6.2 Seleção da fase móvel ........................................................................................................................100
5.6.3 Revelação do cromatograma ...........................................................................................................100
5.6.4 Registro do cromatograma ...............................................................................................................102
5.6.5 Análise do cromatograma .................................................................................................................1025.7 Relação entre a estrutura molecular e a separação na cromatografia 
de camada delgada (CCD) ......................................................................................................................102
5.8 Aplicações farmacêuticas ...............................................................................................................105
6 CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) .............................................................................................................107
6.1 Fundamentos .......................................................................................................................................107
6.1.1 Cromatogramas ..................................................................................................................................... 110
6.1.2 Eficiência ..................................................................................................................................................112
6.1.3 Seletividade .............................................................................................................................................113
6.1.4 Resolução .................................................................................................................................................114
6.2 Vantagens e desvantagens da CG ...............................................................................................117
6.3 Instrumentação ...................................................................................................................................117
6.4 Análises qualitativa e quantitativa .............................................................................................140
6.5 Aplicações da CG ................................................................................................................................146
7 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (CL) ..............................................................................................................153
7.1 Definição ................................................................................................................................................153
7.2 Histórico .................................................................................................................................................155
7.3 Cromatografia líquida clássica (CLC) e cromatografia líquida 
de alta eficiência (CLAE) ..........................................................................................................................157
7.4 Comparação entre a CG e a CLAE ................................................................................................159
7.5 Escopo da CLAE ...................................................................................................................................160
7.6 Vantagens e desvantagens da CLAE ...........................................................................................168
7.7 Técnicas de separação por CLAE ..................................................................................................171
7.7.1 Cromatografia líquido-sólido (CLS) ou por adsorção .......................................................... 172
7.7.2 Cromatografia líquido-líquido (CLL) ou por partição com fase líquida ........................ 180
7.7.3 Cromatografia líquida por fase ligada .........................................................................................181
7.7.4 Cromatografia líquida por troca iônica ...................................................................................... 182
7.7.5 Cromatografia líquida por exclusão ............................................................................................. 186
7.8 Características da fase estacionária ...........................................................................................190
7.8.1 Classificação dos tipos de partícula de recheio em colunas para CLAE ........................ 192
7.8.2 Características químicas e seletividade das fases estacionárias 
empregadas em CLAE .................................................................................................................................... 197
7.9 Fase móvel .............................................................................................................................................210
7.9.1 Eluição em modo isocrático .............................................................................................................210
7.9.2 Eluição em modo gradiente ............................................................................................................. 211
7.9.3 Soluções tamponadas ácidas e básicas .......................................................................................213
7.10 Instrumentação ................................................................................................................................215
7.10.1 Desgaseificador ...................................................................................................................................217
7.10.2 Bombas ...................................................................................................................................................218
7.10.3 Injetor ......................................................................................................................................................219
7.10.4 Forno de coluna ..................................................................................................................................221
7.10.5 Pré-coluna ............................................................................................................................................ 222
7.10.6 Detectores ............................................................................................................................................ 223
7.11 A importância do preparo da matriz biológica para o sucesso 
da separação e análise quantitativa por meio da CLAE .............................................................226
7.12 Análise qualitativa e quantitativa da espécie química por meio da CLAE ...............229
7.12.1 Análise qualitativa ............................................................................................................................ 230
7.12.2 Análise quantitativa ..........................................................................................................................231
8 POTENCIOMETRIA..........................................................................................................................................233
8.1 Histórico .................................................................................................................................................233
8.2 Introdução à eletroquímica ............................................................................................................234
8.3 Métodos eletroquímicos de análises ..........................................................................................238
8.4 Tipos de eletrodos ..............................................................................................................................240
8.4.1 Eletrodos de referência .......................................................................................................................241
8.4.2 Eletrodos indicadores ......................................................................................................................... 244
8.5 Eletrodos de íons seletivos .............................................................................................................250
8.6 Cuidados com o eletrodo ................................................................................................................252
8.7 Técnicas potenciométricas .............................................................................................................2528.7.1 pHmetria.................................................................................................................................................. 252
8.7.2 Titulação potenciométrica ............................................................................................................... 255
8.8 Aplicação na área farmacêutica ...................................................................................................259
8.8.1 Análise de alimentos .......................................................................................................................... 259
8.8.2 Titulação potenciométrica de aminoácidos .............................................................................. 259
9
APRESENTAÇÃO
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) define o medicamento como um produto 
farmacêutico, tecnicamente obtido ou elaborado, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para 
fins de diagnóstico. Assim, o medicamento pode ser considerado uma forma farmacêutica terminada 
(comprimido, cápsula, creme, pomada etc.) que contém o fármaco, geralmente em associação com 
adjuvantes farmacotécnicos. Tendo em vista a importância que o medicamento apresentará na terapia, 
levando ao controle de enfermidades ou mesmo à cura de muitos pacientes, se faz necessário estabelecer 
um efetivo controle sobre sua qualidade.
O controle de qualidade dos medicamentos, por sua vez, exigirá a identificação e quantificação 
das substâncias químicas presentes nessa forma farmacêutica, sendo necessária a realização 
de análises químicas e físicas. Atualmente, boa parte das análises químicas realizadas em 
medicamentos e insumos ligados ao setor farmacêutico se constitui de métodos instrumentais, 
em que equipamentos de elevada precisão e robustez serão capazes de identificar e quantificar os 
componentes de interesse na forma farmacêutica ou no insumo empregado para a produção do 
medicamento. Além disso, os métodos instrumentais serão capazes de identificar e quantificar as 
eventuais impurezas presentes no medicamento.
Esta disciplina tem o objetivo de apresentar os conceitos teóricos relacionados às principais 
análises instrumentais empregadas em procedimentos de identificação e quantificação de substâncias 
químicas. Para tanto, este livro-texto subdivide os métodos instrumentais em duas partes: os 
espectrométricos, baseados na interação das espécies químicas com a energia; e os cromatográficos 
e potenciométricos, baseados em outras características físico-químicas, a citar, o potencial químico e 
interações promovidas pelas moléculas e íons.
Os métodos instrumentais de análise tornaram-se um dos principais meios de obtenção de informações 
em diversas áreas da ciência e tecnologia. Fatores como a velocidade e alta sensibilidade para aquisição 
de dados, baixos limites de detecção, automação de instrumentos etc., quando comparados aos métodos 
clássicos de análise, justificam o interesse dos profissionais em diversas áreas, no emprego das técnicas 
instrumentais. Dessa forma, os profissionais e estudantes devem ter em sua formação a compreensão 
dos princípios fundamentais das diferentes técnicas, conhecimento dos instrumentos e suas aplicações.
Em especial, entre as competências desejadas estão a capacidade de resolver problemas em uma 
abordagem analítica e o domínio das principais técnicas instrumentais, como espectrofotometria, 
espectrofluorimetria, absorção atômica, técnicas cromatográficas e potenciometria.
Nas situações em que os exercícios envolvam cálculos numéricos, estes serão discutidos passo a 
passo, de modo que a matemática seja utilizada como ferramenta de aprendizagem.
Embora as técnicas sejam abordadas separadamente, para que o aluno tenha uma melhor 
compreensão, tanto no que diz respeito ao princípio teórico de cada técnica quanto aos equipamentos 
necessários e os cálculos envolvidos, não é incomum a utilização das técnicas de forma complementar, 
uma à outra, em muitas metodologias analíticas.
10
Ao término deste livro-texto, o aluno deverá ser capaz de compreender e diferenciar as principais 
técnicas instrumentais, reconhecer e utilizar com segurança os instrumentos adequados às técnicas, 
construir e analisar diferentes tipos de gráficos, como: curvas analíticas, cromatogramas e curvas de 
titulações, além de efetuar e compreender os cálculos analíticos pertinentes a cada método.
Sempre que houver necessidade, sinta-se à vontade para recorrer aos tópicos do livro-texto, para 
rever os conceitos e, dessa forma, poder aplicá-los em situações-problema em diversas disciplinas.
Boa leitura!
INTRODUÇÃO
Os métodos instrumentais de análise se constituem em técnicas analíticas capazes de separar, 
identificar e quantificar espécies químicas que possam estar presentes em uma amostra de interesse. 
Neste livro-texto, são apresentados os principais métodos espectrométricos, potenciométricos e 
cromatográficos empregados.
A luz pode ser definida como uma radiação não ionizante, ou seja, se trata da propagação de energia 
em quantidade inferior à necessária para provocar a quebra das ligações entre as espécies químicas. 
Além disso, a luz apresenta característica de dualidade onda-partícula, pois apresenta propriedades 
encontradas em ondas eletromagnéticas e em partículas. A partícula relacionada à luz é chamada de 
fóton e pode ser caracterizada como uma partícula de massa de repouso nula e com carga elétrica 
também nula. Métodos instrumentais que permitem a identificação e quantificação a partir da interação 
com a luz são chamados de espectrométricos.
As técnicas espectrométricas que serão discutidas são as seguintes: espectrofotometria, calibração 
de métodos instrumentais; espectrofluorimetria e absorção atômica. Para os três métodos instrumentais 
classificados como espectrométricos (espectrofotometria, espectrofluorimetria e espectrometria 
de absorção atômica) serão apresentados os aspectos históricos e a fundamentação teórica relativa 
às técnicas. Também serão apresentados os conceitos relativos às propriedades da luz e do espectro 
eletromagnético e sua influência na identificação e quantificação das espécies químicas.
Após uma profunda discussão sobre a Lei de Lambert-Beer, serão apresentados o conceito de curva 
de calibração, bem como informações para sua elaboração utilizando ferramentas computacionais. Na 
sequência, serão discutidos o fundamento da transição eletrônica na fluorescência molecular e como 
a fluorescência pode ser utilizada para fins analíticos. São apresentadas as relações entre a estrutura 
molecular e os fatores que influenciam no processo de fluorescência. Além disso, são abordados os 
temas relacionados à atomização de átomos com os chamados processos de excitação dos elétrons, 
avaliando os fatores que influem na excitação e liberação de energia por elementos no estado gasoso.
Para cada método espectrométrico, serão apresentados exemplos de situações-problema, com o 
uso da técnica em estudo, e os cálculos envolvidos são apresentados de forma a favorecer o entendimento 
da resolução dos exercícios.
11
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
Unidade I
1 ESPECTROFOTOMETRIA
Vamos estudar as propriedades da espectrofotometria e os temas relacionados à absorção de 
energia e a aplicação da Lei de Lambert-Beer, que permite estabelecer uma relação proporcional entre 
a energia absorvida e a concentração de uma espécie química presente em uma amostra. Discutiremos, 
também, os fatores que interferem na análise por espectrofotometria de absorção molecular, as partes 
do equipamento para determinar a concentração das espécies em solução (espectrofotômetro) e a 
aplicação dessa técnica.
1.1 História da espectrofotometria
A história da espectrofotometria tem seu início a partir das descobertas realizadas pelo cientista 
inglês Isaac Newton (1643-1727). Foi ele o responsável por descrever, pela primeira vez, o fenômeno da 
decomposição da luz ao realizar experimentos com um prisma. Além disso, realizouexperimentos em que 
provou a possibilidade de recompor a luz branca inicial diante do posicionamento de um segundo prisma.
 Observação
Em óptica, prisma é definido como uma estrutura de superfícies retas 
e polidas capaz de refratar a luz. Geralmente, é encontrado sob a forma 
triangular do equilátero (lados triangulares e base quadrangular).
A refração da luz ocorre por conta da mudança de velocidade ao ocorrer sua transposição para meios 
diferentes. Ao se usar um prisma dispersivo, ocorrerá, então, a separação das luzes de comprimento de 
onda (λ) diferentes, sendo que a chamada luz branca será considerada a somatória de todas as luzes, 
com comprimentos de onda diferentes, encontrados na natureza.
A figura a seguir apresenta um esquema de onda eletromagnética como o que será observado nos 
diferentes tipos de luzes encontrados na natureza.
Z1
t1
Z2
t2
Z
E
E
Figura 1 – Exemplo de onda eletromagnética onde t1 e t2 serão dois intervalos de tempo 
diferentes resultando em duas cristas (z1 e z2) e gerando um campo elétrico (E)
12
Unidade I
Isaac Newton concluiu, no ano de 1665, que os raios luminosos podem ser refratados em ângulos 
ligeiramente diferentes, cada um produzindo uma cor espectral diferente. Após a descoberta de Isaac 
Newton ocorreu um grande impulso nas pesquisas relacionadas à espectroscopia óptica.
As principais descobertas surgidas após as experiências de dispersão da luz realizadas por Isaac 
Newton estão descritas no quadro a seguir.
Quadro 1 – Autores e obras em óptica
Ano Autor Pesquisa
1665 I. Newton Experiências de dispersão da luz (prisma)
1729-1760 Bouguer Graduação da luz (fotometria)
1752 Th. Melvill Estudo da chama de sódio. Espectro de emissão
1777 Scheele Reações químicas e espectro de radiação
1800 W. Herschel Descoberta da região espectral do infravermelho (IR)
1801 J. W. Ritter Da radiação ultravioleta (no AgCl)
1802 Th. Young Fenômeno de interferência. Cálculo dos valores de λ das cores reconhecidas por Newton
1802 W. Wollaston Estudos da difração da luz (fenda)
1811 Arago Fenômeno da polarização rotatória
1814 J. Fraunhofer Observação de espectros de estrelas
1822 J. Herschel Espectro visível de chamas
1834 Talbot Identificação dos corpos mediante seus espectros
1836 J. Herschel Dispositivo para medir brilhos estrelares
1842 C. Doppler e
Fizeau
λ para uma fonte em movimento
1848
1849 Foucault Absorção ressonante num meio emissor
1853 A. Beer Relação entre absorção da luz e a concentração do meio
1856 Meyerstein Primeiro espectroscópio moderno de prismas
1859 G. R. Kirchhoff Proposta da teoria de absorção e emissão da luz
1861 G. R. Kirchhoff e R. Bunsen Espectros de metais alcalinos
1861 W. Crookes Identificação do tálio (linha espectral de cor verde)
1861 P. J. C. Janssen Observação da linha amarela do espectro solar que N. Lockyer e E. Frankland atribuíram ao hélio
1862 G. G. Stokes Transparência do quartzo no ultravioleta (UV)
1863 Mascart Absorção da radiação UV na atmosfera em 295 nm
1864 W. Huggins e W. Miller Espectro de uma nebulosa
1868 Huggins Medida do desvio para o vermelho da estrela Sirius
1868 Janssen e Lockyer Descoberta da linha do hélio no espectro solar
Adaptado de: Donoso (s.d.).
13
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
Entre as principais pesquisas ocorridas entre os séculos XVII e XIX, podemos destacar os experimentos 
relacionados à graduação da luz realizados por Pierre Bouguer e que promoveram o início das leis 
empíricas que regem a fotometria.
As cores reconhecidas por Isaac Newton tiveram seu comprimento de onda (λ) calculado em 1802 
pelo físico Th. Young. No mesmo ano, esse cientista também estabeleceu os princípios da interferência 
relacionados à óptica.
As bases para a construção dos espectroscópicos foram estabelecidas pelo óptico alemão Joseph 
von Fraunhofer. Entre as principais contribuições de Fraunhofer, temos o desenvolvimento de uma 
rede de difração em 1821. A partir da rede de difração desenvolvida por ele, foi possível realizar a 
medição de comprimentos de onda de cores específicas e das linhas escuras do espectro solar. No 
ano de 1959, foi descoberto que as linhas escuras no espectro solar descobertas por Fraunhofer eram 
linhas de absorção atômica.
O espectroscópio é o instrumento utilizado para fazer análises espectrográficas e observar os 
diferentes espectros de radiação. Trata-se de uma invenção dos cientistas Robert Bunsen e Gustav 
Kirchhoff. Podemos considerar o espectroscópio um equipamento semelhante a um espectrógrafo, 
ou seja, será capaz de promover a dispersão da luz de um objeto em seus diferentes comprimentos 
de onda.
A partir da invenção do espectroscópio, vários elementos foram descobertos, como descrito no 
quadro a seguir.
Quadro 2 – Elementos descobertos por meio do espectroscópio
Elemento Ano da descoberta Pesquisador
Césio 1859 Kirchhoff e Bunsen
Rubídio 1861 William Crookes
Índio 1863 Ferdinand Reich
Hélio 1868 Sir Norman Lockyer
Hólmio 1878 Cleve
Rubídio 1861 William Crookes
Praseodímio e neodímio 1882 Baron von Welsbach
Adaptado de: Conselho Regional de Química (2011).
A partir dos avanços relacionados à espectroscopia, foi possível estabelecer a relação entre a energia 
absorvida e a concentração de uma espécie química presente em amostras analíticas e, portanto, se 
possibilitou o desenvolvimento das análises espectrofotométricas.
14
Unidade I
1.2 Introdução
Espectroscopia é a designação para toda técnica de levantamento de dados físico-químicos através 
da transmissão, absorção ou reflexão da energia radiante incidente em uma amostra.
A medida da intensidade de uma radiação é possível através de dispositivos eletrônicos, como os 
transdutores fotoelétricos, presentes em espectrômetros. Os espectrômetros podem ser considerados 
equipamentos ópticos que apresentam redes de difração e captadores e poderão medir as propriedades 
da luz dentro de uma faixa eletromagnética.
A absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração de espécies 
químicas presentes em solução. Tal determinação é possível através de uma técnica instrumental 
bastante empregada no setor farmacêutico, a espectrofotometria.
A maioria dos métodos espectrométricos, utilizados em diversas áreas, envolve a identificação 
ou quantificação de compostos com presença de grupos químicos cromóforos obtidos pela 
reação entre o composto a ser analisado e o reagente (reagente cromogênico), originando um 
produto colorido.
 Observação
Grupos cromóforos são grupos químicos (ex.: pirrol) que se apresentam 
como complexos metálicos ou como grupos contendo elétrons π (pi) 
conjugados. Podem ser definidos como grupos químicos que contêm muitos 
elétrons e que serão responsáveis pela absorção de energia ou luz visível. 
Tais grupos, diante de um fenômeno de excitação, serão capazes de emitir 
diversas radiações de comprimento de onda diferentes (cores diferentes) 
diante da alteração do nível energético, ao saírem do estado de excitação 
para o estado fundamental dos elétrons de valência.
A mudança de cor se dará em função da absorção, transmissão ou reflexão de certas radiações que 
sejam componentes da luz visível. Os métodos espectrofotométricos que se baseiam nesse princípio são 
denominados métodos colorimétricos e poderão ser relacionados, portanto, à capacidade de alguns 
compostos coloridos absorverem luz visível (região visível do espectro eletromagnético).
A espectrofotometria pode ser considerada a técnica capaz de medir a absorção ou transmissão 
de luz. Trata-se de uma das mais valiosas técnicas analíticas, amplamente utilizada em laboratórios de 
diversas áreas, em que componentes desconhecidos de uma solução podem ser identificados por seus 
espectros ultravioleta ou visíveis.
O princípio que rege o método espectrofotométrico se baseia na determinação da concentração 
das espécies químicas presentes nas amostras analíticas a partir do uso de radiação. De acordo com o 
15
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
princípioda espectrofotometria, quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com 
moléculas absorventes, parte da luz é absorvida pela solução, e o restante é transmitido onde interações 
moleculares são provocadas devido à interação entre os fótons presentes e a amostra.
A absorção de luz dependerá, basicamente, da concentração das moléculas absorventes e do 
caminho óptico.
O caminho óptico pode ser definido como a distância percorrida pela radiação no interior da célula 
ou recipiente onde estará acondicionada a amostra. A esse recipiente dá-se o nome de cubeta, fabricado 
em diferentes materiais, e que poderá ser, em alguns casos, substituído por tubos circulares, semelhantes 
a tubos de ensaio, de material apropriado (caso exista o encaixe adequado no interior do equipamento).
 Observação
A cubeta é um pequeno tubo circular ou quadrado selado em uma das 
extremidades. Poderá ser encontrada em três materiais diferentes (quartzo, 
vidro ou plástico) e sua utilização garante menor interferência sobre o 
caminho óptico durante a realização de análises espectrofotométricas. 
Essa menor interferência se dará por conta do método de fabricação e do 
mínimo teor de impurezas e sujidades presentes no tubo.
Lâmpada
Monocromador
Cubeta
Detector
Figura 2 – Ilustração de um aparelho espectrofotômetro contendo a célula 
onde será acondicionada a cubeta entre o monocromador e o detector
A figura anterior apresenta um esquema do espectrofotômetro em que é possível observar que 
a absorção de energia será quantificada a partir da passagem de uma luz monocromática (espectro 
ultravioleta ou visível) através da cubeta contendo a amostra analítica a ser identificada ou quantificada. 
Mantendo-se a mesma cubeta e, com isso, o mesmo caminho óptico, ter-se-á apenas a concentração da 
espécie química como variável em uma análise espectrofotométrica.
Em situações em que se mantenha a espécie química em duas soluções de concentrações diferentes, 
será possível concluir que a solução que apresente maior absorção de luz monocromática será a de 
maior concentração.
16
Unidade I
Inúmeras vantagens contribuem para a popularidade da espectrofotometria, entre elas está o fato 
de ser uma técnica espectroscópica quantitativa (permite determinar a concentração da espécie 
química de interesse), tem baixo custo operacional (apenas o custo do equipamento e cubetas), é de 
fácil utilização e produz resultados de interpretação geralmente bastante simples (pode ser estabelecida 
uma equação de reta relacionando a energia transmitida através da espécie química com a concentração 
dessa espécie química presente no interior da cubeta).
A espectroscopia de absorção ultravioleta e visível (UV-VIS) apresenta também limitações que são 
intrínsecas à sua qualidade quantitativa. Em geral, as limitações estarão relacionadas a potenciais perdas 
por reflexão ou absorção de energia pela espécie química e estarão inseridas no erro instrumental 
vinculado ao método.
 Lembrete
A espectrofotometria é utilizada para identificar e quantificar 
substâncias químicas a partir da medição da absorção e transmissão de luz 
(radiação eletromagnética) que passa através da amostra. Cada substância 
reflete e absorve a luz de forma diferente.
1.3 Fundamentos
1.3.1 Natureza eletromagnética da luz
A ligação entre luz, eletricidade e magnetismo foi sendo entendida ao longo do tempo através 
de sucessivas descobertas. O estudo do comportamento da luz e dos fenômenos ondulatórios é um 
estudo da óptica. A luz visível é, apenas, uma pequena parte do espectro eletromagnético. As ondas 
eletromagnéticas são constituídas de campos elétricos e campos magnéticos.
1.3.2 Radiação eletromagnética
Quase toda a troca de energia entre a Terra e o Universo ocorre por radiação. Essa troca de energia 
só é possível por conta da aceleração de partículas carregadas que serão capazes de percorrer longas 
distâncias, inclusive no vácuo.
Pode-se caracterizar uma radiação eletromagnética como uma onda que apresenta um vale (ponto 
mais baixo) e uma crista (ponto mais alto). Para uma radiação eletromagnética poder-se-ão estabelecer 
três parâmetros físicos: amplitude (A), frequência (F) e comprimento de onda (λ).
Os parâmetros físicos da radiação eletromagnética permitem que sejam definidas suas características, 
a citar, brilho, energia associada e espectro de radiação onde ela estará inserida.
A amplitude (A) pode ser definida como distância vertical entre a extremidade de uma crista e o eixo 
central da onda eletromagnética. A intensidade ou brilho associado a uma radiação eletromagnética 
17
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
estará associada à sua amplitude e, dessa forma, quanto maior o valor da amplitude, maior será a 
intensidade da onda eletromagnética.
O comprimento de onda (λ) de uma radiação eletromagnética pode ser definido como a distância 
horizontal entre dois vales ou duas cristas consecutivas. A medida do comprimento de onda (λ) para 
radiações relacionadas aos espectros ultravioleta e visível é dada em nanômetros (nm).
 Observação
1 nm = 1 × 10-9 m
A grandeza conhecida como frequência (F) da onda eletromagnética diz respeito ao número de 
comprimentos de onda completos que passam por um determinado ponto no espaço a cada segundo, 
e isso decorre do fato de a onda se propagar a uma velocidade constante.
A figura a seguir apresenta os três parâmetros físicos que caracterizam uma onda eletromagnética.
λ : Comprimento
A : Amplitude
F : Frequência
F = 2Hz
tempo (s)1
A
λ
Figura 3 – Características de uma onda
 Observação
Amplitude (A) é o comprimento do vetor campo elétrico no ponto 
máximo da onda.
Frequência (F) é o número de oscilações completas que a onda faz a 
cada segundo (ciclos por segundo). Uma oscilação por segundo também é 
chamada de hertz (Hz), que pode ser entendida como o inverso do período 
e ser expressa por s-1.
Comprimento de onda (λ) é a distância linear entre quaisquer dois 
pontos equivalentes sobre duas ondas sucessivas. A unidade é expressa em 
nanômetros (nm).
18
Unidade I
A radiação é constituída de partículas portadoras de energia chamadas de fótons. Portanto, é possível 
imaginar uma radiação presente no feixe de luz como um conjunto de fótons sendo transmitidos no 
meio. Cada fóton possui uma energia (E) característica que está relacionada à frequência da radiação 
pelas equações a seguir.
E h F= ×
Em que:
• E = energia (expressa em joules, J);
• h = constante de Planck (expressa em joule-segundo, J.s);
• F = frequência (expressa em hertz, Hz).
 Observação
A constante de Planck (h) é igual a 6,624 × 10-27 J.s.
A equação anterior define a energia (E) de um fóton como diretamente proporcional à frequência (F), 
portanto diante de uma radiação de maior frequência ter-se-á maior energia (E) para o fóton.
A energia (E) de uma radiação eletromagnética também poderá ser relacionada com o comprimento 
de onda (λ), conforme expresso pela equação a seguir.
h c
E
×=
l
Em que:
• h = constante de Planck (expressa em joule-segundo, J.s);
• c = velocidade da luz no vácuo (expressa em quilômetros por segundo, km s-1);
• λ = comprimento de onda (letra grega lambda e expressa em nanômetros, nm).
 Observação
A velocidade da luz no vácuo (c) é igual a 300.000 km s-1.
19
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
A equação anterior define a energia (E) de um fóton como inversamente proporcional ao comprimento 
de onda (λ), portanto diante de uma radiação de maior comprimento de onda (λ) ter-se-á menor 
energia (E) para o fóton.
A união de todas as radiações existentes na natureza forma o chamado espectro eletromagnético 
e este será formado por sete intervalos com características específicas que irão representar diferentes 
aplicações para a sociedade.
As sete subdivisões do espectro eletromagnético são:
• Ondas de rádio: formada pelas ondas longas, banda padrão (relacionada às ondas em modulação 
por amplitude, AM), ondas curtas e as ondas eletromagnéticas relacionadas à televisão e à 
modulaçãopor frequência (FM). São radiações eletromagnéticas superiores ao comprimento de 
onda das micro-ondas.
• Micro-ondas: ondas eletromagnéticas entre 1 m e 1 × 10-3 m.
• Infravermelho: ondas eletromagnéticas entre 700 nm e 1 × 10-3 m.
• Visível: ondas eletromagnéticas entre 750 nm e 400 nm.
• Ultravioleta: ondas eletromagnéticas entre 400 nm e 100 nm.
• Raios X: ondas eletromagnéticas entre 100 nm e 0,01 nm.
• Raios gama: ondas eletromagnéticas inferiores a 0,01 nm.
A figura a seguir apresenta as diferentes radiações eletromagnéticas classificadas em seus subtipos 
e indicadas a partir de seus limites de comprimento de onda (λ) característicos.
Rádio de ondas longas Micro-ondas Infravermelho
Te
le
vi
sã
o,
 rá
di
o 
FM
Rá
di
o 
de
 o
nd
as
 c
ur
ta
s
Ba
nd
a 
pa
dr
ão
 d
e 
rá
di
o 
AM
Ul
tra
vi
ol
et
a
0.
7 
Ve
rm
el
ho
0.
6 
La
ra
nj
a
Az
ul
Am
ar
el
o
0.
5 
Ve
rd
e
0.
4 
Vi
ol
et
a
Raios X
Comprimento de onda (m)
10-1210-1110-1010-910-810-710-610-510-410-310-210-1110102103104105
Visível
Raios gama
Figura 4 – Espectro eletromagnético
20
Unidade I
A radiação das ondas eletromagnéticas apresentadas na figura anterior pode ser classificada em 
duas categorias: radiação ionizante e não ionizante.
A classificação das ondas eletromagnéticas como ionizante ou não ionizante pode ser dada a 
partir do valor de frequência (F) determinado para a radiação analisada. Portanto, situações em que as 
frequências sejam superiores à da luz visível são classificadas como ionizantes.
As radiações ionizantes apresentam uma quantidade de energia suficiente para promover a ruptura 
das ligações químicas e, dessa forma, a ionização das espécies químicas.
A figura a seguir apresenta o espectro de radiações eletromagnéticas com destaque para a faixa de 
radiações visíveis (400 nm a 700 nm).
1012 1010 108 106 104 102 100 ν (Hz)1024 1022 1020 1018 1016 1014
10-16 10-14 10-12 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 100 102 104 106 108 λ (m)
Aumento do comprimento de onda (λ) →
← Aumento da frequência (ν)
Raios γ Raios X UV IV Micro-ondas Ondas de rádio longas
Ondas de rádio
FM AM
Espectro visível
Aumento do comprimento de onda (λ) em nm →
600 700500400
Figura 5 – Espectro eletromagnético
Ao observarmos a figura anterior, é possível definir que as chamadas radiações ionizantes serão as 
ultravioletas, os raios X e os raios gama (γ).
 Observação
O espectro visível é o conjunto de cores obtidas pela passagem da luz 
branca através de um prisma e varia do vermelho ao violeta.
O espectro solar apresenta radiações invisíveis ao olho humano, portanto as radiações encontradas 
poderão ser desde os raios gama até as ondas de rádio. Com isso, no espectro solar estarão incluídas as 
radiações ultravioletas e infravermelhas.
21
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
A maioria das análises espectroscópicas utilizam comprimentos de onda dentro de um grupo estreito 
de radiações eletromagnéticas. Cada grupo estreito de radiações é chamado de banda e terá sua largura 
relacionada, diretamente, à sensibilidade e seletividade da análise espectrofotométrica.
 Observação
Métodos espectrofotométricos deverão apresentar boa sensibilidade 
e especificidade. A sensibilidade de um método pode ser definida como 
a eficiência em determinar corretamente uma espécie química. Por outro 
lado, a especificidade ou seletividade pode ser definida como a capacidade 
de o método identificar e quantificar a espécie química mesmo na presença de 
outras espécies químicas (interferentes) na amostra analítica.
Ao se empregar uma banda estreita para a realização do procedimento analítico, o método 
instrumental conseguirá aumentar sua sensibilidade e seletividade (especificidade) e, portanto, deverá 
sempre ser o foco durante a escolha e validação do método espectrofotométrico.
Para que se obtenha uma relação linear (diretamente proporcional) entre o sinal elétrico detectado 
no equipamento (espectrofotômetro) e a concentração da espécie química de interesse presente na 
amostra analítica, é necessário que se busque uma banda estreita de radiação monocromática e que 
poderá ser definida como a radiação eletromagnética em que a espécie química de interesse apresentou 
a máxima absorção de energia.
Na espectrofotometria, a máxima absorção de energia ocorrerá diante de uma fenda de saída que 
resultará em um sinal elétrico correspondente a um pico característico durante a chamada varredura de 
todas as radiações eletromagnéticas dentro da faixa ultravioleta e visível.
A varredura ocorrerá a partir da programação do equipamento para que este permita que o 
monocromador selecione e permita a passagem de radiação eletromagnética dentro de uma banda 
específica e com comprimento de onda (λ) fixo.
A banda selecionada apresentará uma largura de banda efetiva entre 1 nm e 20 nm.
A figura a seguir apresenta um exemplo clássico de varredura do comprimento de onda (λ) 
característico para moléculas de riboflavina.
22
Unidade I
3.509
3.000
2.000
1.000
Ab
s.
0.000
-0.975
200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 650.00
nm.
Figura 6 – Espectro de absorção da riboflavina
Através do espectro de absorção visualizado pela figura anterior, é possível verificar que a 
molécula de riboflavina apresentará seu pico de absorção de energia ao se empregar comprimento 
de onda (λ) em 266 nm, dado este que pode ser comprovado com informações da Farmacopeia 
brasileira (ANVISA, 2019).
A escolha do comprimento de onda correspondente ao máximo de absorção de energia realizado 
pela espécie química que garantirá que não ocorram desvios instrumentais relacionados à Lei de 
Lambert-Beer e, portanto, a linearidade entre a absorção de energia e a concentração da espécie 
química. O pico de absorção de energia garantirá uma absortividade molar (ε) constante para a 
espécie química.
Segundo Skoog et al. (2006), a absortividade molar (ε) pode ser definida como a capacidade 
que um mol de substância terá em atenuar luz incidida em um dado comprimento de onda (λ). 
Portanto, a absortividade molar corresponderá à capacidade máxima de absorção de energia por 
uma espécie química.
 Observação
Banda efetiva é a largura da banda da radiação transmitida em unidades 
de comprimento de onda em torno da meia altura.
É possível obter comprimentos de onda que sejam específicos para certas substâncias através da 
construção de uma curva de absorção espectral (varredura). Para tanto, a substância em questão (aquela 
que se quer determinar) é colocada na cubeta (porta amostra), e os comprimentos de onda vão sendo 
passados, e a absorção de cada faixa é medida. O comprimento de onda a ser ajustado no aparelho será 
aquele em que tiver ocorrido a maior absorbância, pois em essência se trata do pico de absorção de 
energia pela molécula.
23
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
Exemplo de aplicação
Um analista efetuou uma análise de varredura de comprimento de onda (λ) visando definir a radiação 
a ser ajustada em um espectrofotômetro. Para tanto, ele preparou um padrão de 0,50 mg mL-1 e analisou 
para a faixa visível o comportamento do analito obtendo os dados a seguir:
Tabela 1
λ/nm A
400 0,121
420 0,234
460 0,258
500 0,358
540 0,218
580 0,600
620 0,440
680 0,330
720 0,360
800 0,123
Resolução
O valor é de 580 nm do comprimento de onda, pois é o maior valor de absorbância lido, 0,600.
A seleção do comprimento de onda (λ) que caracteriza uma radiação eletromagnética a ser 
empregada na análise espectrofotométrica se dá através do chamado monocromador. Este será um 
componente do equipamento formado por:
• Lentes e espelhos: irão focalizar a radiação.
• Fendas de entrada e saída: irão restringir a passagem de radiações não selecionadas para a 
realização do procedimento analítico.
• Elementos de resolução: irão separar o comprimento de onda de interesse e poderão ser filtros, 
prismas ou redes (grades) de difração.
O monocromador consiste, em geral, em uma fenda estreita através da qual a luz entra para promover 
a separação da luzem seus vários comprimentos de onda (λ) e em outra fenda estreita por onde se 
permite que a radiação selecionada saia e, em sequência, entre em contato com a amostra analítica 
(acondicionada no interior da cubeta) e com o detector (responsável por identificar a energia radiante 
restante após a passagem pela amostra analítica).
24
Unidade I
Os prismas usados na faixa visível são feitos de vidro e a diferença no índice refrativo do vidro em 
função do comprimento de onda criará a separação da luz em suas várias cores.
A figura a seguir apresenta um esquema de separação dos comprimentos de onda (λ) por meio de 
monocromadores utilizando um prisma ou uma grade de reflexão.
Luz 
incidente
Luz 
incidente
Prisma λ1
λ1
λ2
λ2
Grade de reflexão
Figura 7 – Uso de um prisma ou de uma grade de reflexão para promover 
a separação da luz em seus vários comprimentos de onda (λ)
De acordo com Hage e Carr (2012), existem dois tipos de grades que serão empregados como 
monocromadores:
• Grade de transmissão: produz a difração ao permitir que a luz atravesse uma grade formada 
por pequenas fendas e que irão criar interferência construtiva e destrutiva da luz. Diferentes 
comprimentos de onda (λ) apresentam diferentes ângulos onde irão produzir interferência 
construtiva e tal fato permitirá a seleção do comprimento de onda para a realização do 
procedimento analítico.
• Grade de reflexão: neste tipo de monocromador, é usada uma superfície polida e reflexiva que 
tem uma série de degraus paralelos e espaçados cortados em sua superfície. Quando um feixe 
de luz é refletido em sua superfície, novamente, se criam padrões de interferência construtivos e 
destrutivos que permitirão a seleção do comprimento de onda desejado.
1.4 Instrumentação
Espectrômetros ou espectroscópios são equipamentos destinados à análise de radiação. Existem 
espectrômetros para diferentes faixas do espectro de radiação eletromagnética e que podem ser 
classificados como:
• espectrômetro ou espectrofotômetro UV-visível (ou apenas visível);
• espectrômetro de infravermelho;
• espectrômetro de fluorescência ou espectrofluorímetros.
25
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
De modo geral, os espectrômetros são formados pelos seguintes componentes:
• fonte de energia radiante;
• sistema colimador;
• local destinado à amostra;
• sistema monocromador;
• sistema detector.
Além desses componentes, são necessários um processador e um monitor para a apresentação 
dos resultados.
1.4.1 Espectrofotômetro
O espectrofotômetro é um equipamento amplamente utilizado em laboratórios, sua função é a de 
medir e comparar a quantidade de luz (energia radiante) absorvida por uma determinada solução. Ou 
seja, ele é usado para medir (identificar e determinar) a concentração de substâncias, que absorvem 
energia radiante, em um solvente.
O espectrofotômetro demonstra de maneira quantitativa o quanto uma solução está mais 
concentrada que outra por meio de sua interação com a luz.
Io It
Fonte de luz Monocromador Cubeta Detector
Figura 8 – Esquema de um espectrofotômetro
Como observado pela figura anterior, um espectrofotômetro será formado por quatro 
componentes principais:
• fonte de luz (lâmpada);
• monocromador;
• cubeta;
• detector.
As fontes de luz empregadas no interior dos espectrofotômetros poderão ser lâmpadas de tungstênio 
ou de deutério. As lâmpadas de tungstênio serão as fontes de luz mais empregadas para determinações 
26
Unidade I
analíticas cujo comprimento de onda (λ) esteja na faixa visível do espectro eletromagnético. Por 
outro lado, as lâmpadas de deutério serão as fontes de luz empregadas para determinações analíticas 
relacionadas a comprimentos de onda (λ) dentro do espectro ultravioleta.
A figura a seguir apresenta uma imagem ilustrativa de uma lâmpada de tungstênio utilizada como 
fonte de luz no interior de espectrofotômetros.
Contato 
elétrico
Filamento de 
tungstênio
Suporte 
externo
Contato 
elétrico
Figura 9 – Concepção geral de uma lâmpada de tungstênio empregada 
como fonte luminosa no interior de espectrofotômetros
As lâmpadas de tungstênio ou deutério serão empregadas para a produção de um feixe de luz 
contínuo que será direcionado para o monocromador. Ao atravessar o monocromador, será realizada 
a seleção do comprimento de onda (λ) que permite a maior absorção de energia (maior absortividade 
molar) pela espécie química que se deseje analisar.
Após a seleção da radiação eletromagnética (λ) específica para a determinação qualitativa ou 
quantitativa da espécie química de interesse, será necessária a condução dessa luz monocromática para 
o interior de uma cela escura que entrará em contato com a amostra contida na cubeta.
As cubetas poderão ser de vidro, quartzo ou de plástico e os três tipos de materiais poderão ser 
empregados para o caso de análises realizadas dentro da faixa visível de radiações eletromagnéticas. 
Entretanto, para o caso de análises espectrofotométricas realizadas na faixa ultravioleta será necessária 
a utilização de cubetas de quartzo devido à sua maior faixa de transparência.
O quadro a seguir apresenta a relação entre os diferentes tipos de materiais utilizados na fabricação 
das cubetas e sua transparência.
Quadro 3 – Relação entre diferentes tipos de materiais e transparência
Material Transparência (nm) Aplicação
Plástico 380-800 Visível
Vidro 375-2.000 Visível
Quartzo 150-3.000 UV e visível
Adaptado de: Skoog et al. (2006).
27
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
De acordo com o observado no quadro anterior, a cubeta de quartzo é a única que garante 
transparência adequada para análises realizadas dentro do espectro ultravioleta (UV).
As cubetas deverão ser transparentes para a luz monocromática que será empregada na análise 
espectrofotométrica e deverão apresentar uma geometria bem definida (HAGE; CARR, 2012). Além disso, 
as cubetas podem ser de diversos formatos e são constituídas de vidro, sílica (quartzo) ou plásticas, 
conforme apresentadas na figura a seguir.
Figura 10 – Cubetas de diversos tipos
Como observado na figura anterior, as cubetas poderão apresentar diferentes capacidades e, 
portanto, permitirão a análise de diferentes volumes de amostra analítica. Geralmente, as análises 
espectrofotométricas utilizam cubetas de 700 µL até 2 mL e estas poderão apresentar dois ou quatro 
lados polidos. O ideal é que o volume de amostra não atinja o limite máximo da cubeta, sob pena de 
parte do material escorrer dentro do equipamento durante a realização da análise.
Resíduos de soluções poderão corroer os componentes da cela de acondicionamento da cubeta ou 
mesmo promover a interferência em outras análises, uma vez que essa sujidade poderá absorver parte 
da energia advinda da radiação eletromagnética selecionada. Por conta disso, recomenda-se a limpeza 
constante do interior da cela de acondicionamento da cubeta (cela escura).
A cela escura onde se acomoda a cubeta é a única parte do espectrofotômetro que pode ser 
aberta, rotineiramente, em um espectrofotômetro. Para a realização da análise será necessário 
acomodar a cubeta (contendo a amostra analítica) no seu interior de forma que a cubeta esteja 
28
Unidade I
posicionada com seu lado polido de frente à saída da luz monocromática (radiação eletromagnética 
selecionada pelo monocromador).
Uma fenda ajustável permite apenas um comprimento de onda específico através da solução de 
amostra contida no interior da cubeta, e a quantidade de energia não absorvida (transmitida) passará 
através da cubeta e será lida pelo detector.
Muitos detectores empregados nas análises espectrofotométricas utilizam o efeito fotoelétrico para 
captar a radiação transmitida através da cubeta. Esse efeito ocorre quando a luz incide sobre certas 
substâncias e provoca a emissão de elétrons a partir de sua superfície (HAGE; CARR, 2012). O efeito 
fotoelétrico poderá ser usado em dois tipos de detectores: o fototubo e o tubo fotomultiplicador.
A figura a seguir apresenta um modelo de detector defototubo. Quando a luz entra no fototubo e 
atinge o cátodo, elétrons são emitidos por um material fotoemissor existente na superfície do cátodo. 
Em seguida, os elétrons seguirão até o ânodo (região de carga positiva).
O deslocamento dos elétrons produz uma corrente elétrica que será diretamente proporcional à 
quantidade de luz transmitida que chegou ao interior desse componente.
Suporte externo
(quartzo ou vidro)
Cátodo (-)
Contatos 
elétricos
Ânodo (+)
Luz
Figura 11 – Componentes básicos de um detector de fototubo
A corrente elétrica produzida no interior do detector será convertida em um sinal elétrico capaz 
de relacionar a quantidade de luz absorvida e/ou transmitida a uma unidade chamada de transmitância (T). 
Esta, por sua vez, poderá ser convertida pelo equipamento em uma unidade, mais usual, chamada de 
absorbância (A).
A cada conjunto de determinações, ou após alterar o comprimento de onda, o aparelho deve ser 
sempre zerado e calibrado com a cubeta que contém a amostra em branco.
29
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
 Observação
Para casos em que a solução preparada não tenha nenhum outro 
reagente químico adicionado no seu preparo (apenas amostra e água), 
usar água para calibrar o espectrofotômetro antes de realizar a leitura 
das amostras. O branco ideal deverá ser preparado, entretanto, com 
as concentrações de todas as espécies químicas interferentes e que, 
sabidamente, estarão presentes na amostra analítica. Dessa forma, será 
possível garantir que a absorção de energia detectada pelo equipamento 
corresponderá, exclusivamente, à espécie química que se deseja analisar.
Os brancos indicam a interferência de outras espécies na amostra e os traços de analito encontrados 
nos reagentes usados na preservação, preparação e análise. A solução denominada branco deve conter 
todos os constituintes do sistema, exceto a amostra a ser estudada para eliminar interferentes.
A partir da necessidade de se remover a interferência de outras espécies químicas presentes na 
amostra, ou mesmo da própria cubeta empregada na determinação analítica, existem dois modelos 
de espectrofotômetros, atualmente, empregados para determinações qualitativas e quantitativas de 
espécies químicas dentro da rotina laboratorial:
• Espectrofotômetro de feixe simples: apresenta uma cela de acondicionamento de cubeta.
• Espectrofotômetro de feixe duplo: apresenta duas celas de acondicionamento de cubeta.
A grande diferença que ocorrerá entre os dois modelos de equipamento estará na forma como as 
interferências serão eliminadas durante a realização da análise.
O modelo de espectrofotômetro de feixe simples não permite a correção das interferências durante a 
realização da análise. Portanto, será necessário eliminar tais interferências através da análise do chamado 
“branco” antes da realização das análises de cada amostra analítica e a partir da troca da cubeta.
Tal procedimento acaba por aumentar o tempo de análise, uma vez que a cada troca deverão ser 
garantidas a limpeza da cubeta e a pipetagem correta da amostra e do branco analisados.
O modelo de espectrofotômetro de feixe duplo permite a eliminação da interferência através da 
leitura constante da absorção de energia pela amostra em branco.
A figura a seguir apresenta a concepção geral dos equipamentos de feixe simples e duplo.
30
Unidade I
MonocromadorMonocromador
Célula da amostraCélula da amostra
(a) Espectrofotômetro de feixo simples(a) Espectrofotômetro de feixo simples
(b) Espectrofotômetro de feixo duplo(b) Espectrofotômetro de feixo duplo
Célula da amostraCélula da amostraFonte de luzFonte de luz
Fonte de luzFonte de luz
Célula da referênciaCélula da referência
Espelho Espelho 
rotativorotativo
MonocromadorMonocromador
Detector e Detector e 
processamento de sinalprocessamento de sinal
Detector e Detector e 
processamento de sinalprocessamento de sinal
Figura 12 – Esquema apresentando a concepção geral para espectrofotômetros de feixe simples e de feixe duplo
A cubeta contendo a amostra em branco ficará acondicionada na célula de referência e esta será 
responsável por fornecer a radiação transmitida residual dos interferentes que deverá ser descontada a 
cada análise de amostra (acondicionada na cubeta posicionada na célula da amostra).
A figura a seguir apresenta uma imagem de uma análise espectrofotométrica em que é possível 
observar em detalhe a cela escura para acondicionamento da cubeta.
Figura 13 – Imagem de um espectrofotômetro UV-VIS de feixe simples
31
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
Os modelos mais atuais de espectrofotômetros se constituem em equipamentos bastante compactos, 
como o apresentado a seguir.
Figura 14 – Modelo de espectrofotômetro UV-VIS Helios Omega, da fabricante Thomas Scientific
A espectroscopia de absorção molecular, também conhecida como espectrofotometria, está baseada 
na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), conforme representado na figura a seguir.
b
P
P0
Figura 15 – Diagrama da absorção de um feixe de luz “monocromática” atravessando uma cubeta de tamanho b
Através da análise da figura anterior é possível observar que uma luz incidente de potência radiante 
máxima (P0) atravessa a cubeta de largura conhecida (b). No interior da cubeta estará acondicionada 
a amostra.
Ao atravessar a cubeta, a luz incidente (P0) irá interagir com a espécie química de interesse e parte de 
sua energia será absorvida. Após a passagem pela cubeta ter-se-á uma luz transmitida de potência residual 
(P) que será conduzida ao detector e gerará o sinal elétrico relacionado a essa determinação analítica.
A figura anterior também ilustra as variáveis no cálculo da lei que rege a espectrofotometria de 
absorção molecular e que recebe o nome de Lei de Lambert-Beer.
A capacidade de transmitir a luz é definida como a transmitância (T) e esta poderá ser relacionada 
à fração de radiação luminosa que passa pela amostra sem que tenha ocorrido sua absorção. Portanto, 
pode-se mensurar a transmitância (T) conforme apresentado na equação a seguir.
32
Unidade I
T = 
0
P
P
Em que:
• P = potência transmitida a partir da cubeta;
• P0 = potência radiante inicial que será levada até a cubeta;
• T = transmitância.
Os espectrofotômetros costumam apresentar os resultados analíticos por meio da conversão do sinal 
elétrico obtido no detector para o parâmetro transmitância (T). Trata-se de um valor em escala decimal 
que poderá ser, facilmente, convertido para unidade em porcentagem (equação a seguir).
%T = T × 100
A transmitância apresenta algumas limitações práticas relacionadas à aplicação em cálculos 
espectrofotométricos, sobretudo diante da dificuldade de se estabelecer um equacionamento que 
permite a determinação da concentração da espécie química presente na amostra analítica. Portanto, 
costuma-se empregar a absorbância (A) para tal fim.
A absorbância (A) pode ser definida como a capacidade de absorver a luz monocromática detectada 
para uma espécie química quando submetida à análise espectrofotométrica. Portanto, a absorbância 
exprime a fração da energia luminosa que é absorvida por uma determinada espessura de um material. 
De acordo com o preconizado na Lei de Lamber-Beer, tem-se que a absorbância será diretamente 
proporcional à concentração do soluto.
Transmitância (T) e absorbância (A) podem ser consideradas parâmetros inversamente proporcionais 
e, portanto, a absorbância poderá ser determinada através da expressão indicada na equação a seguir.
A = -logT
Em que:
• A = absorbância;
• T = transmitância.
Portanto, a absorbância poderá ser considerada o inverso do logaritmo da transmitância.
1
A log
T
=
33
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
As equações anteriores poderão, portanto, ser empregadas sempre que se pretenda efetuar a 
conversão entre os parâmetros de transmitância e absorbância. Uma característica observada entre 
esses dois parâmetros espectrofotométricos é que a absorbância de uma solução tenderá a aumentar 
sempre que a transmitância diminuir.Portanto, transmitância (T) e absorbância (A) tendem a ser 
grandezas complementares e adimensionais. Dessa forma, a elas nunca deverá ser atrelada nenhuma 
unidade de medida.
Exemplo de aplicação
Exemplo 1
Calcule a absorbância (A) sabendo-se que a porcentagem de transmitância (%T) é igual a 11,8%:
Resolução
Passo 1: o valor da transmitância deve ser divido por 100, pois está em porcentagem.
11,8
T 0,118
100
= =
Passo 2: substituir na equação de conversão de absorbância (A) e transmitância (T).
A = -logT = -log0,118
A = - (-0,9281)
A = -0,9281
Exemplo 2
Calcule a transmitância (%) partindo-se de uma absorbância (A) igual a 0,918.
Resolução
Substituindo o valor de absorbância (A) na expressão da equação anterior, tem-se:
0,918 = -logT
Tendo-se que a absorbância (A) corresponderá ao antilogaritmo em base 10 da transmitância (T), é 
possível determinar seu valor através da seguinte conversão:
T=10-0,918 = 0,01208
Sabendo-se o resultado da transmitância (T), é possível determinar a porcentagem de transmitância (%T):
%T 0,01208 100 12,08%= × =
34
Unidade I
Portanto, uma amostra de absorbância igual a 0,918 terá uma porcentagem de transmitância 
equivalente a 12,08%.
Os espectrofotômetros UV-visível são instrumentos de análise que permitem:
• Selecionar o comprimento de onda (λ) da radiação mais adequada à análise de um determinado 
componente (varredura do espectro de absorção).
• Medir a intensidade (I) do feixe emergente que corresponde a um determinado feixe incidente (Io), 
convertendo o sinal recebido no detector em medida de absorbância para o comprimento de onda 
da análise.
• Determinar a concentração de uma espécie em solução a partir do gráfico da variação de 
absorbância (ou transmitância) em função da concentração de várias soluções-padrão.
1.4.2 Precauções relacionadas ao manuseio de cubetas
O manuseio das cubetas deve ser feito com um lenço de papel, para impedir que as pontas dos dedos 
entrem em contato com as faces. Da mesma forma, os dedos das mãos do analista não deverão encostar 
na face polida da cubeta, pois as impressões digitais dispersam e absorvem a luz.
O posicionamento da cubeta deverá ser realizado da maneira mais reprodutível possível, pois poderá 
acarretar uma variação aleatória na absorbância (A) promovida por pequenas diferenças da posição da 
cubeta no seu suporte.
1.5 Lei de Lambert-Beer
Os cientistas Lukas Lambert e August Beer observaram a relação existente entre a transmissão e a 
concentração do meio onde passa o feixe de luz. A partir de suas observações foi possível estabelecer 
em 1852 uma teoria capaz de garantir a evolução da técnica espectrofotométrica.
 Observação
Lei de Lambert: quando a concentração da substância é constante, a 
absorção depende do comprimento do trajeto óptico.
Lei de Beer: quando o trajeto óptico é constante, a absorção depende 
da concentração.
A Lei de Lambert-Beer (também conhecida como lei de Beer-Lambert, Lei de Beer ou ainda Lei 
de Beer-Lambert-Bouguer) relaciona a absorção da luz (radiação eletromagnética em geral) com as 
propriedades do material pela qual a luz está passando.
35
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
A figura a seguir apresenta um exemplo da variação indicada pela Lei de Lambert. Através dela é 
possível observar que, ao se mudar a cubeta, onde a amostra analítica estará contida durante a análise 
espectrofotométrica, ocorrerá uma variação no caminho óptico (b) e este, por sua vez, irá promover uma 
variação na intensidade de luz que chegará ao detector. Com isso, ocorrerá uma alteração no valor da 
absorbância (A) lida pelo equipamento.
Assim, ao se acondicionar a amostra analítica em uma cubeta de largura igual a 1 cm ter-se-á um 
valor de absorbância menor que o observado para a mesma amostra analítica quando acondicionada 
em uma cubeta de capacidade maior (largura igual a 5 cm). Conclui-se, portanto, que:
Maior caminho óptico (b) = maior absorbância (A)
5 cm
IT’IO
1 cm
ITIO
Figura 16 – Demonstração da Lei de Lambert. A intensidade transmitida sofrerá variação de forma que T > T’
Pela figura anterior, é possível observar que o aumento no caminho óptico resultará em maior 
quantidade de moléculas absorvendo energia em uma determinada largura e tal fato resultará em 
menor intensidade (IT’) de radiação transmitida saindo da cubeta. Consequentemente, ter-se-á um maior 
valor de absorbância (A).
Ao equacionar a relação entre o caminho óptico e a intensidade da luz transmitida, Lambert obteve:
IT = I0 × 10
-K×b, em que:
• IT = intensidade de energia transmitida ao passar pela cubeta;
• I0 = intensidade inicial de energia que entra na cubeta;
• K = constante;
• b = caminho óptico (cm).
36
Unidade I
A figura a seguir apresenta um exemplo da variação indicada pela Lei de Beer. Através dela é possível 
observar que, ao se mudar a concentração da espécie química de interesse e mantendo-se o mesmo 
caminho óptico (b), ocorrerá uma variação na intensidade de luz transmitida a partir da cubeta e que 
chegará ao detector. Com isso, ocorrerá uma alteração no valor da absorbância (A) lida pelo equipamento.
Assim, ao se acondicionar uma amostra analítica de menor concentração da espécie química em 
uma cubeta de largura igual a 1 cm, ter-se-á um valor de absorbância menor que o observado para uma 
mesma amostra analítica de maior concentração quando acondicionada em uma cubeta de mesmo 
caminho óptico (largura igual a 1 cm). Conclui-se, portanto, que:
Maior concentração (c) = maior absorbância (A)
Solução 50 g.L-1
IT”IO
Solução 5 g.L-1
ITIO
Figura 17 – Demonstração da Lei de Beer. A intensidade transmitida sofrerá variação de forma que T’’ > T
Pela figura anterior é possível observar que o aumento na concentração da espécie química resultará 
em maior quantidade de moléculas absorvendo energia em uma determinada largura fixa, e tal fato 
resultará em maior intensidade (IT’’) de radiação transmitida saindo da cubeta. Consequentemente, 
ter-se-á um maior valor de absorbância (A).
Ao equacionar a relação entre a concentração (c) e a intensidade da luz transmitida, Beer obteve:
IT = I0 × 10
-K×c
Em que:
• IT = intensidade de energia transmitida ao passar pela cubeta;
• I0 = intensidade inicial de energia que entra na cubeta;
• K = constante;
• c = concentração (g L-1).
37
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
As Leis de Lambert-Beer são o fundamento da espectrofotometria e devem ser tratadas 
simultaneamente. Com isso, a junção das duas leis permite que se defina que a quantidade de luz 
absorvida ou transmitida por uma determinada solução dependerá da concentração do soluto (c) e da 
espessura da solução (caminho óptico, b).
A Lei de Lambert-Beer descreve aos fenômenos que ocorrem no espectrofotômetro e os associa à 
concentração da amostra (c) e ao caminho óptico (b), conforme demonstrado na equação a seguir.
A = ε × b × c
Em que:
• A = absorbância (adimensional);
• ε = coeficiente de absortividade molar (L.mol-1 cm–1);
• b = caminho óptico da amostra (espessura da cubeta em cm);
• c = concentração da amostra (mol L-1).
A absorbância é diretamente proporcional à concentração da espécie absorvedora de luz.
Exemplo de aplicação
Exemplo 1
Encontre a absorbância de uma solução 0,00280 mol L-1 de uma substância com coeficiente de 
absortividade molar de 415 L mol-1 cm–1 numa cubeta de 2 cm de caminho óptico.
Resolução
Empregando a equação de Lambert-Beer, tem-se:
A = ε × b × c
A = 415 × 2 × 0,00280
A = 2,32
Exemplo 2
A absorbância de uma solução 1,83 × 10-5 mol L-1 de um composto é de 0,735, no comprimento de 
onda de 266 nm, numa cubeta de 1 cm de caminho óptico. Calcule a absortividade molar do composto 
em 266 nm.
38
Unidade I
Resolução
Empregando a equação de Lambert-Beer, tem-se:
A = ε × b × c
Para determinar a absortividade molar é necessário isolar este termo da equação:
A
bc
e =
ε = 0,735 / 1 × 1,83 × 10-5
ε = 40.163,93 L mol-1 cm-1
Exemplo 2
Imagine que você foi enviado para a Índia para investigar a ocorrência de bócio