Correlações Clínico-Diagnósticas em Doenças Infecciosas

Prévia do material em texto

Correlações Clínico-Diagnósticas em
Doenças Infecciosas: Vírus e Fungos
4º Semestre
Imunologia
Aula 1 (16/08)
Imunidade contra microrganismos
Patogênese microbiana:
O microrganismo pode causar um tipo de lesão ou reação no nosso corpo
Podemos pensar na nossa microbiota, que tem microrganismos que vivem em
harmonia e não nos causam doenças. Eles não contam na parte de patogênese
microbiana, estamos falando dos microrganismos patogênicos que levam à lesão
tecidual
Tudo começa com a exposição ao microrganismo, essa exposição pode vir de
várias maneiras
Exposto ao patógeno, ele realiza a adesão sendo pela pele ou pelas mucosas. A
partir daí, o processo infeccioso ocorre. Ele invade através do epitélio e coloniza,
realizando seu crescimento com a produção de fatores de virulência
A invasão e a colonização é o momento que eles escapam (evadem) da imunidade,
se eles não escapassem você não teria sinais ou sintomas
Ao realizar essas etapas, teremos os efeitos da toxicidade e o crescimento
adicional (invasividade) no sítio original e sítios distantes, causando o dano
tecidual/doença propriamente dita
Imunidade contra bactérias extracelulares:
Extracelulares = não estão dentro da célula
Pode se replicar fora das células do hospedeiro
Pode estar no sangue, no tecido conjuntivo, no trato respiratório, no trato
gastrointestinal. Eventualmente, nos contaminamos com um patogênico
A doença é causada por 2 principais mecanismos:
1. O microrganismo que está ali irá induzir um processo inflamatório,
causando a destruição tecidual no sítio da infecção. Se o processo não
cessar, ele leva à lesão (gera febre, a presença do microrganismo estimula
os processos de febre e liberação de citocinas). A inflamação é boa pois
recruta as células para tentar resolver o que está de errado ali, mas se ela
ficar por muito tempo, teremos danificação tecidual
Inflamação é um mecanismo que ajuda nas lesões para causar a doença pois na
inflamação temos a presença do microrganismo, o macrófago residente realiza o
reconhecimento inicial e libera citocinas (citocinas pró-inflamatórias). Libera IL-1,
IL-6, tnf-α. Logo, libera mais citocinas, que podem ser seriamente prejudiciais para o
nosso corpo. O tnf-α pode, por exemplo, reduzir a pressão arterial. A própria
inflamação pode ajudar a lesão que temos por conta da doença estabelecida
2. O segundo mecanismo é a produção de toxinas, sejam elas exotoxinas ou
endotoxinas, elas também podem levar ao processo de destruição tecidual e
evolução da doença
Temos as exotoxinas que são secretadas (toxina botulínica, por exemplo, que
bloqueia a acetil-coA de se ligar ao receptor e impede a contração do músculo) e as
endotoxinas que são componentes da bactéria (LPS – lipopolissacarídeos – causa
febre)
Frente a elas, temos os principais mecanismos da resposta imunológica que vão
atuar para resposta. Sabemos que a resposta imunológica é dividida em duas,
imunidade inata e adaptativa (ou adquirida). Inata são os fatores já prontos, com os
seguintes mecanismos:
● Fagocitose e inflamação: nossos fagocitos profissionais são os macrófagos
e neutrófilos, são considerados profissionais pois o que elas mais fazem é
fagocitose. Neutrófilos também fazem a degranulação, mas sua função
principal é a fagocitose. O fagócito reconhece o PAMP, fagocita, lisossomo se
junta e destrói o microrganismo
● Ativação do sistema complemento: temos 3 vias de ativação do sistema
complemento, são elas: via clássica, via alternativa e via da lectina. Falamos
aqui da via alternativa e da lectina, pois são da imunidade inata.
Se eu preciso começar uma via do sistema complemento com anticorpo, então ela é
da via adaptativa. Por conta disso, a via clássica não é considerada imunidade
inata, mas sim adaptativa
Morte e degradação dos microrganismos pelos fagócitos:
Temos três tipos de mecanismos microbicidas:
● Enzimas lisossomais
● Espécies reativas de oxigênio
● Óxido nítrico
Temos o fagolisossomo, após ativação do fagócito. Temos a enzima oxidase
fagocitária, também podemos chamar de oxidase fagocítica. Essa enzima é
formada por 5 subunidades, entre elas, temos 2 na membrana do fagolisossomo
(GP91 e P22) e temos mais 3 subunidades no citosol. Quando a célula começa a
fagocitar, essas subunidades se juntam e formam a oxidase fagocitária, que é a
enzima que vai converter o oxigênio pra ROS (espécies reativas de oxigênio)
Elas são altamente tóxicas para o microrganismos, temos as enzimas lisossomais e
as ROS para matar os microrganismos. O terceiro mecanismo é o óxido nítrico (NO)
A iNOS (óxido nítrico sintase indutível) catalisa a conversão de arginina em citrulina,
como subproduto temos a produção de óxido nítrico. Ele, por sua vez, pode se
combinar com peróxido de hidrogênio ou superóxido, que produzem radicais de
peroxinítrico altamente reativos para matar microrganismos
Existe uma doença chamada doença granulomatosa crônica, que é genética. Essa
doença é causada pela mutação em uma das subunidades da oxidase fagocitária.
A oxidase fagocitária é um multicomponente enzimático complexo que consiste em:
● Três subunidades citolíticas (p40phox, p47phox e p67phox)
● Duas subunidades associadas a membrana (p22phox e p91phox)
Na doença granulomatosa crônica (DGC) temos uma mutação na phox-91. Teremos
uma produção defeituosa do ânion superóxido, uma das EROS, isso faz com que os
indivíduos não consigam resolver de forma eficiente a morte e degradação de
microrganismos patogênicos
DGC é uma imunodeficiência primária
Imunidade adaptativa:
Quando falamos de bactéria extracelular, temos a resposta inata e a adaptativa,
dividida em humoral e imunidade celular (TCD4+)
A resposta imune humoral consiste em reconhecer o microrganismo, ligando a
região variável do anticorpo ao organismo, temos os plasmócitos e produtores de
anticorpos, eles podem neutralizar o organismo, ajudar na fagocitose. Ativa o
sistema complemento pela presença do anticorpo, sendo eles: IgM e IgG apenas
Quando falamos de humoral, falamos basicamente de anticorpo
Quando falamos de resposta imune celular, falamos da célula TCD4+
Temos a presença de IL-6 e IL-1 fornecida pela célula dendrítica para célula naive,
temos os 3 sinais (MHC de classe 2, B7 liga no CD28 e as citocinas). A célula se
completa e vira a célula Th17
A dendrítica apresenta o antígeno, a célula T virgem é apresentada à ela. As
citocinas recrutam os fatores de transcrição que vão para o núcleo da célula realizar
a transcrição, para fazer mRNA
Temos a doença síndrome de Jó (ou síndrome de hiper IgE), o indivíduo tem uma
mutação no STAT3, que é o gene que codifica o fator de transcrição. O indivíduo
não consegue polarizar para Th17 e a consequência é o aumento de infecções de
bactérias e fungos extracelulares, já que o sistema imunológico está comprometido
Jó foi um personagem bíblico, que fala que ele sofreu com pústulas no corpo, o
paciente (assim como Jó) desenvolve abscessos cutâneos que se assemelham à
peste que acometeu o personagem biblíco
Os pacientes apresentam níveis aumentados de IgE, o motivo é desconhecido
Efeitos lesivos da resposta imunológica:
● Febre: presença de microrganismos, as citocinas atuam no hipotálamo,
aumentam a síntese de prostaglandinas, que irão aumentar a temperatura,
ocasionando a febre. A febre é um mecanismo de defesa do nosso corpo,
mas se ela perdurar é importante ir para o hospital e evitar os danos. A febre
é importante pois algumas enzimas das bactérias não funcionam, se ela não
passar pode afetar as nossas próprias enzimas
● Efeitos patológicos sistêmicos (coração, endotélio e tecido): produção
excessiva de TNF (fator de necrose tumoral), é um grupo de citocinas capaz
de provocar a apoptose tumoral e que possui ações pró-inflamatórias. O
excesso de TNF pode agir no coração inibindo a contrabilidade do miocárdio,
além da redução arterial; TNF pode também agir nas células endoteliais do
vaso sanguíneo, causando trombos (coágulos) e desenvolvendo trombose
intravascular,podendo se soltar e indo para outros lugares, aumenta o fator
tecidual (ativador da coagulação) e diminui a trombomodulina (inibidor da
coagulação); Por fim, a TNF pode atuar em diversos tecidos, causando a
fadiga (leva à caquexia - síndrome complexa e multifatorial que se
caracteriza pela perda de peso, atrofia muscular, fadiga, fraqueza e perda de
apetite)
● Superantígenos: qualquer célula T será ativada ao entrar em contato,
ocasionando a tempestade de citocinas (muita citocina), isso leva a
uma síndrome inflamatória sistêmica, que pode levar a um prejuízo
dos tecidos. Isso se dá a uma resposta imunológica frente à uma
bactéria com superantígeno
Temos a apresentadora de antígeno qualquer à célula T, que não é superantígeno.
Isso é uma resposta imune normal
Quando temos a presença do superantígeno, temos uma ativação diferente de
células T
Exemplo - SEB (SEB = enterotoxina B de estafilococos): a presença do
superantígeno faz com que as apresentadoras de antígeno apresentem qualquer
antígeno para qualquer célula T, mesmo que não seja específica. Isso equivale a 2%
de todas as células T, enquanto o normal era 0,0000001%
Por conta dessa ativação, temos a presença de muitas citocinas - leva a
tempestade de citocinas, pode lesionar o nosso corpo
Imunidade contra bactérias intracelulares:
Bactérias intracelulares são capazes de sobreviver dentro dos fagócitos, como o
exemplo abaixo:
Bactéria Listeria monocytogenes (bactéria intracelular facultativa) faz
contaminação de alimentos lácteos (queijos, coalhada, requeijão, leite...), se o
indivíduo ingere, ela vai do estômago para o intestino, lá ela atravessa os
enterócitos e encontra com o macrófago. Ao fagocitar, ela escapa do vacúolo da
célula e fica no citoplasma, logo, o mecanismo de matar bactéria dentro do vacúolo
não funciona
Ela pode se disseminar para baço, fígado e migrar para as meninges (levando à
meningite), se for mulher grávida atravessa a placenta e causa o aborto
Ela produz uma enzima chamada de listeriolisina O, que rompe a membrana do
fagossomo e consequentemente faz a bactéria ir para o citoplasma. É um
mecanismo para escapar do fagossomo, invadindo células vizinhas e se
multiplicando. Os mecanismos de morte atuando matando no vacúolo, se ela foge
do vacúolo, não é possível utilizá-los
30% das pessoas contaminadas morrem
A resposta imunológica para esse tipo de bactéria: no esquema abaixo, temos
um macrófago
O macrófago a fagocitou, ela escapa para o citoplasma e lá ela começa a se
reproduzir e aumentar a quantidade dessa bactéria no citoplasma do macrófago. Na
resposta imune inata, temos ajuda da célula NK (natural killer), ao ativá-la através
da citocina, ela começa a produzir muito INF-gama. Esse INF-gama ajuda a ativar
as células dendríticas para produzir IL-12 e IL-18 que irão retroalimentar as próprias
células NK. As células NK irão proliferar ainda mais e produzir ainda mais
INF-gama, que irá atuar no macrófago deixando-o ativado, ou seja, ajuda ele a
produzir mais espécies reativas de oxigênio, mais óxido nítrico e mais enzimas
lisossomais
O INF-gama potencializa o macrófago, para ele matar o microrganismo
A THG-1 é uma resposta recrutada quando temos infecção por bactérias
intracelulares, a principal citocina que ela produz também é a INF-gama
O INF-gama ativa o macrófago, se ela não estiver no vacúolo, não será morta. Por
isso, é preciso de uma cooperação para fazer a morte dessa bactéria
Através da resposta adaptativa temos outra forma, temos a célula dendrítica que
capta o microrganismo, migra para o linfonodo e dá os 3 primeiros sinais para o
sistema imunológico (respectivamente, MHC ligando ao TCR, molécula B7 que se
liga ao CD28 e as citocinas terminam de ativar a célula T). No caso, para os
intracelulares, a dendrítica fornece IL-12, que faz com que a célula T se diferencie
em TH1 e TH1 produz muito INF-gama
Temos a cooperação de TCD4 e TCD8 contra microrganismos intracelulares
Abaixo, temos o TH1 fornecendo INF-gama. O INF-gama vai para o macrófago e o
deixa ativado, o macrófago ativado por sua vez irá produzir mais espécies reativas
de oxigênio, óxido nítrico e enzimas lisossomais que irão atuar no fagolisossomo
(dentro do vacúolo)
Não adianta ativar o INF-gama se a bactéria estiver fora do citoplasma, por isso
temos a cooperação da célula TCD8. A citotóxica faz o reconhecimento do
macrófago infectado, despeja perforina (perfura o macrófago), lança granzima (entra
no macrófago) que leva o macrófago à apoptose.
Para se livrar de bactérias dentro do macrófago, é necessário matar o
macrófago
Mecanismos de evasão imunológica pelas bactérias:
Sobre as extracelulares, elas podem mudar seus epítopos (variação antigênica), as
bactérias citadas realizam isso. O sistema complemento pode ser inativado, como o
causador da leptospirose faz, temos também a resistência à fagocitose e o
mecanismo de remover ROS, espécies reativas de oxigênio
Temos nas intracelulares a ruptura da membrana do fagossomo, com escape para o
citoplasma, como citado acima. Ocorre também a inativação do ROS e NO, inativa
as espécies reativas de oxigênio e ácido nítrico, além da inibição da formação do
fagolisossomo, eles ficam dentro do fagossomo, mas não deixa que o fagossomo se
ligue aos lisossomos
Imunidade contra vírus:
Quando falamos de vírus, eles são obrigatoriamente intracelulares. A resposta para
eles é específica
Quando temos a linha tracejada no meio, é para separar a resposta imune
No gráfico acima, temos a resposta inata respondendo de maneira quase imediata.
São as primeiras coisas recrutadas pelo sistema imune para recrutar a infecção. No
caso do vírus, elas produzem INF-alfa e INF-beta, que são os INF do tipo 1. Esses
INF ajudam a deixar a célula infectada com vírus em um estado antiviral. Tipo de
célula dendrítica plasmocitoide (tem esse nome pois parece um plasmócito) não tem
os dendritos e é a principal produtora de INF de tipo 1. Além disso, temos as células
NK, que matam as células infectadas por vírus
Partindo para a resposta adaptativa, temos as células T citotóxicas (CTL) e temos
produção de imunoglobulinas (ou anticorpos) que irão fazer o processo de
opsonização, neutralização, etc
Conforme os dias vão passando da infecção, começamos a ter os CTL - TCD8 - e
os anticorpos, para tentar neutralizar o vírus e impedir que ele passe para outras
células
Inata - estado antiviral:
Estado antiviral: inibe a síntese proteica de vírus (pois nas infecções virais o vírus
entra na célula e faz com que a célula produza proteínas do vírus), além de
degradar o RNA do vírus, inibir a expressão dos genes do vírus e inibir a montagem
de novos vírus. Esse é o estado antiviral que o INF faz com que as células fiquem
Adaptativa:
Evasão da resposta imunológica pelos vírus:
1. Variação antigênica
2. Inibem a apresentação de antígenos
Variação antigênica: podem mudar seus antígenos de 2 maneiras:
● Mutações pontuais - Antigenic drift - gene que será mutado, leva à uma
mutação menor (pode ser chamada de Antigenic Drift)
Temos abaixo um exemplo de mutação pontual, com o vírus Influenza (da gripe).
Quando o vírus entra na pessoa, ele se muta e quando passa para outra pessoa ele
já está modificado. Por isso, é necessário tomar vacina para gripe todos os anos,
por conta das modificações
● Rearranjo de genomas - Antigenic shift - leva a uma mutação antigênica
maior, exemplo: 2 vírus ou mais se juntam em um hospedeiro e se misturam
em uma cepa nova (new strain), uma linhagem nova de vírus. Uma vez que o
genoma foi misturado, esse vírus acaba sendo um pouco mais potente (pode
ser chamado de Antigenic Shift). Esses rearranjos dos genomas ocorrem em
um hospedeiro vivo que esteja infectado com esses vírus
Abaixo temos um exemplo de rearranjo de genomas, temos a mistura de diversos
vírus que se rearranjam e formam uma cepa nova, muito mais potente (Influenza A
- H1N1, vírus da pandemia de 2009)
Temos, então, a inibição da resposta imunológicaO POXVÍRUS faz com que as células produzam moléculas que vão atuar como
antagonistas competitivas das citocinas. Quando ele liga, ele não deixa que a
citocina atue mas também não faz o mesmo trabalho que o dela
Consequentemente, se as citocinas não estão funcionando direito ou tendo uma
competição, a nossa resposta imunológica não será mais eficiente e o vírus
continuará a se multiplicar dentro do organismo
Existem vírus que fazem a inibição da atividade de proteassomo. O proteassomo
é uma organela das células que são responsáveis pela degradação de proteínas
(por exemplo, a citosólica da imagem sendo degradada em peptídeos). Os
peptídeos serão enviados para o retículo endoplasmático rugoso, o peptídeo entra
pelo TAP (transportador associado ao processamento do antígeno) e será
encaixado no MHC de classe 1, esse MHC de classe 1 junto com peptídeo recebe
uma vesícula, vem para o citoplasma até chegar na membrana plasmática e expõe
para o lado extracelular o peptídeo viral. Porém, se existe um processo de vírus que
inibem a atividade do proteassomo, não teremos peptídeos degradados a partir de
proteínas. Por mais que tenhamos vírus e proteína viral ali dentro, o nosso sistema
não consegue colocar os peptídeos no MHC para sinalizar para a célula TCD8, por
isso o vírus permanece ali dentro. Os vírus Epstein-barr e CMV (citomegalovírus)
fazem isso
Temos também o bloqueio na síntese do MHC e/ou retenção no retículo
endoplasmático: adenovírus, CMV humano. Por mais que entre o peptídeo
degradado, se ele entra e temos a síntese do MHC bloqueado ou preso no retículo,
o MHC não consegue ir para o citoplasma, chegar na membrana e avisar o sistema
imune. Por isso é mais um mecanismo de evasão
Temos também o bloqueio no TAP, o herpes vírus (HSV) faz exatamente isso, ele
bloqueia o TAP. Podemos até ter a proteína viral sendo quebrada, porém ele não
conseguirá entrar no MHC uma vez que o TAP está bloqueado
Na resposta imunológica normal frente à alguma doença, vamos ao hospital e
fazemos um hemograma, com os resultados alterados (aumentados normalmente).
Ao curar, o hemograma fica normal, as células voltam a quantidade normal pois elas
foram morrendo (as células do sistema imune morrem ao serem desativadas)
Quando temos uma infecção pelo EBV, esse vírus produz uma proteína homóloga
(semelhante) a IL-10, que é a citocina que inibe a resposta imune. A proteína
homóloga inibe a ativação de macrófagos e células dendríticas. Consequentemente,
temos uma resposta imunológica não eficiente
Imunidade contra fungos:
A parede do fungo é onde temos os principais PAMPs (quitina, mananas,
beta-glucanos)
Quando falamos de fungo, o fungo pode ser tanto um fungo extracelular (não entra
na célula) ou um fungo intracelular (entra na célula), eles tem os PAMPs (estrutura
que as nossas células não têm, serve para começar a resposta imunológica) na
parede celular do fungo, como demonstrado no esquema acima
A partir da resposta imune temos a fagocitose (neutrófilos e macrófagos fagocitam e
matam os patógenos fúngicos diretamente) e o sistema complemento (fagocitose e
MAC)
Resposta imune adaptativa:
● Ela pode ser uma resposta imune esterilizante (ou efetora) ou resposta
imunomoduladora. A esterilizante é como se esterilizassem os fungos dentro
do próprio sistema, acaba com os fungos. Ocorre quando a carga parasitária
do fungo é alta, quando temos muito dos antígenos de fungo, desenvolvemos
uma resposta efetora, irão ativar TH1 e TH17, acaba com a infecção
● A imunidade imunomoduladora é quando a carga parasitária do fungo é
baixa. Temos o desenvolvimento de células dendríticas imunomoduladoras,
que irão ativar a TH2 e a TREG, leva a infecção persistente
● Temos também quando alguém desenvolve AIDS (não o soropositivo e sim
quem desenvolveu a AIDS), ele desenvolve uma imunossupressão muito
grande, que leva à uma doença progressiva
A resposta imune esterilizante e a imunomoduladora dependem da carga antigênica
Monócitos, dependendo da citocina recebida, pode se diferenciar em uma célula
dendrítica ou em um macrófago
Aula 2 (23/08)
Anticorpos monoclonais
Não temos uma resposta imunológica monoclonal
Para simplificar, anticorpos são proteínas
Inicialmente, o microrganismo vai se ligar ao BCR (imunoglobulina de membrana,
nas células naive temos a IgM e a IgD - a célula B sabe fazer quando sai da medula
óssea, ela começa mudando suas cadeias de gene para expressar IgM e IgD,
quando a célula virgem encontra o microrganismo ele passa a se ligar BCR). O BCR
- receptor de célula B - é ou IgM ou IgD
O microrganismo é fagocitado, passa por vários processos e a célula se diferencia
em um plasmócito de vida longa produtor de imunoglobulina, que fará processos de
opsonização
Estrutura geral das imunoglobulinas:
A parte em vermelho é maior, por isso ela é chamada de cadeia pesada, sua
estrutura proteica é maior. A cadeia menor é a verde, ela é chamada de cadeia leve
Toda molécula de anticorpo de imunoglobulina encontramos 2 cadeias pesadas e 2
cadeias leves
Além da cadeia pesada e leve, também temos outras regiões no mesmo anticorpo
que precisam ser destacadas
A parte variável (amarela) é a que gruda no antígeno, ela é variável pois cada célula
B que tem no nosso corpo vai ter um BCR com uma região variável específica para
um determinado epítopo. A especificidade mora na região variável
A região constante é a mesma
Quando falamos, por exemplo, das diferentes IgG, a região variável é diferente. Mas
o que tem de igual e a região constante, isso que determina qual tipo de
imunoglobulina ela é
Regiões determinantes de complementariedade (CDR):
Segmentos hipervariáveis
Observamos o anticorpo, a parte em azul é a região constante, a região amarela é a
variável
Na região variável, se observamos com mais cuidado, temos algumas bolinhas
vermelhas. Essas bolinhas vermelhas são as regiões determinantes de
complementaridade (CDR), cada 1 delas chamamos de CDR1, CDR2 e CDR3. Eles
possuem cerca de 12 aminoácidos, é ali no CDR que mora a especificidade da
região variável
Existem anticorpos monoclonais que são usados em terapias, observamos a
importância do CDR nesses casos
A especificidade da região variável está nessas pequenas outras regiões chamadas
de CDR ou segmentos hipervariáveis
Resposta policlonal:
Se estamos doentes, por exemplo, infecção de garganta, por Streptococcus
pyogenes
É uma bactéria que são todas iguais e proliferam-se, crescendo a população no
tecido. Se observarmos com cuidado, vemos que na superfície delas existem outras
regiões (triângulo azul, bola vermelha, quadrado amarelo…) que representam
epítopos do microrganismo
Na natureza, não existe um microrganismo com todos os epítopos iguais
A região variável dela é específica para uma célula T. Mas, ela não consegue se
ligar em outro epítopo diferente (mesmo que seja na mesma bactéria)
Todas as células B produzem contra o mesmo antígeno, porém para epítopos
diferentes
Por conta disso, as respostas do nosso organismo são chamadas de policlonal - só
seria monoclonal se o microrganismo tivesse apenas um epítopo, isso não existe
Resposta monoclonal ou anticorpo monoclonal é uma técnica de laboratório, dentro
da gente não funciona dessa forma
Se injetarmos um antígeno qualquer em um mamífero, o que irá acontecer? No soro
do mamífero conterá vários anticorpos contra o mesmo antígeno, porém, para
epítopos diferentes
Como são feitos os anticorpos monoclonais?:
Tudo começou com Georges Köhler e Cesar Milstein, em 1975. O trabalho deles é
tão relevante que eles ganharam o prêmio Nobel de medicina
A base da técnica é conseguir células B que produzem anticorpos, com uma
especificidade conhecida. Sabemos que a célula que produz anticorpo é a célula B.
No laboratório, linfócitos B morrem muito fácil, para ela ficar viva in vitro precisamos
dar constantemente estímulos, diferente da célula tumoral (se crescer rápido
demais, precisa repicar para diferentes locais)
Já que a célulaB é uma célula fraca, e se tentássemos juntar com um tumor?
Dessa forma, eles deram origem à célula híbrida Hibridoma. O importante da célula
B é que ele produza anticorpo, enquanto a célula tumoral é importante para que o
hibridoma viva por muito tempo na cultura
O hibridoma possui características tanto dos linfócitos B, quanto das células
tumorais. Elas tem as seguintes características:
● Célula B imortalizada
● Capacidade de produção de anticorpos
● Longa vida da população celular
Como se chega a um hibridoma produtor de anticorpos cuja especificidade seja
conhecida?
O objetivo é produzir anticorpos monoclonais específicos para o antígeno X
Temos os seguintes passos para isso acontecer:
1. Clones da célula B
2. Ter a célula tumoral - existem laboratórios que cultivam o tumor, você
consegue comprando
3. Fazemos a fusão celular
4. Selecionamos as células fusionadas, nem todas grudam uma com a outra
5. Separamos os clones de hibridomas
6. Selecionamos os clones específicos
7. Expandimos os clones selecionados
Conseguimos o nosso primeiro passo (clones de células B específicas para o
antígeno):
Temos o antígeno X e injetamos em um mamífero, nesse caso, um camundongo
Em algumas semanas, retiramos o baço do animal (nesse baço do animal teremos
células B)
Quando injetamos um antígeno no animal, você espera que ocorra uma resposta
imunológica mais intensa contra aquilo que você está injetando. Nesse caso (da
imagem), é a célula B amarela
Esperamos que exista uma quantidade maior de células B contra aquilo que
injetamos (específicas para aquele antígeno)
Isolamos as células do baço macerando ele, prendemos ele com uma pinça e
fazemos com uma parte da agulha de injeção
Temos as células soltas no tubo
Agora com as células B, iremos cultivar as células tumorais que possam ser
fundidas com os linfócitos B do camundongo imunizado. Compramos elas e
escolhemos o tumor de um mieloma (é um tumor de célula B, ele foi uma célula B
um dia)
Em geral, fusões entre células similares são mais bem sucedidas do que fusões de
células diferentes, por isso a escolha do mieloma como fonte de células tumorais
As características do mieloma:
● Células neoplásicas - imortais
● Derivadas de linfócitos B
● Não secretam anticorpos
Realizamos a fusão da célula tumoral com a célula B específica
O simples co-cultivo das duas células é suficiente para induzir a fusão das duas
células? NÃO
Precisamos de um estímulo para essa fusão acontecer, temos 2 estímulos possíveis
para isso:
1. Meio de cultura com polietilenoglicol
2. Pulso elétrico
O polietilenoglicol, sendo um meio de cultura, as membranas plasmáticas de ambas
as células ficam mais permeáveis e elas se fundem de uma forma mais tranquila
O pulso elétrico é feito por um multiporador, temos a câmara de fusão
Selecionamos as células que fundiram (hibridoma), no 4 passo. Temos 3 tipos
celulares nisso:
● Células B não fundidas
● Mielomas não fundidos
● Hibridomas
Selecionamos os hibridomas da seguinte forma: “exclusão”
● Linfócitos B não vivem muito tempo em cultura sem estímulos
● Mieloma - adiciona meio HAT à cultura celular
Descobriram que o mieloma não vive bem no meio de seleção meio HAT -
hipoxantina, aminopterina e timidina
Para que a célula sobreviva nesse meio de cultura, ela precisa de uma enzima -
HGPRT e o mieloma não tem essa enzima, logo, ele não consegue metabolizar o
meio HAT e morre por ser um meio tóxico ao tumor
O hibridoma continua vivo pois o linfócito B possuía HGPRT, assim como o
hibridoma. Logo, ele é capaz de sobreviver nesse meio
Agora, temos o 5º passo: encontrar e separar os clones de hibridomas certos, que
irão produzir anticorpo específico para o antígeno X
Encontramos os hibridomas da seguinte forma: realizamos diluições em série de
modo que a concentração final das amostras seja 1 célula por poço:
Pegamos a placa de cultura, colocamos em um microscópio e olhamos para ver se
tem apenas um hibridoma em cada. Se tiver 2 células ou 3, não podemos continuar
o experimento, ou descartamos ou pipetamos e separamos as 2 células, tendo
certeza que nessa placa terá apenas 1 hibridoma por poço
A1 (primeira célula) é então cultivada e dá origem a uma população homogênea de
células secretoras de anticorpos que possuem a mesma especificidade
Enquanto as células proliferam, elas também produzem anticorpos
Os anticorpos são, então, monoclonais. Cada poço é composto por anticorpos
monoclonais, chamamos eles dessa forma pois veio de um só
Todos os anticorpos produzidos pelos hibridomas não tem a mesma especificidade
pois cada hibridoma é de um clone que não conhecemos
Temos que testar a especificidade de cada anticorpo para encontrar o anticorpo
anti-X que é o certo, sendo a etapa 6:
Fazemos por ELISA - teste imunoenzimático, a placa de ELISA é semelhante a
placa de cultura de cultivar células
No 6º passo, separamos os anticorpos
Pegamos os tubinhos com os anticorpos e colocamos cada um na placa de ELISA
Se algum daqueles tubos tiver o hibridoma produzindo o anticorpo contra o
antígeno-X, o anticorpo se liga e o teste de ELISA da positivo - muda a cor
(branco/azul claro negativo, azul escuro ELISA positivo)
O sétimo passo é para expandir a população do hibridoma que produza o antígeno
X
Essas células em cultura produzem anticorpos, esses anticorpos são os nossos
anticorpos monoclonais de interesse
Podemos utilizar os anticorpos monoclonais para:
● Fenotipagem celular - teste de citometria de fluxo
● Diagnóstico
● Terapia
● Pesquisa
Para terapia, as doenças que já usam o monoclonal são câncer, inflamação, doença
cardiovascular, doenças autoimunes, rejeição a transplantes
Como o anticorpo monoclonal dá um trabalho muito grande para conseguir ele, são
medicamentos bem caros
Há algum efeito colateral? - anticorpos murinos são vistos pelo sistema imune do
paciente como estranhos, o sistema imune enxerga o anticorpo como estranho por
ter sido feito em um camundongo, por exemplo. O sistema imune irá realizar o
HAMA - anticorpo humano anti-anticorpo de camundongo (Human Anti-Mouse
Antibody)
Usam esse tipo de tratamento para substituir a quimioterapia
● Os anticorpos podem ser rapidamente eliminados
● Teremos a formação de complexos imunes, que pode depositar nos rins e
leva a glomerulonefrite
Pensando nisso, os pesquisadores realizaram pesquisas para reduzir o problema do
HAMA
Desenvolveram um anticorpo quimérico, a região constante é humana produzida
pela região molecular, apenas a região variável é murino
Melhoraram ainda mais, deixando a região constante e variável humana e apenas o
CDR como murino. Existem, também, anticorpos monoclonais totalmente humanos
Nomenclatura e biofármacos:
O prefixo é formado por uma sílaba que define o nome do biofármaco, seguido por
outra que define o alvo ou a doença de indicação
O sufixo é formado por uma ou duas letras que identificam a fonte do anticorpo,
seguido pela sílaba “mab” (monoclonal antibody)
Histórico de anticorpos monoclonais pelo FDA:
Aula 3 (30/08)
Técnicas em imunologia
As aplicações podem ser feitas em pesquisa científica ou para diagnóstico
Reação de precipitação: em química, o precipitado é uma substância que foi
formada pela reação, que é insolúvel. Ou seja, precipitado é um sólido que se forma
e deposita no meio de uma solução líquida
A interação anticorpos+antígeno forma um precipitado visível
Quando temos anticorpo e antígeno, vai formar uma rede que pode desenvolver
esse precipitado visível
A quantidade de precipitado que vai ser formado depende de:
● Fatores físico-químicos (pH, temperatura)
● Imunológicos (tipo de Ag e Ac)
● O que principalmente influencia no precipitado: concentrações relativas do
antígeno e do anticorpo equivalentes (zona de equivalência)
A zona de equivalência é onde a precipitação é máxima
Os tracinhos em azul são os anticorpos e a bolinha vermelha o antígeno,
percebemos que na primeira situação temos mais anticorpo e menos antígeno, issonão está equivalente
No outro extremo, temos mais antígeno do que anticorpo, também não está em
equivalência
Ou seja, quando não temos equivalência na quantidade dos anticorpos e dos
antígenos, a precipitação não é tão boa
Quanto mais anticorpo eu tenho e menos antígeno, o precipitado é muito pequeno,
conforme igualamos, o precipitado vai crescendo até atingir a equivalência
Isso também serve para quando temos mais antígeno do que anticorpo
Teremos um excelente precipitado quando temos a mesma quantidade de
anticorpos para os antígenos, chegamos na maior precipitação
Com isso em mente, temos alguns exemplos de imunoprecipitações:
1. Imunodifusão simples
2. Imunodifusão radial dupla
3. Imunodifusão radial simples
Imunodifusão simples:
Pegamos um tubo de ensaio e enchemos ele com ágar ou agarose, fazemos um gel
a partir do ágar
Pegamos um tampão (bio mol), misturamos com o ágar (esquentado pelo
microondas) dissolvido. O gel é o tampão + o ágar, deixamos o ágar esfriar e ele
polimeriza
Quando ele esfria, pipetamos no gel o anticorpo
Conforme a amostra vai penetrando no gel (que é poroso), temos anticorpos nesse
gel. Quando ele gelifica, temos anticorpos distribuídos nesse gel
Se a nossa amostra tiver o antígeno para aquele anticorpo, a amostra começa a
entrar no gel. Esperamos que o antígeno presente na amostra comece a encontrar o
anticorpo específico, começa a grudar um no outro até termos uma equivalência,
formando um precipitado
Uma das limitações dessa técnica é justamente o tempo, leva cerca de 1 semana
para ter esse resultado. É um teste que funciona, te da um resultado, mas ele é um
teste antigo (de 1946), o nome é método de Oudin e ele é extremamente demorado
Imunodifusão radial dupla:
Podemos chamá-la de método de Ouchterlony, foi descoberta em 1947
Não pipetamos o anticorpo no gel e também não colocamos em um tubo, colocamos
em uma placa de Petri
Depois, pegamos esse gel e fazemos alguns buraquinhos nele
Esses buracos (orifícios) podem ser feitos com o fundo da ponteira da pipeta, temos
um orifício central e os orifícios ao redor
No buraco do meio, do orifício central, vamos pipetar o anticorpo. Nos buracos ao
redor (periféricos), colocamos a amostra
O anticorpo se espalha para todos os lados, assim como a amostra colocada nos
buracos periféricos
Em um certo momento, o anticorpo do meio que está se difundindo pelo gel e as
amostras que também estão se difundindo = vão se encontrar
Quando eles se encontram, se a amostra for positiva, um liga no outro. Observamos
a precipitação com “riscos”, arcos precipitados
Temos o orifício central, o anticorpo, a difusão para todos os lados e o antígeno
fazendo a mesma coisa. Quando eles se encontram, temos a ligação formando um
precipitado com zona de equivalência
Essa técnica é para diagnóstico de:
● Candidíase
● Paracoccidioidomicose
● Cisticercose
A limitação dele é que demora até 48 horas para difusão e que a reação ocorra
Imunodifusão radial simples:
Método de Mancini e Fahey, de 1965
Também fazemos o gel como feito nos outros
Nesse gel colocamos o anticorpo anti-antígeno que estamos procurando. Quando
pipetamos a amostra que será testada, a amostra que foi colocada no local vai se
difundir entrando para o gel
Sendo uma amostra positiva, formamos um halo (anel) de precipitação
Se pegarmos essa amostra e diluir, por exemplo, em 8 vezes, diminuímos esse
halo. Quanto mais diluímos a amostra, menor fica o halo
Esse teste pode ser utilizado para diagnóstico de:
● Coccidioides immitis
● Paracoccidioides brasiliensis
● Histoplasma capsulatum
Reações de aglutinação:
São exemplos de reação de aglutinação:
● Widal (para Salmonellae)
● Wright (para Brucellae)
● Weil-Felix (para Richettisiae)
● Plasmodium
● Leishmania
● Toxoplasma
● Candida
● Aspergillus
● Cryptococcus
● Toxoplasmose
Aglutinar = juntar
Para essa reação, pegamos partículas que podem ser aglutinadas. Precisamos de
partículas maiores do que a das precipitações, Podemos pegar eritrócitos, bactérias,
fungos e látex, partículas que teremos a agregação visível
Podemos fazer a aglutinação de duas maneiras:
1. Aglutinação direta - queremos aglutinar diretamente a própria bactéria, o
próprio fungo e o próprio protozoário. Pegamos diretamente o microrganismo
2. Aglutinação indireta - a aglutinação indireta é quando você pega uma
hemácia e nessa hemácia iremos sensibilizá-la, por exemplo, com antígenos
do toxoplasma
Ou seja, a reação pode ser feita de 2 maneiras: com o próprio toxoplasma ou
sensibilizando uma célula humana com o antígeno do microrganismo
O fundo dessa placa de 96 poços é um fundo chato, quadrado. Numa placa de
aglutinação é diferente, em V ou U
As hemácias estão sensibilizadas pelo toxoplasma. Colocamos uma amostra de
sangue, digamos que ela seja negativa. Se ela for negativa, isso significa que a
pessoa não entrou em contato com o toxoplasma (por exemplo) e ela não tem
anticorpo para isso, logo, ela é negativa para aquele anticorpo. Essas hemácias
sensibilizadas não grudam em ninguém e vão para o fundo do poço, pois não
aglutinaram. Vemos apenas um pontinho no fundo do poço da placa
Se ela for positiva, pipetamos o soro na placa e, para ser positivo, a pessoa entrou
em contato com o toxoplasma, logo, ela tem os anticorpos. Quando pipetamos o
soro da pessoa que tem o anticorpo, esse anticorpo gruda nas hemácias (que foram
sensibilizadas pelo antígeno do microrganismo). Consequentemente, teremos um
aglutinado = uma rede, faz com que o complexo não afunde
Inibição da aglutinação:
Observamos no esquema abaixo a urina e anticorpo anti-hCG, que é um hormônio
da gravidez. Usamos esse exemplo para falar da técnica de inibição da aglutinação
Incubamos a urina com anticorpo primeiro, eles são colocados em uma placa e
então adicionam uma partícula revestida com hCG
O amarelo é a partícula e o vermelho o hCG
A técnica, primeiro, se ela estiver grávida, ele gruda no hCG na urina e adiciona-se
a partícula revestida de hCG
Depois da primeira incubação, o anti-hCG gruda no hCG na urina
Adicionamos, então, a partícula com hCG. Se na urina tem o hCG, o anticorpo está
grudado e não está disponível, por conta disso, não observamos aglutinação na
partícula revestida com hCG
Dessa forma, inibimos a aglutinação
Em um teste negativo, a urina da mulher está limpa. Logo, o anti-hCG não se gruda
em nada
Adicionamos, então, a partícula revestida. O anticorpo que não foi usado (pois na
urina não tinha hCG) passa a grudar nas partículas e temos a aglutinação
Reação de fixação do complemento:
Para diagnóstico de:
● Mycoplasma pneumoniae
● Leptospirose
● Doença de Chagas
● Infecções por alguns vírus respiratórios: influenza A e B, parainfluenza,
adenovírus e arbovírus
Na via clássica, ela precisa de anticorpo IgM ou IgG. O anticorpo liga na bactéria,
vai vir a primeira proteína que vai grudar e ela é chamada de C1, depois disso, a C4
e C2, mas tudo começa com o anticorpo. No final, vem a C9 que abre um poro, que
é chamado de MAC (complexo de ataque à membrana)
No final, diferenciamos as 3 vias do sistema complemento de acordo da forma que
elas começam. Mas no final de cada via temos sempre a formação do MAC, o
microrganismo é lisado e morre
O teste positivo: temos a amostra com anticorpo, no sangue da pessoa temos o
anticorpo (ela está positiva para um dos microrganismos que queremos checar). Em
sequência, colocamos nesse tubo o antígeno com proteínas da via clássica do
sistema complemento
Nesse momento, temos a bactéria, na amostra tem o anticorpo e pode se ligar à
bactéria. Adicionamos proteínas do sistema complemento e, por conta disso,
começa a desencadear a cascada do sistema complemento. Ou seja, utilizamos o
sistema complemento nesse teste
Continuando o teste, acrescentamos hemácias que já estão opsonizados (o azul é o
anticorpo). Adicionamos a hemácia no tubo
A hemácia, por sua vez, não terá reação. O sistema complemento já foi usado para
degradar o microrganismoSe tivesse o sistema complemento livre, a C1 iria grudar no anticorpo da hemácia,
iria desencadear a cascata e teríamos o rompimento da hemácia
Quando é um teste positivo, observamos nenhuma diferença no teste - não tem
hemólise
Teste negativo: a amostra não tem anticorpo pois a pessoa não entrou em contato
com o microrganismo. Quando adicionamos o antígeno e as proteínas do sistema
complemento, nada irá acontecer
O antígeno e as proteínas do sistema complemento estão livres, já que não tinha o
anticorpo do começo
Quando colocamos a hemácia que está opsonizada com o anticorpo, a hemácia é
degradada pois o sistema complemento será ativado. Logo, observamos hemólise
O tubo encontra-se hemolisado, já que o sistema complemento atuou nas hemácias,
destruindo-as
Aula 4 (06/09)
Teste de ELISA
ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay
Ensaio imunoenzimático
Imunoenzimático lembra algumas coisas - quando falamos de ensaio, é um ensaio
de teste. O imunoenzimático é que algum componente do sistema imunológico (é o
anticorpo) será utilizado para esse ensaio, enzimático é porque utilizamos uma
enzima para esse teste, a enzima é a que está conjugado ao anticorpo
Para ser um teste de ELISA, esses 2 componentes (anticorpo conjugado à enzima)
estarão sempre presentes
Os poços mudam de cor conforme resultado positivo
É uma técnica imunoenzimática, pois usamos um componente do sistema imune e
uma enzima por tipo de teste (por exemplo, a peroxidase e a fosfatase alcalina),
baseada na utilização de antígenos e anticorpos marcados com a enzima.
Permitem:
● Detecção - de toxinas de microrganismos, proteínas liberadas no meio
● Titulação - titulação de quanto de anticorpo o seu organismo está produzindo
para um microrganismo
● Quantificação - de substâncias de interesse biológico
Colocamos em cada poço uma quantidade de célula B, promovemos estímulos
diferentes em cada poço. Depois de um tempo, fazemos uma cinética e dosamos os
anticorpos por ELISA
Quando temos um anticorpo e ele ligado à algo, como uma enzima, falamos que
esse anticorpo está conjugado
As enzimas que podem ser utilizadas são a peroxidase e a fosfatase alcalina
O que é necessário:
● Antígeno purificado (se for para detecção ou quantificação do anticorpo)
● Anticorpo purificado (se for para detecção ou quantificação do antígeno)
O ELISA sempre é feito em uma placa de ELISA, contendo 96 poços (assim como
placa de cultura e aglutinação), mas ela é achatada no final (quadrado)
O antígeno purificado significa que você vai procurar anticorpo - exemplo: HIV, as
células B do organismo passam a produzir anticorpos contra o HIV, mesmo que não
funcione. Para descobrir se uma pessoa está ou não com HIV, o teste de triagem
padrão é o ELISA. No fundo do poço da placa, teremos as partículas do
microrganismo (em verde)
A proteína é chamada de recombinante, colocamos ela no fundo da placa. São
proteínas do vírus que estamos procurando
Em sequência, pegamos o sangue da pessoa. Se essa pessoa tiver o HIV no corpo
dela, ela terá anticorpos anti-HIV. Quando colocamos o soro ali dentro, o anticorpo
gruda (em roxo)
Por esse teste, temos anticorpos no sangue de alguém, indicando que esse alguém
está com aquela doença. Nesse exemplo, o vírus da AIDS. Detectamos os
anticorpos nesse teste
Se, por exemplo, quisermos identificar TNF, o teste será feito com TNF. Para
detectá-lo, sensibilizamos a nossa placa com anticorpos monoclonais anti-TNF. Em
sequência, jogamos o sangue da pessoa, se a pessoa tem TNF irá grudar.
Colocamos o anticorpo secundário anti-TNF, conjugado com a enzima, quando
colocarmos ele reage e o poço fica colorido
Esse ELISA é diferente pois “forramos” com um anticorpo primário, jogamos o
sangue e ele gruda, colocamos um anticorpo secundário e esse sim é conjugado
com a enzima
O anticorpo anti-HIV estava no corpo da pessoa, então ele não tem enzimas
Temos soluções-padrão de controles positivo e negativo - temos os diversos
poços, em alguns deles, colocamos uma amostra que temos CERTEZA que tem o
que desejamos estudar. Chamamos ela de controle positivo
Precisamos também da placa de 96 poços, o anticorpo conjugado a uma enzima e o
substrato da enzima. Precisamos também de um leitor de ELISA, já que ela muda
de cor, o nosso olho não é possível identificar
Existe os testes direto e indireto
ELISA Direto:
Realizamos primeiro a sensibilização, é a primeira coisa que devemos fazer -
pipetar na placa
Pipetamos um tampão - PBS + 0,05% de Tween, ele dissocia as ligações mais
fracas - é a lavagem, evita falsos positivos
Bloqueamos sítios inespecíficos da placa que ficaram vazios
São microsespaços que podem existir, para isso não acontecer, bloqueamos esses
espaços. Se não bloqueamos, o anticorpo secundário pode se ligar no fundo da
placa, mudar de cor e acender pois não bloqueamos os espaços, dando um falso
positivo
Para bloquear os sítios reativos (espaços da placa), podemos usar leite desnatado,
albumina bovina, gelatina, soro fetal bovino, etc.
Ao bloquear, impedimos que os anticorpos secundários cheguem no fundo da placa
e fique ligada lá
Colocamos então a amostra que será testada, pode ser um soro ou sobrenadante
de cultura
Só gruda o que for específico
Realizamos a lavagem e sai tudo que não for específico para o anticorpo primário
Jogamos o anticorpo secundário que irá grudar no antígeno específico, com enzima.
Se você não fizer o bloqueio, ele pode grudar no fundo da placa
Temos os substratos, que são usados para finalizar o teste
O produto da
reação será em forma de cor
Passo a passo rápido: colocamos o anticorpo primário e ele realiza a sensibilização,
lavamos, colocamos o bloqueador de sítios específicos. Em seguida, jogamos o
soro
O primário é anti-o que queremos descobrir, por exemplo, o TNF
ELISA Indireto:
Sensibilizamos a placa com o antígeno livre de impurezas, diferente do direto que
era com anticorpo
Em seguida, bloqueamos os sítios específicos e adicionamos o soro
Colocamos um anticorpo anti-anticorpo já conjugado com a enzima
O ELISA tem que ter o anticorpo e a enzima
Podemos verificar se tem e podemos saber, também, exatamente o quanto tem
As vantagens são:
● Especificidade
● Sensibilidade
● Rapidez
● Possibilidade de realizar vários testes de uma só vez
Western Blotting:
É uma técnica realizada para achar proteína
Podemos pegar células tumorais, por exemplo, e extrair suas proteínas. Fazemos
isso para saber se aquele tumor tem uma proteína para deixá-lo vivo
Usado para identificar e determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma
proteína em uma mistura de proteínas ou de outras moléculas
Para fazer o Western Blotting, precisamos identificar a proteína em um lisado celular
O lisado é submetido a SDS-PAGE para separar as proteínas
O SDS-PAGE é um gel
Para fazer o Western Blotting, temos um grande suporte:
Montamos primeiro a placa de vidro uma sobre a outra, para que elas não grudem
A nossa amostra é o lisado proteico
O gel é montado entre 2 placas de vidro
As proteínas começam a correr pelo gel quando ligamos na tomada e damos a
voltagem correta. As proteínas começam a descer pelo gel
Quando colocamos o extrato protéico ali e ligamos, separamos as proteínas pelo
peso molecular. As maiores ficam pra cima e as menores para baixo
No Western, também temos um padrão de peso molecular. Compramos
Primeiro, sempre pipetamos o padrão de peso molecular - usamos pois sabemos o
peso delas, para identificar o peso da proteína desconhecida
Temos o gel, a linha branca é a membrana (abaixo)
Colocamos uma do lado da outra, colocamos na fonte e damos o choque, as
proteínas no gel passam de um lado para o outro
As proteínas que estavam no gel são transferidas para a membrana
Se tiver a proteína, o anticorpo gruda na membrana, no local exatamente onde está
a proteína específica do lisado celular que queremos estudar
Lisamos as células, colocamos o extrato no gel, separamos as proteínas no extrato
molecular. Recortamoso papel, colocamos em cima do gel, damos o choque,
transfere tudo do gel para a membrana. Em seguida, jogamos o anticorpo
anti-proteína que está sendo procurado (exemplo, anti-BCL-2). Se tiver a proteína,
ele gruda e faz o risquinho na membrana
Para HIV, fazemos o Western Blotting para confirmar o resultado
Jogamos o sangue da pessoa direto na membrana, se a pessoa tem anticorpo
anti-HIV no sangue dela, ele irá grudar na proteína do HIV da membrana. Jogamos
o anticorpo secundário e detectamos ali
No tecido, o organismo aparece como leveduras pleomórficas de 2 a 10 μm, com
brotamento. Em alguns pacientes, esporotrix pode filamentar (não é comum)
Aula 5 e 6 (20/09 e 04/10)
Citometria de Fluxo
A citometria também é utilizada para contar, examinar e classificar partículas
microscópicas (células) suspensas em meio líquido em fluxo
Podemos utilizar sempre em células individuais
Precisamos do equipamento - citômetro de fluxo
Fluorocromos, geralmente, são acoplados em anticorpos
O citômetro coleta os dados, filtra e converte
Solução salina, colocamos um tampão e as células vão passando
Detector - FSC
Por enquanto, temos o dado sobre o tamanho da célula por conta do FSC
Muito mais conteúdo, mais granulosa, independente do seu tamanho
Gráfico de tamanho por granulosidade:
Células já purificadas no tubinho
Ou seja, ela tem tamanho 3 e granulosidade 2
Os pontinhos aparecem aos poucos no citômetro
Mais acima, mais granulosas
Mais deslocadas para a direita, maiores as células
Colorimos depois, ele aparece sempre preto e branco
Parâmetros mais específicos que tamanho e granulosidade:
FACS (fluorescence-activated cell sorter)
Fluorescências associadas a anticorpos monoclonais
Fluorocromos:
● Inicialmente, encontrados em repouso
● Excitados por fonte luminosa (o laser)
● Emitem uma luz de comprimento de onda (cor) característica
O laser argônio produz uma luz azul, porém podemos ter outros tipos de lasers em
outros tipos de citômetros
Conjugamos o fluorocromo no anticorpo e, então, vemos a célula marcada após se
juntar com o anticorpo
O gráfico serve para falar das populações de células gerais, não consegue
diferenciar cada uma. Sabemos que tem linfócitos B e T, mas por esse parâmetro de
granulosidade, não sabemos quem é B e quem é T
Como diferenciar as células por parâmetros mais específicos:
Normalmente, utilizamos os anticorpos monoclonais associados aos fluorocromos,
possibilitando utilizar e quantificar de forma específica quem é linfócito B, T, quem é
TCD4, TCD8…
Para fazer a combinação, os fluorocromos têm taxa de emissão (quando excitados
pelo laser) são diferentes. São excitados pelo laser de argônio
Porém, ao falar de emissão máxima, cada um deles tem uma máxima emissão (nm)
diferente, gerando cores diferentes. Conseguimos usar diferentes anticorpos
monoclonais com diferentes fluorocromos no mesmo citômetro de fluxo, porém, não
conseguimos utilizar fluorocromos cuja cor seja parecida, já que os picos de
emissão são semelhantes e geram a mesma cor, assim, não saberemos de forma
específica qual é qual
Cada célula tem uma molécula
O anticorpo anti-X se liga em toda célula que possui o X em sua superfície, da
mesma forma que o anti-Y se ligará em todos com Y
Se quisermos analisar em um gráfico, geralmente esse gráfico aparecerá da
seguinte forma:
Em cima, vemos apenas o anticorpo anti-X ligado à célula, enquanto embaixo
vemos o anti-Y. Fica PE por FITC, podemos alterar o gráfico
Na parte de baixo, observamos a célula D, que não foi marcada por nada
Teremos, no final, a seguinte leitura:
Região simples positivo (PE), duplo positivo (para FITC e PE), região duplo negativo
(não expressa nenhuma das 2) e simples positivo FITC
Imunofenotipagem por citometria de fluxo:
Pegamos as células, são incubadas com os anticorpos, passa pelo citômetro de
fluxo. Teremos o seguinte gráfico:
A região duplo positivo está vazia pois não existe nenhuma célula para encontrar
CD4 e CD8 ao mesmo tempo. Durante uma das fases de maturação, ela irá
expressar os 2, apenas no timo antes da fase de maturação propriamente dita
Toda célula T tem CD3, logo, teremos duplo positivo nessa possibilidade
Existem fluorocromos não associados a anticorpos
No histograma vemos apenas sobre um ponto, podemos sobrepor vários
Quanto mais deslocado, maior a fluorescência
A diferenciação é feita por anticorpos monoclonais com fluorocromos
Após Ig-M:
Isso é no caso de ter as células purificadas, se tivéssemos elas misturadas,
teríamos um pico extra (região de célula que não marcaram para Ig-M - células T)
Quanto mais alto o pico, mais célula eu tenho
Gates - delimitação da população celular
Instruímos o citômetro para células positivas/negativas, teremos placas defletoras,
que irão atrair as células marcadas (positivo para negativo e negativo para positivo).
Assim, teremos as células distribuídas em tubos diferentes, as que não são
marcadas com nada serão descartadas
Aula 7 (25/10)
Diagnóstico laboratorial das hepatites virais
A hepatite é uma inflamação do fígado, pode ser alcoólica. Dependendo do agente
que está causando, podemos ter uma cura apenas com repouso (por exemplo,
hepatite A). Algumas outras (B e C) requerem tratamentos prolongados de meses,
porém, após a sorologia, o indivíduo pode não ter sido curado mesmo após meses
de tratamento
Temos vacinas para hepatite A e B, a doença em si é uma doença muito grave, o
fígado é um órgão muito importante. A vacina é gratuita então é importante tomar, a
vacina é feita em 3 doses
A infecção é fecal oral, muito provavelmente podemos nos comunicar. É um vírus
mais endêmico na amazônia, a hepatite A é frequente. A vacina da hepatite A é via
fecal oral, então você precisa comer/beber algo contaminado
Hepatite B é endêmica em São Paulo
Às vezes, é necessário um transplante de fígado. Os transplantados tomam
imunossupressores, por mais que seja semelhante à genética, podemos ter uma
rejeição àquele enxerto. Isso não é interessante para ninguém, já que o seu fígado
não estava funcionando, se o sistema imune atacar o novo fígado, você terá novas
complicações
A hepatite B é contraída a partir de secreções e sangue, logo, pode ser considerada
uma IST
Os agentes etiológicos são:
Hepatite A:
É causada por um vírus de RNA, é transmitida pela ingestão de água e alimentos
contaminados
É um caso muito grave no norte do país, a água já é raro nas regiões, então não é
possível descartar a água
A evolução dela é muito benigna, não tem um índice de morte muito grande. Ela não
cronifica, diferente de B e C
A hepatite A pode ser aguda, onde você cura, ou você morre (fulminante). A
fulminante é comum em indivíduos imunocomprometidos, gestantes...
Ela não cronifica
Geralmente, quem se contamina são as crianças, como seu sistema imune é bom,
ela costuma curar
A criança tem icterícia, esclera e mãos amareladas, colúria (urina fica escura), o
prognóstico dela é muito benigno
Existe vacina
Resultados sorológicos:
Reagente é positivo
Na fase aguda, teremos IgM. Encontramos IgM na fase aguda pois o IgM é o
primeiro anticorpo que detectamos, pois a célula B, quando aprende a fazer
anticorpo na medula óssea, o primeiro anticorpo que ela aprende a fazer é a IgM
Anti vírus da hepatite A total (anti-HAV total) também aparece positivo
A célula faz switch de classe, a primeira classe é IgM, se for vírus teremos uma
resposta IgM e em seguida IgG. A imunidade é quando estamos imunes, logo,
teremos HAV total e IgG
Encontramos IgG pois já passou a fase aguda e a pessoa já está curada
O indivíduo que é suscetível, será não reagente pois nunca entrou em contato com
o vírus - nunca entrou em contato nem vacinou
O IgM pode ficar até 6 meses, quando o indivíduo cura (se ele não morrer), teremos
então IgG positivo, identificando proteção contra nova infecção para o vírus da
hepatite A
Hepatite B:
Temos 6 marcadores para hepatite B
É provocada pelo HBV, é de duplafita de DNA
65% desenvolve um doença subclínica e podem se recuperar, alguns tem hepatite
aguda e 1% morre. 5% são portadores, logo, podem transmitir e temos 4% de
hepatite crônica
A partir da cirrose podemos ter um alto índice de carcinoma, levando a morte
O grande risco é a cronificação
O diagnóstico é pelo método de elisa
Partícula viral: é um vírus envelopado, esse envelope na membrana tem um
antígeno chamado de HBsAg, significa que é o antígeno na superfície viral
Temos também o antígeno do core, é o HBcAg
Além deles, temos o HBeAg, é o antígeno E
Na hepatite B, temos então 3 antígenos. Para esses 3 antígenos, temos os
anticorpos. Então temos:
● Anticorpo anti-HBs
● Anticorpo anti-HBe
● Anticorpo anti-HBc
O antígeno E está entre o capsídeo e o envelope, são proteínas na matriz
As fases que cada um aparece: o HBs se torna detectável de 2 a 6 semanas após a
infecção
É o primeiro marcador a ser detectado no sangue
Quando o indivíduo cura, espontaneamente ou por tratamento (com remédio),
temos o desaparecimento do HBs, visto que o paciente não está mais infectado. O
anticorpo anti-HBs começa a ser detectado
O anti-HBs é o único marcador de imunidade, presente nos indivíduos vacinados e
nos que curaram
Em situação que há evolução para doença crônica, o HBs persiste e não teremos
detecção do anticorpo anti-HBs, visto que o vírus não saiu
O próximo antígeno é o HBe, ele se torna detectável após o HBs. Ele é indicador de
replicação viral
Em situação de cura, o HBe desaparece e o anticorpo anti-HBe aparece
Quando a doença cronifica, também temos anticorpo anti-HBe
O terceiro marcador é o anti-HBc, é um indicativo de infecção recente - fase aguda
da doença, aparece como IgM anti-HBc
Gradativamente, surge o IgG anti-HBc e após 4 a 6 meses, todo IgM é substituído
pelo IgG
Em situação de cura, os marcadores ficam assim:
Quando a doença evolui para forma crônica, o perfil sorológico fica assim:
A cronificação da doença apresenta HBs, HBe e o anticorpo anti-HBe. O IgM vira
IgG e permanece
Hepatite C:
O vírus da hepatite C é considerado uma epidemia silenciosa, você não tem sintoma
por até 30 anos e o fígado é destruído aos poucos. Os sintomas só aparecem
quando o fígado está em um estado avançado de deterioração
É um vírus envelopado também, é de RNA de fita simples
Os possíveis desfechos:
Ela tem cura, porém, ela é silenciosa e às vezes o tratamento não adianta,
dependendo da evolução. Quase sempre é necessário o transplante
O diagnóstico na forma aguda temos anti-HCV, sendo o IgM, enquanto na fase
crônica encontramos IgG
A partir de elisa com resultado reagente, realizamos o western blotting e podemos
fazer uma genotipagem (para indicar o tratamento) se for positivo, se for
indeterminado fazemos o PCR para confirmar, se o blotting der negativo, podemos
ter um falso positivo na ELISA
Hepatite D:
Sozinha, ela não causa nada. É um vírus defeituoso, ele só infecta se a pessoa já
estiver com hepatite B
A contaminação é por relação sexual sem preservativo ou utilizando objetos
cortantes contaminados
Também é chamado de hepatite delta, ele é totalmente dependente da co-infecção
da infecção pelo vírus da hepatite B para sua multiplicação. Ele precisa do HBs
Quando o indivíduo está com hepatite B e se contamina com a delta, ai a doença é
muito mais grave e muito mais rápida, em relação à evolução da doença
O diagnóstico é tranquilo
Total é basicamente IgG, a maioria dos casos o que encontramos sempre é IgG
Hepatite E:
É muito parecida com a hepatite A
Ele é endêmico na índia, no Brasil não temos esse vírus
A doença não cronifica
Encontramos apenas IgG já que ela não cronifica
Aula 8 (01/11)
Imunologia do HIV
Falamos o HIV, não o vírus HIV (o vírus já está na sigla)
O HIV é um vírus que se comporta como os outros, não conseguem se replicar
sozinhos e precisam de uma célula hospedeira e são parasitas intracelulares
obrigatórios
O vírus pode ser de DNA ou de RNA, podendo ser de simples ou dupla fita cada
O HIV é considerado um vírus nu, pois não tem envelope
O primeiro passo para replicação é ele se ligar a um receptor na célula do
hospedeiro, em seguida, ele penetra. Existem vírus que apenas injetam o material
genético dele para dentro da célula. No HIV, o capsídeo entra todo
Temos então a fase de síntese, fazendo mais material genético viral, para ter a
montagem desses vírus e o empacotamento. Quando a célula já montou tudo, ela
libera todos
A AIDs é a síndrome da imunodeficiência adquirida, o HIV mata o seu sistema
imune
Temos 2 tipos: o HIV do tipo 1, que está espalhado no mundo
O HIV do tipo 2 está na Índia
Do tipo, teremos os grupos: no tipo 2 vai do A ao H, enquanto em relação ao HIV do
tipo 1 teremos os grupos (M, N, O, P) e os subtipos
CRF/URF = o CRF é a forma recombinante circulante. Quando eles acham uma
forma em apenas 1 indivíduo, eles chamam de URF = forma recombinante única
Os subtipos são APENAS do grupo M, os outros não tem subtipos
Teremos sub-subtipos também do A e do F, conforme eles acham cepas diferentes,
essa tabela vai aumentando
Estrutura do HIV-1:
A parte mais exterior é o envelope, nele, encontramos glicoproteínas
Gp120 = glicoproteína de peso molecular 120. É importante para a infecção
Gp41 = ajuda no processo de infecção, vem depois da gp120
Teremos a matriz (proteínas) e o capsídeo (dentro fica o material genético)
2 fitas de RNA separadas
Temos, também dentro do capsídeo, a transcriptase reversa.
Ele tem também outras enzimas, a p10 (é uma protease = responsável por clivar
outras proteínas) e a integrase (integra alguma coisa)
Com relação ao material genético do vírus (HIV-1), ele é relativamente simples mas
tem alguns genes importantes. O env, por exemplo, faz um RNA que, a partir dele,
irá construir uma proteína. Ele codifica uma proteína para o envelope viral = gp160
A proteína p10 quebra a gp160 em 2 fragmentos, a gp120 e a gp41. O gene env
codifica uma proteína do envelope, que é a 160, a p10 vem e quebra ela em 2
fragmentos
Temos também o gene gag, que codifica para nucleocapsídeo e proteínas do core.,
temos a p55, que é a precursora. A p55 é quebrada pela p10 em 4 fragmentos
Essas proteínas estão no capsídeo e na matriz
O gene pol codifica para enzimas virais
A p66 e a p51, juntas, formam a transcriptase reversa
As diferenças entre HIV-1 e HIV-2:
O HIV infecta, principalmente, a TCD4, que são frágeis e morrem. Os macrófagos e
células dendríticas também são infectadas
Ficamos doente pois a quantidade de TCD4 abaixa muito
Temos o CD4 na célula TCD4, porém, para o vírus entrar, ele precisa também (além
da molécula CD4) de um receptor de quimiocina
A grande maioria das infecções é por conta da relação sexual, a AIDs não tem cura,
apenas mantemos a viremia baixa e algumas cepas virais são resistentes aos
medicamentos
O anti-retroviral causa uma grande debilitação no corpo, dependendo da
genotipagem do vírus, teremos um ciclo de tratamento e às vezes é preciso trocar a
medicação. Se a carga viral não diminuir, então a combinação não está
funcionando, descobrimos isso a partir de PCR. É melhor não lidar com a situação
de ficar contaminado
Existem medicamentos que você pode tomar se um parceiro for soropositivo, para
impedir a infecção, e o outro é quando você passou por uma situação de risco, e
você pode não ser infectado
Mecanismo de entrada do HIV em uma célula:
Receptores de quimiocina mais estudados = CCR5 e CXCR4
Ela sofre, então, uma mudança conformacional, expondo peptídeos que não
estavam expostos antes. Isso propicia a ligação na membrana plasmática da célula
hospedeira, fazendo a fusão e o capsídeo entra na célula
Na célula hospedeira, o vírus faz a transcrição reversa. Transcreve o RNA em DNA
A integrase integra o DNA viral ao genoma da célula
Assim, produzimos RNAm e continuaremos a progressão viral com produção dentro
das células de tudo aquilo que o vírus precisa
Correceptores para infecção -receptores de quimiocinas
Quando você se contamina, o vírus entrará provavelmente primeiro em macrófagos.
O CXR4 aparece um pouco depois, durante a progressão da doença. Essas cepas
virais recebem nomes com base em quais receptores de quimiocina elas se ligam
O vírus, ao entrar na célula, não necessariamente irá se multiplicar. A primeira cois
que ele faz é o uso da transcriptase reversa, assim, o DNA dele fica junto com o
nosso dentro da célula
Ele pode ficar até 10 anos dentro do nosso organismo sem manifestar nenhum
sintoma
A latência viral pode sair justamente pelo estímulo de proliferação daquela célula
Saída do vírus = budding off, ele leva à membrana (que terá as proteínas da célula)
A saída de muitos vírus deixa a célula instável e suscetível à apoptose
Como o HIV leva ao prejuízo do sistema imunológico? Porque ocorre a
imunossupressão?
São os efeitos deletérios diretos do HIV sobre as células TCD4+
A constante perda de membrana, devido a saída dos vírus, leva a alterações no
fluxo de íons
A célula fica instável e entra em apoptose e morre
Outro motivo pode ser a síntese de proteínas virais, uma vez que a célula gasta o
material que seria para as proteínas essenciais para a célula. Assim, ela não
consegue sobreviver
Se a célula infectada encostar em uma célula T normal, que não está infectada, ela
irá ter fusão das membranas, formando uma célula maior e formando um sincício
O HIV mata diretamente dessa forma, sincício, fluxo de íons e síntese proteica
afetada
O HIV pode ser passado entre duas células em uma sinapse imunológica -
contamina a célula de baixo
A TCD8 mata as células infectadas, logo, o próprio sistema imunológico promove
imunossupressão
Tem um sistema desenvolvido em 2016 publicado, é um sistema in vitro que
mimetiza o que ocorre in vivo no organismo
Eles chamaram o sistema de cultura de agregado linfóide humano (HLAC) com
tonsilas humanas frescas ou tecido de baço, assim, observamos a cultura de TCD4
Foi observado que 5% tornaram-se infectadas, são permissivas (estão produzindo o
vírus dentro delas)
Os outros 95% não são permissivas, logo, fazem infecções abortivas = não
completam o ciclo de fazer RNAm e DNA
O HIV promove a morte das células permissivas e não permissivas da forma
A permissiva morre por apoptose mediada pela caspase-3
Se a IFI16 acha o DNA fora da célula, ele reconhece que deve ser de algum
microrganismo (visto que o DNA deveria estar dentro da célula). Dessa forma, o
sensor se reúne em um inflamassoma, temos ativação da caspase-1 e temos a
piroptose
]]
Fase eclipse:
Durante o período de latência, o HIV destrói aproximadamente 1 milhão de células
TCD4 por dia. Por isso, a doença vai gradativamente destruindo o sistema
Tecido linfóide do intestino é um dos mais acometidos
A presença de anticorpos não impede a entrada do vírus na célula, já que a gp120
faz mudanças conformacionais, podemos ter estruturas com mutações que também
fogem do sistema imunológico
Sarcoma de Kaposi - câncer específico da AIDs
HIV
Vírus são estruturas genéticas incapazes de terem um metabolismo próprio, de se
replicarem sozinhos, eles precisam obrigatoriamente de uma célula hospedeira
para o processo de replicação viral.
Falando em bactéria, a grande maioria em meio de cultura com os nutrientes
necessários para essa bactéria se desenvolver ela vai se desenvolver, porque ela
consegue absorver os nutrientes do meio e tem a maquinaria de síntese proteica
para ela mesmo fazer suas próprias proteínas e crescer a população.
O vírus já é diferente, ele precisa da maquinaria de síntese proteica, porém utilizam
isso da célula hospedeira. Os vírus são encontrados em todos os reinos de seres
vivos, existem vírus que infectam bactéria (bacteriófago) até vírus que infectam
plantas, animais, seres humanos, etc.
Esses vírus obrigatoriamente são intracelulares, por isso são parasitas
intracelulares obrigatório. Parasita porque invadem a célula e causa algum tipo de
prejuízo na célula, e intracelular obrigatório porque para ele ser prejudicial, ele tem
que estar dentro da célula.
Os vírus vão ter sua própria informação genética (tem seus próprios genes), mas
o genoma dele é diferente. Ou vai ser um vírus de DNA ou um vírus de RNA, não
encontra na mesma partícula viral as duas coisas juntas.
Além disso, com relação ao genoma viral, existe uma gama de possibilidades. No
vírus de DNA, pode ser encontrada fita simples de DNA ou fita dupla de DNA, com
relação ao vírus de RNA é a mesma coisa fita simples de RNA ou fita dupla de RNA.
- o HIV apresenta duas fitas simples de RNA, é um retrovírus.
Do lado esquerdo se vê um
vírus sem envelope, com a
presença do capsídeo, que é a
parte proteica, feita por
subunidades de capsômeros.
Cada bolinha é um
capsômero e dentro do
capsídeo tem o ácido
nucleico que pode ser RNA ou
DNA de fita simples ou dupla.
Do lado direito temos o
mesmo vírus só que agora envolto por um envelope. O material para o envelope do
vírus vem da última célula hospedeira que esse vírus estava infectando (é uma
parte da membrana plasmática da célula que estava hospedando, que levou em seu
processo de saída).
- o HIV é um vírus envelopado. Tem o capsídeo, no meio mais externo tem o
envelope e possui algumas proteínas de membrana no envelope do vírus.
Replicação viral: de modo geral, os vírus fazem uma ligação na membrana
plasmática da célula hospedeira, essa célula possui algum tipo de receptor para
esse vírus se ligar. Ligando ele penetra na célula hospedeira, pode ser que entre o
capsídeo inteiro ou só o ácido nucleico, depois tem a síntese de ácidos nucleicos e
proteínas virais. O vírus faz com que a célula produza grandes quantidades de
ácidos nucleicos para montar novos vírus e proteínas virais para montar a estrutura
do capsídeo e material genético. Após isso acontece a montagem dos capsídeos e
empacotamento do material genético dentro dos capsídeos. Feito isso, o vírus está
pronto e ocorre a liberação, esse vírus parte então à procura de novas células para
continuar o processo de síntese viral.
Boletim epidemiológico do HIV (2019 – dados até 2018): quase 40 milhões de
pessoas em todo o mundo vive com HIV. Desses, 23 milhões de pessoas tem
acesso à terapia antirretroviral, o medicamento prolonga a vida da pessoa, se não
tomar o remédio a pessoa morre. No Brasil há a distribuição gratuita do
medicamento, mas em muitos lugares do mundo não. 1,7 milhão de novas
infecções, quase 75 milhões foram infectadas desde o início da epidemia, e 32
milhões já morreram por conta de HIV. Em SP, 2 pessoas morrem por dia devido ao
HIV, antes eram 8.
No gráfico ao lado, dados de 1990 a 2018, mostrando
que foi aumentado, em 2002/2004/2006 teve um pico, foi
declinando até 2018 (linha verde = número de
mortes). Já a linha azul, que são novos casos, teve um
pico em 98/96, a partir de 2000 começou a diminuir os
novos casos.
Gráfico ao lado mostra por
idade. Até 14 anos, que é
idade pediátrica, teve uma
diminuição boa de 41%, de
2000 a 2018. A partir dos 15
anos a diminuição foi menor, de
13% apenas.
Na América Latina, em alguns
países teve uma diminuição na
porcentagem de infectados, e em
outros teve aumento. Em El
Salvador teve a maior diminuição, de
48%, em seguida Nicarágua,
Colômbia, Equador, Paraguai,
Panama, Peru. México ficou igual. Já
a Argentina, Guatemala,
Honduras, Uruguai, Costa Rica, Brasil, Bolívia e Chile aumentaram as novas
infecções por HIV.
Classificação do vírus
Tem 2 tipos, o HIV-1 e HIV-2. O HIV do tipo 1 é aquele que está distribuído no
mundo. Já o tipo 2 está mais contido, ele é endêmico da África Ocidental e se
disseminou um pouco para a Índia também.
Ambos causam uma síndrome parecida, ou seja, ambos podem matar, a diferença é
na estrutura da partícula viral.
Pelo fato do HIV-1 ser predominante no mundo, a grande maioria das pesquisas
científicas e estudos são relacionados a ele.
Existem dois tipos de HIV.
Esses tipos, conforme os
pesquisadores vão vendo
diferenças na estrutura do
vírus, vãoexpandido a
classificação, então depois dos
tipos tem os grupos. No HIV-1
tem o grupo M, N, O P, já no
HIV-2 tem A, B, C, D, E, F, G, e H. O tipo 2 tem mais ramificações, não acaba nisso.
No HIV-1, no grupo M tem subtipos que vão de A até K, e dentro desses subtipos, o
A e o F têm os sub-subtipos (F1, F2, e A1, A2, A3, A4 e A5). Tudo isso devido às
mutações do vírus, justamente por isso que o sistema imunológico não consegue
eliminar, porque faz muitas mutações.
Além dessas classificações, tem a sigla CRF/URF. Esse CRF significa forma
recombinante circulante. Quando essas pessoas que trabalham com essa
classificação filogenética do vírus acham essa forma em até 3 indivíduos, chamam
essa forma nova de CRF. E quando acha uma forma nova de classificação do vírus
em apenas 1 indivíduo, é chamado de URF (forma recombinante única). Se ele
passar para outros 2 passa a ser recombinante circulante.
Estrutura do vírus
Veremos o vírus de fora
para dentro. O envelope
vem da membrana
plasmática da célula
hospedeira que o vírus
saiu. Nesse envelope
encontramos estruturas
muito importantes para o
vírus. Vemos a gp120 (em
azul), e abaixo dela gp41
(em verde) inserida na membrana. Gp é de glicoproteínas e o número é o peso
molecular. Essas duas proteínas estão envolvidas no processo de infecção da
partícula viral na célula hospedeira. Para a partícula viral entrar na célula
hospedeira, o contato inicial é via gp120, é a primeira que faz a ligação no receptor
da célula hospedeira. Ao lado, uma microscopia eletrônica do HIV (aumento de
200.000x).
A estrutura em amarelo é a matriz. A matriz possui uma proteína chamada de p17
(em laranja). Mais para dentro (em vermelho) encontramos o capsídeo e dentro do
capsídeo as duas fitas de RNA, além das enzimas necessárias do vírus. É
encontrado também a transcriptase reversa (enzima composta por 2 subunidade
p66/p51, essa enzima faz a transcrição ao contrário). Ela, a partir da fita de RNA,
sintetiza uma fita de DNA. Essa fita de DNA feita pela transcripitase reversa vai ser
inserida no nosso DNA, e quem faz essa integração é a integrase (integra o DNA à
fita de DNA da célula hospedeira).
O genoma do HIV é
relativamente simples, tem
poucos genes. Alguns genes são
importantes, como o gene gag,
que é um gene que codifica uma
proteína precursora, é uma
proteína prévia a outras
proteínas. É a proteína p55 (maior), que será clivada pela protease p10, dando
origem a p6, p9, p17 e p24. A p6, p9 e p24 compõem o capsídeo. A p17 forma a
matriz.
Outro gene importante é o gene env, responsável por codificar proteínas envolvidas
no envelope. Inicialmente ele também faz uma proteína percursora, que é a gp160,
a protease p10 quebra essa gp160 em subunidades menores, dando origem a
gp120 e a gp41. Ambas estão envolvidas na ligação da célula hospedeira, ou seja,
são necessárias para entrar na célula.
O gene pol é responsável por codificar essas enzimas. Então tem a p66 e p51 que
juntas fazem a transcriptase reversa (faz a transcrição ao contrário). Além disso tem
a p31, que é a integrasse. Então a transcriptase reversa fez a transcrição da fita de
RNA em DNA, com isso a integrase integra esse DNA sintetizado ao genoma do
hospedeiro, e por último tem a p10, que é uma protease (cliva proteínas).
Esses são os principais genes com funções estruturais: gag, pol e env.
Os outros genes são regulatórios: codificam produtos com função reguladora ou
acessória. Atuam no controle da replicação viral e da infectividade.
A diferença entre o HIV-1 e HIV-2 são essas estruturas. Como exemplo, o gene env
que no tipo 1 sintetiza o precursor que vai dar origem a gp160 e quando a protease
p10 quebra resulta em gp120 e gp41, no tipo 2 esse gene faz uma precursora
gp140, cliva em gp105/125 e gp136. Existem outras diferenças também, a
transcriptase reversa, por exemplo, no HIV-1 é feita pela p66 e p51, no HIV-2 é a
p68 e p53. Ou seja, essas pequenas modificações que encontramos nas estruturas
do HIV é o que faz com que classifiquemos o HIV em grupos, tipos, subtipos,
sub-subtipos.
Infecção
O HIV infecta linfócitos TCD4 (auxiliares), macrófagos e células dendríticas. As
células T auxiliares são mais suscetíveis à morte pelo HIV, ou seja, morrem mais
facilmente quando o HIV as infecta quando comparado com o macrófago ou com
célula dendrítica, que servem mais como reservatórios para o HIV.
A célula TCD4 é onde vai acontecer a principal imunossupressão.
Para o HIV poder entrar na nossa célula, ele se liga no CD4 e no receptor de
quimiocina. Lembrando que o CD4 também está presente nos macrófagos e
células dendríticas.
A infecção acontece por relação sexual desprotegida, injeção intravenosa
compartilhando seringa.
Ao lado, em verde temos a célula
hospedeira com CD4 e receptor de
quimiocina. Lá em cima temos o HIV com
gp120 (rosa) e gp41 (verde). A primeira
coisa que acontece é o contato físico do
HIV come sses receptores na superfície da
célula hospedeira. A gp120 gruda no CD4, com isso a gp120 faz uma alteração
conformacional, e expõe peptídeos da gp41 (verde), que se liga na membrana
plasmática da célula. Se ligando, faz com que ocorra a fusão do envelope com a
membrana, e com isso esse envelope passa a fazer parte da membrana plasmática.
Tudo que está dentro do envelope é colocado para o interior da célula hospedeira, e
então a célula está contaminada.
Dentro
da célula
hospedeira, temos em laranja o DNA viral, e em
azul a transcriptase reversa. O RNA não se encaixa ao nosso DNA, então a
transcriptase vai fazer a transcrição ao contrário, sintetizando a fita de DNA a partir
da fita de RNA. Vem então a integrase (triângulo) e integra o DNA feito ao genoma
do hospedeiro.
Revendo: CD4 liga ao gp120 e também ao receptor de
quimiocina, depois tem a mudança conformacional da gp120, e mudando a
conformação dela expõe peptídeo do gp41, que gruda na membrana
proporcionando a fusão do envelope na membrana plasmática da célula que vai ser
infectada.
Receptores de quimiocinas
Existem alguns receptores de quimiocinas já estudados que fazem parte desse
processo infeccioso, mas dois são mais importantes e melhor caracterizados:
CXCR4 (expressa em T helper) e CCR5 (expressa em macrófagos). É dado o nome
para a partícula viral de acordo com onde esse HIV liga. Lembrando que como o
HIV é mutante, ele pode mutar e passar a ligar nos dois.
- Nesse exemplo temos uma cepa viral ligando no T helper. A gp120 vai ligar no
CD4 e no CXCR4. O HIV que faz isso é chamado de T-trófico ou X4 (se liga ao
CXCR4).
- Já o HIV que se liga ao CCR5, é chamado de M-trófico ou R5.
- Existem também as partículas virais que grudam em qualquer coisa, ligam tanto no
CXCR4 tanto no CCR5, sendo chamado de duotróficos ou R5X4.
Outras células podem até ter esses receptores de quimiocinas, mas como não têm o
CD4, o HIV não entra. Ele precisa dos dois.
A resposta imunológica normal pode ser
justamente o sinal que o HIV estava
precisando para se ativar, porque
quando ele entra na célula e a
transcriptase reversa por meio de
RNA faz uma fita de DNA, que vai ser
inserida no núcleo, a célula pode ficar de
boa com isso, sem replicação do HIV.
Mas por conta da resposta
imunológica normal, a dendrítica, por
exemplo, apresenta antígeno para a
célula T, e quando ativa, sinais são mandados para o núcleo, consequentemente
pode ser um estímulo para o DNA viral que estava quietinho começar a sintetizar e
entrar em ação.
Fazendo isso, tem a síntese de
novas estruturas, mais RNA,
proteínas da matriz, do
capsídeo, gp120, gp41, ou
seja, a célula está em intensa
síntese de proteína para o
HIV. Tem também a protease
que vai clivando os precursores, e quando se tem a célula cheio de produto viral e
montando/empacotando esses vírus no capsídeo, essa célula então começa a
liberar as partículas virais para que elas infectem as próximas células. No desenho
vemos que a membrana plasmática da célula já está lotada de gp120 e gp41,
porque se o vírus leva um pedaço da membrana com ele, isso vai ser o envelope
dele, e ele precisa de gp120 e gp41 para infectar