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Prof. Dr. Luiz Carlos UNIDADE I Métodos Instrumentais de Análises A análise química pode ser realizada por meio de métodos clássicos e instrumentais. Métodos analíticos Métodos analíticos Clássicos Instrumentais Medida das propriedades físicas do analito Medida da massa (gravimétricos) Medida do volume (volumétricos) Técnicas analíticas capazes de separar, identificar e quantificar espécies químicas que possam estar presentes em uma amostra de interesse. As análises instrumentais são possíveis, uma vez que a detecção e a quantificação se darão por conta da interação física das espécies químicas presentes na amostra. São divididos em três grandes grupos: Técnicas espectrométricas. Técnicas cromatográficas. Técnicas eletroquímicas. Métodos instrumentais Sequência de etapas: Princípio Fonte Seletor Transdutor Detector Compartimento do analito Apresentação de resultado Interpretação e conclusão Métodos espectrométricos Sinal Método Emissão de radiação Espectroscopia de emissão (raio-X, UV, visível, elétron) fluorescência, fosforescência e luminescência (raio-X, UV, visível) Absorção de radiação Espectrofotometria e fotometria (raio-X, UV, visível, IV), espectroscopia fotoacústica, ressonância nuclear magnética e espectroscopia de ressonância elétron spin Espalhamento de radiação Turbidimetria, nefelometria, espectroscopia Raman Refração de radiação Refratometria, interferometria Difração de radiação Raio-X e métodos de difração de elétron Rotação de radiação Potenciometria Reflexão, absorção e transmissão da luz Fonte: https://mundoeducacao.uol.com.br/fisica/optica.htm Sequência de etapas: Princípio Fonte (lâmpada) Seletor (monocromador) Transdutor Detector Compartimento do analito Apresentação de resultado Interpretação e conclusão Redução da transparência de uma amostra devido à presença de partículas em suspensão que interferem na passagem de luz pelo fluido. Espalhamento da luz Fonte: https://www.hexis.com.br/produto/turbidimetro-tl2300 I0 It Luz dispersada (nefelometria) Luz transmitida (turbidimetria) Baseia-se na interação da matéria com a energia radiante. Espectrometria de absorção molecular Luz incidente Luz emergente Luz absorvida •Boa sensibilidade •Baixo custo de análise •Fácil operação •Equipamentos robustos Perdas: - reflexões - dispersão - absorção Fonte: https://kasvi.com.br/espectrofotometria-analise-concentracao-solucoes/ Toda molécula é capaz de absorver energia a partir da radiação emitida pelo aparelho. Entretanto, a quantidade de energia absorvida irá variar de acordo com a energia incidente (para cada comprimento de onda, existe uma quantidade específica de energia absorvida pela molécula). Espectro de absorção S in a l E lé tr ic o Comprimento de Onda (λ) Fonte: adaptado de: https://kasvi.com.br/espectrofotometria- analise-concentracao-solucoes/ Espectros de absorção de diferentes substâncias 1. bacterioclorofila. 2. clorofila a. 3. clorofila b. 4. ficoeritrobilina. 5. betacaroteno. Espectro de absorção Cada substância apresentará um pico de absorbância característico e o comprimento de onda de emissão correspondente deverá sempre ser ajustado no aparelho antes de qualquer análise. Fonte: http://www.ledson.ufla.br/praticas-laboratoriais-em-fisiologia-vegetal/espectro-absorcao-radiacao/ Solução contendo todos os componentes previstos na amostra com exceção da substância de interesse. Branco Fonte: https://www.directindustry.com/pt/ prod/hellma-gmbh-co-kg/product- 88614-1856899.html Colimador (lente) Fonte de luz Seletor de comprimento de onda (fenda de passagem) Monocromador (prisma ou espelho grating ou grade de difração) Solução de amostra (em cubeta) Detector (fotocélula) Mostrador digital Fonte de radiação. Monocromador. Compartimento de amostra. Detector. Equipamento (espectrofotômetro) Fonte: https://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-2- UV-VIS_2o-Sem-2016-Parte-2.pdf Fonte de luz Elemento dispersante Amostra Detector Amplificador Indicador Registrador Exemplo Fonte: https://www.globaltradebr.com.br/espectrofotometro- digital-uv-visivel-faixa-190-1000nm.html Toda análise instrumental se baseia na obtenção de uma resposta física da molécula, átomo ou íon a ser analisado. Levando em conta a análise por espectrofotometria, indique a alternativa incorreta: a) Necessita de uma fonte que será a responsável pela geração do estímulo ao átomo ou à molécula no aparelho. b) Necessita de um monocromador que será responsável pela seleção da radiação empregada. c) Necessita de detector que será responsável pela captação da radiação no aparelho. d) Necessita de uma cubeta de dois lados polidos para acomodar o analito. e) Necessita de duas radiações conhecidas para excitar a molécula. Interatividade Toda análise instrumental se baseia na obtenção de uma resposta física da molécula, átomo ou íon a ser analisado. Levando em conta a análise por espectrofotometria, indique a alternativa incorreta: a) Necessita de uma fonte que será a responsável pela geração do estímulo ao átomo ou à molécula no aparelho. b) Necessita de um monocromador que será responsável pela seleção da radiação empregada. c) Necessita de detector que será responsável pela captação da radiação no aparelho. d) Necessita de uma cubeta de dois lados polidos para acomodar o analito. e) Necessita de duas radiações conhecidas para excitar a molécula. Resposta Tipos de espectrofotômetro Fonte: https://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula- 2-UV-VIS_2o-Sem-2016-Parte-2.pdf Fonte de luz Cubeta Monocromador Compartimento de amostra Detector Amplificador Indicador Indicador Amplificador Detector Monocromador Fonte de luz Referência Amostra Cubetas Fonte: https://www.directindustry.com/pt/prod/hellma -gmbh-co-kg/product-88614-1856899.html Material Transparência Aplicabilidade Quartzo 150-3000 nm UV, visível Vidro 375-2000 nm Visível Plástico 380-800 nm Visível Lâmpadas (fontes de radiação) Fonte: SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição Americana. Ed. Thomson; São Paulo, 2007. In te n s id a d e deutério tungstênio 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 λ / nm Relação entre transmitância e absorbância Fonte: https://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-5- ESPECTROFOTOMETRIA-parte-2-_2S-2012.pdf A espectroscopia de absorção molecular está baseada na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), que estão relacionadas nas equações: A = 0,000 T = 1,000 (100% de transmissão) A = 1,000 T = 0,100 (10% de transmissão e 90% de absorção) A quantidade de energia transmitida depende da quantidade de moléculas presentes, ou seja, da concentração da substância analisada. Lei de Beer solução 10 g/L Io IT1 solução 20 g/L IT2Io It = Io 10 -K´c Fonte: https://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-5- ESPECTROFOTOMETRIA-parte-2-_2S-2012.pdf Quanto maior a quantidade de moléculas (concentração), maior a quantidade de radiação absorvida (absorbância) e menor a quantidade de energia transmitida (transmitância). Fonte: https://web.mst.edu/~gbert/Color_Lg/spec/Aspec.html A quantidade de energia transmitida depende do caminho óptico seguido pela radiação. Lei de Lambert 1 cm Io IT1 Io IT3 3 cm It = Io 10 -Kl Fonte: https://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-5- ESPECTROFOTOMETRIA-parte-2-_2S-2012.pdf Quanto maior a barreira a ser atravessada pela radiação, menor a quantidade de energia na radiação transmitida. Fonte: https://web.mst.edu/~gbert/Color_Lg/spec/Aspec.html Lei de Beer-Lambert A: absorbância e: coeficiente de extinção molar b: largura da cubeta c: concentração da substância 𝑨 = 𝜺 × 𝒃 × 𝒄 Fonte: https://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-5-ESPECTROFOTOMETRIA-parte-2-_2S-2012.pdf Limitação real A lei é válida somente para baixas concentrações. Em altas concentrações, a interação entre as moléculas afeta a distribuição de radiação, alterando o coeficiente de absortividade molar (e). Como minimizar o desvio? Manter absorbância inferior a 1,000. Limites da Lei de Beer-Lambert Concentração g/L Absorbâncias nm 440 0,00625 0,212 0,0125 0,384 0,025 0,686 0,05 1,122 0,1 1,465 O limite quantitativo para a Lei de Beer é igual a absorbância 1,000. Valores superiores devem ser desconsiderados, pois promovem um desvio na proporcionalidade entre absorbância e concentração. Limite real da Lei de Beer-Lambert Desvio instrumental A lei só é válida para radiação monocromática, ou seja, para um único comprimento de onda (). Como minimizar o desvio? Escolher a região onde o e é constante na região selecionada (pico de absorção). Limites da Lei de Beer-Lambert Comprimento de onda Concentração A b s o rb â n c ia A b s o rb â n c ia Fonte: SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição Americana. Ed. Thomson; São Paulo, 2007. O estudo espectrofotométrico se baseia na medida de quantidades relativas de luz absorvida por uma amostra, em função do seu comprimento de onda. Em relação a essa técnica, é incorreto afirmar que: a) A transmitância é inversamente proporcional à concentração da solução corada. b) Na realização da técnica, denomina-se BRANCO o componente que contém todas as substâncias, menos a que está sendo dosada. c) Quanto maior a concentração da solução corada, menor será a absorbância da amostra. d) A curva de calibração representa graficamente os valores das absorbâncias e das concentrações de um conjunto de soluções-padrão. e) Quanto mais próximo de 1 estiver o coeficiente de correlação, mais linear será o método analítico. Interatividade O estudo espectrofotométrico se baseia na medida de quantidades relativas de luz absorvida por uma amostra, em função do seu comprimento de onda. Em relação a essa técnica, é incorreto afirmar que: a) A transmitância é inversamente proporcional à concentração da solução corada. b) Na realização da técnica, denomina-se BRANCO o componente que contém todas as substâncias, menos a que está sendo dosada. c) Quanto maior a concentração da solução corada, menor será a absorbância da amostra. d) A curva de calibração representa graficamente os valores das absorbâncias e das concentrações de um conjunto de soluções-padrão. e) Quanto mais próximo de 1 estiver o coeficiente de correlação, mais linear será o método analítico. Resposta Técnica baseada na atomização de amostras para detecção de elementos químicos individuais. Envolve a medida da absorção de uma radiação por átomos gasosos no estado fundamental. Utilizada há mais de 50 anos em diferentes situações do controle físico-químico nas indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica. Espectrometria de absorção atômica Fonte: http://www.instalacoesmec.com.br/oxido-nitroso-absorcao-atomica.html Esquema de um espectrômetro de absorção atômica Fonte: SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição Americana. Ed. Thomson; São Paulo, 2007. Fluxograma do processo de atomização Amostra Spray Aerossol Moléculas gasosas Átomos Íons Nebulização Dessolvatação Volatilização Dissociação atômica Ionização Etapas reversíveis, obtenção das formas excitadas e, com isso, ocorrência da absorção de radiação (ou emissão) Amostra é nebulizada por um fluxo de gás oxidante + gás combustível. Em seguida, a amostra é levada à chama para a atomização. Etapa crítica na análise e que pode garantir a precisão do resultado. Atomização por chama Fonte: https://ien.gov.br/index.php/laboratorios/82-laboratorios/200- laboratorio-de-espectrometria-de-absorcao-atomica.html Queimador Fonte: SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição Americana. Ed. Thomson; São Paulo, 2007. Oxidante auxiliar Parafuso de fixação do obstáculo de fluxo Cabeça do queimador Anel de segurança da cabeça do queimador Abertura para escape de pressão Obstáculo de fluxo (Plástico Panton) Combustível Botão de ajuste do nebulizador Capilar de entrada da amostra Nebulizador Para descartar Oxidante do nebulizador Ar: recomendado apenas em casos onde a amostra se decompõe facilmente (temperaturas mais baixas). Vazão do gás deve ser igual ou pouco maior que a velocidade de queima para manter a chama estável. A chama deve atravessar o queimador. Tipos de chamas Combustível Oxidante T (°C) VQueima (cm/s) Gás natural Ar 1700-1900 39-43 Gás natural Oxigênio 2700-2800 370-390 Hidrogênio Ar 2000-2100 300-440 Hidrogênio Oxigênio 2550-2700 900-1400 Acetileno Ar 2100-2400 158-266 Acetileno Oxigênio 3050-3150 1100-2480 Acetileno Óxido nitroso 2600-2800 285 Aspecto e tamanho de cada zona de combustão é dependente do tipo de combustível e de oxidante. Estrutura da chama Zona de combustão primária Região interzonal Zona de combustão secundária Zona de combustão primária não é utilizada, pois, geralmente, não possui equilíbrio térmico. Atomização é feita na região interzonal, pois existe predominância de átomos livres. Zona de combustão secundária pode formar óxidos. Cada átomo a ser analisado tem perfil de absorção diferente, sendo necessário ajustar a altura da chama para análise. Perfil de absorção da chama Altura da chama, cm Absorbância Ag Mg Cr Mg: maior absorbância no meio da chama, pois, ao chegar na zona secundária, começa a formar óxidos, diminuindo a quantidade de átomos. Ag: maior absorbância na parte mais externa da chama. A prata não é oxidada facilmente de forma a aumentar o número de átomos com a altura da chama (não forma óxidos). Cr: forma óxidos muito estáveis, sendo necessário trabalhar numa altura de chama menor. Fonte: SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição Americana. Ed. Thomson; São Paulo, 2007. Lâmpada de cátodo oco (mais comum, HCL). Promove a excitação dos elementos contidos na chama e permite a quantificação a partir de sua absorção ou emissão. Tubo de vidro oco preenchido com gás inerte contendo os eletrodos. Cátodo: elemento de interesse na análise. Ânodo: zircônio ou tungstênio. Lâmpada gera uma radiação eletromagnética característica do cátodo. Fonte de radiação Lâmpada de cátodo oco ou HCL Fonte: https://vrbrasil.com/tudo- sobre-lampadas-de-catodo-oco/ Contatos elétricos Pino de alinhamento Anodo Getter Janela de quartzo Invólucro de PyrexContatos para o código do elemento Catodo Isolante Separa a linha espectral de interesse das outras linhas emitidas pela fonte de radiação através de um prisma ou uma rede de difração (duas fendas estreitas para entrada e saída da radiação). Ocorre a separação em linhas discretas de radiação com diferentes comprimentos de onda (e, portanto, diferentes ângulos de difração). A fenda de saída seleciona a radiação desejada. Monocromador Fonte: https://docplayer.com.br/7027231- Espectrometria-de-absorcao-atomica.html Ângulo da rede determina o comprimento de onda na fenda de saída Espelho côncavo Espelho côncavo Rede de difração Fenda de saída Detector Fenda de entrada Fonte de radiação Ao se realizar uma análise por espectrometria de absorção atômica, a captação da energia absorvida pelo átomo a ser analisado envolve o uso de uma lâmpada especial, chamada: a) Deutério. b) Tungstênio. c) Cloreto. d) Platina. e) Cátodo oco. Interatividade Ao se realizar uma análise por espectrometria deabsorção atômica, a captação da energia absorvida pelo átomo a ser analisado envolve o uso de uma lâmpada especial, chamada: a) Deutério. b) Tungstênio. c) Cloreto. d) Platina. e) Cátodo oco. Resposta A atomização por chama alcança precisão de mg/L, o forno de grafite passa a ser interessante quando se deseja precisão maior (µg/L). Atomização ocorre em tubo transversal, minimizando a reversão dos átomos para moléculas, condensações nas extremidades do tubo e variações de temperatura. Ideia básica seria gerar uma nuvem de átomos densa e em condições controladas (L´vov, 1958). O processo de atomização ocorre em sistema fechado e que permite aumento no tempo de residência dos átomos no caminho óptico. Forno de grafite Fonte: https://www.analiticaweb.com.br/p.php?tit=espectrometro-de- absorcao-atomica&Bid=p487761f77ef70 Fonte: SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição Americana. Ed. Thomson; São Paulo, 2007. Compartimento da seringa Amostrador do forno Solução de lavagem Frasco de rejeitos Ajuste de altera da ponta do capilar Ajuste A do capilar Ajuste B do capilar Fonte: SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição Americana. Ed. Thomson; São Paulo, 2007. Forno de grafite Janela Para o espectrofotômetro Anel de vedação Fluxo interno de gás Tubo de grafite Feixe de luz Janela Fluxo externo de gás Anel de vedação Métodos qualitativos e quantitativos que se baseiam no fenômeno de excitação de uma molécula para, em seguida, ocorrer a emissão de uma radiação. A técnica envolve dois espectros de radiação: Excitação (menor λ). Emissão (maior λ). Espectrometria de emissão Fonte: https://www.news-medical.net/life-sciences/A-Guide-to- Fluorescence-(Portuguese).aspx Fluorescência: a excitação não provoca alterações no spin durante a transição eletrônica. Fosforescência: a excitação provoca alterações no spin durante a transição eletrônica. Quimiluminescência: emissão de radiação por uma espécie excitada durante uma reação química. Classificação Luz (fótons de alta energia) Absorção Luz (fótons de baixa energia) Emissão Sem Luz Estado Basal Sem Luz Estado Basal Fonte: https://www.pinterest.pt/pin/24558760454787236/ Excitação está relacionada ao estado eletrônico do spin nas moléculas. Spin: um orbital comporta, no máximo, dois elétrons de spin contrários (emparelhados). Estado fundamental (basal) Em um orbital eletrônico no estado fundamental, os elétrons se encontram EMPARELHADOS, como na figura ao lado. Quando um par de elétrons de uma molécula é excitado a um nível de energia mais alto, podem ser formados dois estados energéticos excitados: Singleto: elétrons permanecem emparelhados. Tripleto: elétrons desemparelhados. Estado de excitação Estado excitado singleto (fluorescência) Estado excitado tripleto (fosforescência) Diagrama de Jablonski Estados excitados singletos Estados excitados tripletosEnergia Fluorescência (emissão de fóton) Fosforescência (emissão de fóton) Relaxação vibracional (não radioativo) Absorção Fonte: http://fqb.fcien.edu.uy/docs/Clase%20Intro%20+%20efecto%20solvente.pdf Para efetuar uma análise fluorimétrica, deve-se obter, inicialmente, os λ de excitação e emissão para que se ajuste no equipamento. Ambos são obtidos por uma varredura semelhante àquela efetuada no espectrofotômetro. Por meio de uma curva de calibração é possível converter a intensidade (I) em concentração. Espectros de excitação e emissão Fonte: https://www.azonano.com/equipment- details.aspx?EquipID=86 Monocromador de emissão Monocromador de excitação Fotomultiplicadora da amostra Refletor branco Divisor de feixes Fotomultiplicadora de referência Lâmpada de xenônio Compartimento da amostra Fonte: HOLLER, SKOOG, CROUGH. Princípios de Análise Instrumental. 6. ed., 2009. Rede Célula de compensação da absorbância Rede Exemplo de Espectro de Excitação (FAD): Varredura Fonte: arquivo pessoal 150,000 100,000 50,000 0,000 350,0 400,0 500,0 600,0 700,0 Wavelength (nm) In te n s it y Exemplo de Espectro de Absorção (FAD) Varredura Fonte: arquivo pessoal 400,0 Wavelength (nm) In te n s it y 500,0 600,0 700,0350,0 -1,055 50,000 100,000 103,902 A espectrofluorimetria vem sendo utilizada em análise instrumental em substituição à tradicional análise espectrofotométrica. Apesar do custo maior do equipamento, a técnica apresenta diversas vantagens e por isso merece sempre atenção especial por parte do analista no momento de decidir qual a técnica mais apropriada para sua determinação analítica. A seguir, têm-se algumas afirmações sobre a técnica espectrofluorimétrica. Indique qual a afirmação correta: a) Apresenta precisão analítica inferior a da técnica espectrofotométrica, sendo possível captar teores na escala de micrograma por litro. b) Apresenta apenas um monocromador responsável pela seleção da radiação absorvida pela molécula. c) Baseia-se na determinação da quantidade de energia emitida pela molécula de interesse durante a passagem de um feixe de radiação com comprimento de onda fixo. d) Utiliza uma lâmpada de cátodo oco que será responsável pela emissão de uma radiação responsável pela excitação da molécula de interesse. e) Utiliza uma cubeta de dois lados polidos. Interatividade A espectrofluorimetria vem sendo utilizada em análise instrumental em substituição à tradicional análise espectrofotométrica. Apesar do custo maior do equipamento, a técnica apresenta diversas vantagens e por isso merece sempre atenção especial por parte do analista no momento de decidir qual a técnica mais apropriada para sua determinação analítica. A seguir, têm-se algumas afirmações sobre a técnica espectrofluorimétrica. Indique qual a afirmação correta: a) Apresenta precisão analítica inferior a da técnica espectrofotométrica, sendo possível captar teores na escala de micrograma por litro. b) Apresenta apenas um monocromador responsável pela seleção da radiação absorvida pela molécula. c) Baseia-se na determinação da quantidade de energia emitida pela molécula de interesse durante a passagem de um feixe de radiação com comprimento de onda fixo. d) Utiliza uma lâmpada de cátodo oco que será responsável pela emissão de uma radiação responsável pela excitação da molécula de interesse. e) Utiliza uma cubeta de dois lados polidos. Resposta ATÉ A PRÓXIMA!
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