biologia II unidade

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OLÁ!
Você está na unidade Técnicas em biologia molecular. Nessa unidade, serão estudadas as técnicas de biologia molecular mais proeminentes como a PCR e o sequenciamento de DNA, como essas técnicas evoluíram e como elas impactaram os mais variados campos da genética, da ciência e da sociedade. Vamos discutir ainda sobre a importância de algumas técnicas de engenheira genética, em especial, a técnica do DNA recombinante, como ela revolucionou o campo científico e tecnológico e até mesmo muitos produtos e serviços dentro da sociedade. Vamos ver como essa técnica vem se aprimorando ao longo dos últimos anos, com o desenvolvimento de e a descoberta de fatores determinantes para o avanço dessa técnica. Dentre esses avanços, vamos falar sobre as enzimas de restrição, qual sua função primordial e como sua descoberta alavancou e modificou muitas aplicações no processo de obtenção de DNA recombinante, mesmo que aconteceu com outros tipos de enzimas como o grupo das DNA polimerase.
Bons estudos!
1. Evolução na clonagem de DNA
Através da tecnologia do DNA recombinante, podemos replicar um fragmento do DNA dentro de uma célula bacteriana. Basta cortar o fragmento de interesse, através das enzinas de restrição, e inserir esse fragmento no DNA bacteriano, denominado plasmídeo, utilizando-se as enzimas de DNA ligase. Esse DNA recombinante, introduzido em uma bactéria por transformação, pode ser replicado várias milhões de vezes à medida que as bactérias se multiplicam.
Porém, um questionamento intrigou durante muito tempo o mundo científico: como escolher identificar e isolar um gene sem saber previamente sua sequência de nucleotídeos? De acordo com Alberts (2011), a solução encontrada foi o desenvolvimento de bibliotecas de DNA. Para entendermos essa técnica, analisaremos o exemplo do gene que codifica o fator VIII de coagulação humana.
A hemofilia, uma doença que causa problemas da coagulação sanguínea levando a quadros de sangramento descontrolado, é caracterizada por alterações no gene para o fator VIII. O tratamento para essa doença era a injeção da proteína fator VIII concentrada, coletada a partir de várias amostras de sangue. Contudo, durante a década de 1980, esse procedimento expôs diversos pacientes à infecção pelo vírus do HIV. O método de produção do fator VIII através da tecnologia do DNA recombinante trouxe uma melhora significativa nesse aspecto e no tratamento dessa doença. Para tanto, foi necessária realizar a clonagem do gene que codifica esse fator VIII, através da identificação das suas sequências específicas e utilizá-las para produzir uma grande quantidade de proteínas purificadas (ALBERTS, 2011).
Entretanto, trabalhar com 3x109 pares de nucleotídeos não é uma tarefa fácil. Através da tecnologia do DNA recombinante, milhares de fragmentos são inseridos em plasmídeos recombinantes, fornecendo milhares de DNA clonados em uma cultura bacteriana, denominada biblioteca de DNA. Nessa etapa, poderíamos pensar que achar um gene seria como achar um livro dentro de uma biblioteca com milhares de livros sem ter um catálogo em mãos.
No caso que analisamos, a utilização de sondas de DNA foi a solução encontrada. Na proteína para o fator VIII, a sequência parcial de aminoácidos é deduzida por espectrometria de massas. Consequentemente, se deduz os nucleotídeos que a compõem. A partir dessa informação, são produzidas sondas especificas que podem identificar um gene dentro de uma biblioteca de DNA.
Apesar dessa técnica ainda ser utilizada no sequenciamento de genomas inteiros, ela vem sendo substituída em grande parte pelo método conhecido como Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que fornece uma alternativa mais rápida e barata. De acordo com Vieira (2020), essa técnica foi desenvolvida em meados da década de 1980 por dois cientistas: Saike e Mullis. O método de clonagem da PCR já havia sido descrito por Saiki, mas foi aperfeiçoada por Mullis que conseguiu obter maior especificidade na cópia de apenas segmentos específicos, introduziu o conceito de primer de PCR e instituiu o uso de enzimas denominadas DNA polimerase termoestáveis. Mullis utilizou enzimas termoestáveis recém descritas, melhorando o processo que demandava grandes quantidades de enzimas a cada ciclo de amplificação. Além disso, utilizou diversos equipamentos para automatização do processo.
Em 1989, foi desenvolvido o primeiro termociclador automático DNA, Thermal Cycler, o que melhorou muito o processo manual de ciclos de temperaturas que era feito anteriormente banhando os vários tubos em banhos-maria de temperaturas diferentes. A maioria dos termocicladores, ainda hoje, funciona com o mesmo princípio, aquecimento por resistência elétrica e refrigeração com ventoinhas e etileno glicol.
Segundo Vieira (2020), técnica da PCR revolucionou as tecnologias em biologia molecular, teve grande impacto e contribuição no estudo de sequenciamento do genoma humano e levou ao avanço de diversas áreas. Suas aplicações são totalmente abrangentes atingindo atualmente campos como genética, medicina, indústria, alimentos, ciência forense, diagnostico, dentre tantos outros.
1.1 Procedimentos e funções da PCR
A PCR é utilizada atualmente na grande maioria dos processos de clonagem do DNA. Através dela, determinada sequência especifica de nucleotídeos pode ser replicada totalmente in vitro sem a necessidade do uso de células e de forma rápida e seletiva, obtendo grandes quantidades de clones, a partir de uma pequena amostra de DNA humano. Os fundamentos desse método estão baseados na utilização de enzimas chamadas polimerase, capazes de copiar um molde de DNA em uma reação com ciclos repetidos de replicação. Essa polimerase é guiada até a sequência a ser copiada por primers, sequências curtas de ácidos nucleicos adicionados a reação, que posteriormente copiam o DNA molde no início e no final da sequência desejada. Essa técnica de PCR é extremamente sensível e pode detectar uma única cópia de uma sequência especifica de DNA em uma amostra. A partir disso, amplifica tanto essa sequência, que permite detectá-la por métodos de coloração após separação com eletroforese em gel.
Para esse processo, é necessário ter conhecimento da sequência de DNA a ser amplificada. A partir disso, é possível projetar moléculas de DNA sintéticas curtas, cada uma complementar à sequência do DNA a ser amplificada em cada uma das extremidades opostas da região alvo. Essas sequências sintéticas, servem como iniciadores para a síntese do DNA in vitro, através das enzimas polimerases.
A PCR consiste essencialmente em três etapas básicas com variação de temperatura por ciclo, sendo elas:
Desestruturação de proteínas:
O DNA contendo a sequência a ser amplificada é desnaturada, ou seja, sua fita dupla é aberta, tornando-a uma fita única. Essa etapa é realizada na temperatura entre 92ºC a 96ºC e dura de 30 seg. a 1 min.
Ligações dos iniciadores sintéticos:
Após essa primeira etapa, um par de iniciadores ou primers (uma sequência especifica feita para o gene que se quer ampliar) iniciam a reação de polimerização, ou seja, complementam a fita oposta na sequência do DNA que se deseja ampliar, realizando a duplicação desse trecho. Essa etapa tem duração de 30 seg. a 1 min em temperaturas entre 58ºC a 65ºC.
Amplificações através da enzima taq:
Com as fitas de DNA molde já identificadas pelos iniciadores, a enzima DNA polimerase adiciona as bases complementares, originando uma nova fita e obtendo novamente a duplicação da fita de DNA. Essa etapa tem duração de 45s a 1 min e acontece a temperatura de 72ºC.
Cada ciclo desse é repetido entre 30 a 35 vezes e realiza a amplificação da região do DNA determinada conforme a ligação dos iniciadores sintéticos ou primers. Os produtos obtidos em cada um desses ciclos servem de molde para as próximas reações; por isso, a denominação de reação em cadeia. Esse processo vai se repetindo até que se obtenha o nível de amplificação desejada, em geral por volta de 30 ciclos.
Já que cada uma dessas etapas ocorre diferentes temperaturas, a reação pode ser controladaatravés de um termociclador que pode garantir a temperatura especifica e o tempo de cada etapa, assim como o número de ciclos da replicação. A amplificação desse DNA através da PCR pode ser lida, ou seja, detectado através da separação em gel de eletroforese e posterior coloração das bandas de DNA
Com o passar dos anos houve o aprofundamento do estudo dos métodos de PCR, levando a um desenvolvimento dessa técnica. Hoje existem alguns tipos diferentes de PCR, os mais comuns são:
	RT-PCR (Transcriptase Reserva) 
	Nessa reação, duas etapas são realizadas, primeiro há a transcrição reversa seguido da amplificação, a diferença é que essa técnica não precisa de um molde de DNA diretamente extraído da amostra, podendo ser obtido apenas o RNA da amostra e partir dele produzir um cDNA (DNA complementar). Aqui é utilizado um molde baseado em RNA para originar uma fita de DNA através da enzima transcriptase reversa, essa técnica tem bastante aplicabilidade no estudo da expressão gênica, já que avaliando o mRNA é possível identificar as proteínas que estão de fato sendo expressas.
	PCR Multiplex
	Nessa técnica, mais de um fragmento de DNA pode ser amplificado numa única reação, cada um com um com o seu par de primers específico. Esse procedimento apresenta vantagens para algumas aplicações como testes de paternidades que devem analisar vários marcadores genômicos ao mesmo tempo e também para introduzir um controle de reação esse método. Nesses casos esse tipo de PCR tem a vantagem de simplificar significativamente o processo.
	PCR Nested
	Esse tipo consiste em amplificar primeiramente um fragmento de forma abrangente, copiando até sequencias localizadas fora dela, posteriormente a obtenção desse produto, a ampliação da sequência alvo é iniciada. Essas duas etapas podem ser realizadas simultaneamente, ou em duas reações separadas, esse procedimento serve para melhorar a eficiência e especificidade da reação.
	PCR Competitiva 
	Essa técnica, altamente utilizada em kits diagnósticos para análise carga viral, por exemplo, utiliza um outro fragmento de DNA além do DNA molde, sendo esse primeiro de tamanho e concentração conhecidos (controle), no qual as extremidades são complementares também aos primers que irão amplificar a sequência alvo. A consequência disso é a amplificação de dois trechos de DNA, o de interesse e o controle, pelo fato das concentrações do controle serem conhecidas é possível quantificar o DNA alvo.
De acordo com Nascimento (2015), esse último tipo de PCR é também denominado PCR em tempo real, representado pela sigla qPCR que significa PCR quantitativa, isso porque através desse método é possível a quantificação do DNA alvo durante o processo. Ainda, o resultado da reação pode ser visualizado imediatamente dispensando a necessidade de eletroforese, somente pela adição de sondas fluorescentes que aumentam seu nível de fluorescência de acordo com a quantidade de ampliação do DNA alvo. Nesse aspecto, como o equipamento consegue detectar essa fluorescência enquanto está ocorrendo a amplificação, é possível acompanhar os resultados em tempo real daí a sua denominação. Por sua precisão, rapidez e sensibilidade essa técnica apresenta uma diversidade de aplicações.
O perfilamento genético para avaliação do genoma de um organismo é uma aplicação bastante utilizada no campo da pesquisa básica. O perfilamento ou “microarray” é um procedimento que permite a análise de milhares de genes ao mesmo tempo, sendo possível quantificação e observação de genomas inteiros.
A identificação de polimorfismos ou mutações pontuais é outra aplicação da PCR em tempo real muito utilizada nas áreas clinicas e de pesquisa. Ela pode ser feita por análise de curva de dissociação, após amplificação por qPCR. Essa técnica é ideal para analisar mutações, até mesmo de um único nucleotídeo modificado, para a detecção de mutação no fragmento de DNA alvo é necessária a avaliação do produto amplificado em curva de dissociação, realizada automaticamente após a termociclagem.
No campo da farmacogenética, a qPCR tem ganhado grande importância, no intuito de analisar a expressão de determinado gene em resposta a um determinado tratamento com fármacos. Para detecção de microrganismos e doenças infectocontagiosas, há uma utilização crescente também da PCR em tempo real, pois permite a distinção de uma sequência especifica de DNA dentro de uma mistura complexa. Nesse campo, a qPCR permite a determinação específica da presença e quantidade de um vírus, bactéria ou fungo, com base na relação existente entre a carga viral e a gravidade da doença, através dessa técnica é possível mensurar a progressão da doença nos pacientes e a eficácia das terapias antivirais. A análise de bactérias com esse mesmo processo pode viabilizar um rápido acesso as características de sensibilidade do organismo, permitindo que se prescreva o antibiótico adequado.
Desde o desenvolvimento da tecnologia de PCR, foram rápidos os avanços realizados nas técnicas de biologia molecular em especial na medicina humana, as também podemos citar a utilização dos diversos tipos de PCR nas mais variadas aplicações. Essa tecnologia trouxe um novo patamar à ciência de biologia molecular e permitiu a evolução de uma infinidade de segmentos dentro da sociedade.
2. Enzimas de restrição
O ser humano vem manipulando o DNA e consequentemente os genes há séculos. Contudo, essa manipulação se dá através de um longo tempo e vários cruzamentos entre raças, para se selecionar as características desejadas. A advento e desenvolvimento das técnicas de biologia molecular, em especial, a engenharia genética, representada em grande parte pela técnica do DNA recombinante, permitiu que a ciência alterasse o DNA com muito mais precisão e em um tempo muito menor. Hoje, através dos métodos e tecnologias estabelecidas, principalmente ao longo das últimas décadas, se tornou relativamente fácil isolar uma região específica do DNA, separar um gene para estudá-lo e criar milhares de cópias idênticas desse DNA.
A princípio, os cientistas perceberam que ficaria muito difícil desvendar todos os mecanismos de codificação do DNA, sem que se estudassem individualmente e especificamente os genes, já que á na sequência de nucleotídeos que estava toda a informação genética que confere as mais variadas características biológicas aos seres vivos. O grande problema de estudar o gene, na época, é que seria como procurar uma agulha no palheiro, visto que os genes são sequências muito longas de nucleotídeos e os fragmentos de DNA, contendo um determinado gene, se perdia entre milhares que fragmentos obtidos, criando um grupo confuso de fragmentos aleatórios. Esse tipo de problema foi resolvido ao se desenvolver mecanismos que aprimorassem a técnica de DNA recombinante.
Uma das ferramentas melhor desenvolvidas para sanar essas questões foi a descoberta de uma classe de enzimas bacterianas chamadas polimerases. Essas enzimas se diferenciavam das outras “tesouras” moleculares, pois conseguiam cortar a dupla fita de DNA em uma região altamente especifica, delimitado por uma sequência curta de pares de nucleotídeos, sendo possível utilizar esses fragmentos para reprodução de clones de um genoma. A descoberta e validação dessas enzimas só foi possível a partir do desenvolvimento das técnicas moleculares e o avanço nos estudos sobre essa área da ciência. A primeira demonstração de que essas enzimas poderiam cortar fragmentos específicos do DNA se deu em 1971, através dos trabalhos de Smith e Nathans, que observaram isso em um vírus oncogênico. Além disso, seus estudos revelaram que esses fragmentos poderiam ser separados por eletroforese em gel, a partir de uma carga elétrica. O descobrimento dessas enzimas foi um marco para biologia molecular e rendeu o Nobel aos cientistas que a descreveram. Desde então, já foram identificados aproximadamente 800 enzimas de restrição e 100 regiões alvo de restrição (PRAY, 2008).
Em 1972, a primeira molécula de DNA recombinante foi produzida, quando Paul Berg isolou e empregou uma enzimade restrição para cortar o DNA e usando posteriormente a enzima DNA ligase para unir as duas fitas, tornando possível a clonagem daquele fragmento de DNA experimentalmente. De acordo com Alberts (2011), a descoberta dessa classe de enzimas, assim como grande parte das tecnologias do DNA, foram observadas quando se estudava um problema biológico especifico, que se pautava no questionamento do porquê determinadas bactérias sempre degradavam um DNA “estranho” que era inserido nelas experimentalmente. Como resultado a esses questionamentos os pesquisadores observaram que essa enzima aparecia naturalmente nas células e tinha como principal função proteger o DNA de um hospedeiro frente a um DNA externo, por exemplo, um DNA de vírus bacteriófago. Pelo fato dessas enzimas restringirem a transferência de DNA entre algumas cepas de bactérias, elas foram denominadas de nucleases de restrição ou simplesmente enzimas de restrição.
2.1 Funcionamento e tipos de enzimas de restrição
Com a descoberta e o desenvolvimento dessas tecnologias e métodos capazes de cortar o DNA e posteriormente ligar esses fragmentos, surge uma nova área na ciência conhecida como Engenharia Genética, que tem como técnica mais proeminente a Tecnologia do DNA recombinante. Hoje, através da Engenharia Genética, representada pela tecnologia do DNA recombinante, podemos detectar mutações no DNA responsáveis por doenças genéticas, diagnosticar a predisposição de um individuo em ter doenças hereditárias, identificar o DNA de suspeitos na ciência forense, produzir uma diversidade de medicamentos, como a insulina, ou criar outros organismos geneticamente modificados.
As enzimas de restrição têm a capacidade de cortar o DNA em uma sequência de nucleotídeos específicas. Em geral, as sequências alvo são palindrômicas, ou seja, são simétricas em torno de um ponto central. Espécies de bactérias diferentes contêm diferentes nucleases de restrição e cada uma delas corta o DNA em uma sequência de nucleotídeos específica.
As sequências alvo costumam ser curtas – em média 4 a 8 pares de nucleotídeos. Logo, os sítios de clivagem, ou seja, regiões especificas na qual as enzimas realizaram o corte, seguem o padrão de funcionamento de qualquer enzima de especificidade entre a proteína e o alvo (modelo chave - fechadura), ocorrendo um corte puramente por acaso, em qualquer molécula longa de DNA.
Esse fator permite que essas nucleases sejam utilizadas em DNA de qualquer fonte, e, ainda, que uma enzima específica corte uma dada molécula de DNA sempre nas mesmas regiões, o que as tornam tão úteis. Uma amostra de DNA humano, por exemplo, tratado com uma certa nuclease de restrição produzirá sempre a mesma coleção de fragmentos (ALBERTS, 2011).
Hoje, são descritas uma gama de enzimas de restrições diferentes que agem nos mais diversos sítios de restrição, de acordo com a sequência de DNA que se pretende cortar e obter. As variações nas sequências alvo das nucleases estão relacionadas a frequência na qual elas ocorrem no DNA. Por isso, os tamanhos dos fragmentos de DNA obtidos por diferentes enzimas de restrição podem ser muito diferentes.
Tais característica tornam possível cortar uma longa molécula de DNA em tamanhos de fragmentos adequados de acordo com uma determinada aplicação. As nucleases de restrição podem ser divididas em quatro tipos de acordo com as sequências de reconhecimento, composição da subunidade, posição de clivagem e tipo de cofator.
As enzimas do tipo I, segundo Biclke (1993), são capazes de cortar o DNA em sequencias relativamente distantes do sitio de reconhecimento, são dependentes de ATP e apresentam atividades multifuncionais. Já as enzimas do tipo II, cortam em distancias muito curtas do sitio de reconhecimento ou no local exato, são dependentes de Mg 2+ e apresentam função mais de restrição. As enzimas do tipo III são capazes de reconhecer sequencias assimétricas e cortar o DNA em regiões de até 25 a 37 pares de bases, tendo atividades de restrição e modificação. Por fim, as enzimas do tipo IV têm como alvo apenas o DNA metilado. Além disso, segundo Dryden (2001), essas enzimas ainda podem apresentar características particulares dentro desses tipos, subdividindo-se em diferentes subtipos e permitindo sua utilização para as mais variadas fragmentações e consequentemente aplicações.
3. Advento da genômica
Ao falarmos em genômica, estamos tratando do campo da ciência que estuda o genoma, ou seja, a possibilidade de sequenciamento do DNA. O primeiro genoma de organismo vivo a ser sequenciado foi o genoma da bactéria Haemophilus influenzae, em 1995, com 1,8 milhões de bases. Os avanços nessa ciência podem ser bem representados pelos estudos da genética dos Neandertais. Estudos realizados em um fóssil original de neandertal, descoberto em 1856, sequenciaram uma região de 379 pares de bases de DNA mitocondrial desse osso, em 1997. O sequenciamento desse fragmento foi uma conquista técnica incrível, em menos de 10 anos a mesma equipe de pesquisa conseguiu obter mais de um milhão de pares de bases de uma sequência de DNA nuclear de uma amostra de neandertal.
Ainda na década de 1990 vários avanços no sequenciamento genético foram realizados. Em 1996 o genoma de Sacharomyces cerevisiae de 12 milhões de pares foram descritos. Em 2000, o genoma de Drosophila melanogaster com 180 milhões de pares de bases foi sequenciado, culminando em 2001 no primeiro sequenciamento realizado no genoma humano com a obtenção de 3000 milhões de pares de bases. Atualmente são mais de 300 genomas bacterianos sequenciados, 50 genomas de fungos, uma diversidade de plantas e uma série de mamíferos.
A genômica vem se desenvolvendo a passos largos, revolucionando a forma como a análise genética é feita. Até então o estudo dos genes e do DNA estava focado no isolamento de mutantes que afetam alguma função biológica observável e o estudo desse mutante. Saber a sequência inteira do DNA permitiu uma análise muito mais detalhada do DNA e das interações entre os genes e as suas funções biológicas, revelando genes que não eram detectados nas análises clássicas. O estudo do genoma vem fornecendo novos horizontes, para identificar genes que contribuem para doenças genéticas, para entender os processos evolutivos na biologia, na medicina humana para prevenção de doenças, identificação e formas de tratamentos para microorganismos que impactam a saúde humana.
O projeto genoma humano impulsionado a partir do início século, modificou o estudo dos genes e dos próprios métodos para sequenciamento de DNA. Diferente dos princípios utilizados anteriormente para o estudo dos genes, os métodos de sequenciamento tornariam os mapas genômicos publicamente disponíveis. Esses mapas, podendo ser acessados pelos pesquisadores, se constituem uma ferramenta incrível que facilita a identificação da sequência especifica de um gene e sua função. Por isso, vemos hoje que a caraterização de genomas inteiros é importante para compreender os mecanismos de funcionamento dos organismos vivos e para descoberta de novas genes que pode beneficiar ou prejudicar a saúde humana.
Ainda na década de 1970, a molécula de DNA era uma das mais difíceis de ser estudada e analisada, sendo utilizado ainda métodos indiretos para sua observação. Tais métodos, contudo, dificultavam identificar as sequências dos nucleotídeos para um estudo mais aprofundado sobre os genomas. Essa problemática só foi solucionada através do desenvolvimento de duas metodologias, ainda na mesma década, proposta por Maxam Gilbert e por Sanger. O resultado disso é que a técnica descrita pelo premiado cientista Fred Sanger, em 1977, permitiu identificar, na ordem certa, as sequências de nucleotídeos que compõem uma molécula de DNA ou RNA. Esse procedimento causou uma mudança total nos princípios de sequenciamento de ácidos nucléicos, esse fato fez com que esse método fosse utilizado nas três décadas seguintes (AZAMBUJA, 2014).
Apesar disso, a necessidade de buscar novos métodos com menor custo, maior eficiência e rapidez foi uma realidade no final desteperíodo. A busca pelo aprimoramento do método de Sanger resultou em sequenciadores automatizados que tornaram o processo de Gilbert obsoleto. O primeiro sequenciador automatizado utilizou a metodologia de Sanger modificada, e sua aplicação liderou a pesquisa genômica durante décadas. Esse foi o pontapé inicial para um crescente no número de sequenciadores, o que tem aumentado o número de genomas sequenciados em uma proporção incrível. Por exemplo, até dezembro de 2015 já eram registradas 36.052 projetos de sequenciamentos finalizados e outros tantos em andamento, totalizando uma quantidade de 71.479. Esses números mostram que os métodos estabelecidos inicialmente na década de 1970 causaram uma verdadeira revolução na genômica.
A quantidade extraordinária de dados genômicos, derivados desses diversos projetos impulsionaram a criação de inúmeros bancos de dados biológicos, sendo um dos mais proeminentes o NCBI (National Center for Biotechnology Information). O Brasil criou um programa de sequenciamento de genomas que sequenciaram o genoma da bactéria Xylella fastidiosa, o primeiro fitopatogeno completamente sequenciado no mundo (ALBERTS, 2011). Atualmente, existem as técnicas denominadas de terceira geração, que prometem causar enormes mudanças no campo da genômica, diminuindo ainda mais os custos nos processos de sequenciamento e criando a possibilidade de sequenciar fragmentos de DNA maiores e sem utilização de fluorescência ou luz.
3.1 Métodos e aplicações do sequenciamento do DNA
A técnica de sequenciamento desenvolvida por Gilbert ganhou destaque, em sua época, por proporcionar a obtenção de sequências nucleotídicas de fragmentos maiores, comparados as técnicas anteriores. Gilbert desenvolveu um método que utilizava marcação radioativa dos DNA alvo a serem sequenciados (FIETTO, 2020). Nessa técnica, é utilizado fósforo radioativo (P32) que, ligadO ao Datp, forma um composto que é incorporado ao DNA a ser sequenciado, através da enzima polinucleotídeo kinase. Esta incorporação pode ser feita em duas extremidades diferentes de acordo com aplicação desejada e as pontes que ligam a dupla fita do DNA são feitas pela adição de dimetil sulfato e aumento da temperatura a 90ºC
Segundo Fietto (2000), o processo de sequenciamento nesse método consiste em:
· Técnica de sequenciamento de Gilbert
Adição de um fosfato radioativo em uma extremidade após a separação da dupla fita do DNA;
· adição do DNA marcado em quatro tubos, onde ocorre os cortes/clivagens através de compostos químicos em posições específicas;
· o produto gerado nessas reações é colocado em diferentes canaletas de um gel de eletroforese;
· após a separação no gel, as bandas obtidas podem ser lidas de baixo para cima, cada uma representando os nucleotídeos sequenciados.
· O método desenvolvido por Sanger modificou totalmente a tecnologia do sequenciamento de DNA. Esse método se pautava nos mesmos princípios que a técnica anterior, ou seja, de produzir todos os possíveis trechos de sequências do DNA e marcá-los radioativamente. Contudo, por sua facilidade e precisão, essa técnica ganhou grande notoriedade e aplicabilidade em muitas áreas, durante muito tempo.
· A técnica denominada sequenciamento de Sanger, ou método de terminação de cadeia didesoxi, é um método baseado na síntese de DNA realizada in vitro. Nesse procedimento, a DNA polimerase é usada para fazer cópias parciais de um fragmento de DNA a ser sequenciado. Essas reações acontecem em condições especificas que asseguram que essas novas fitas de DNA terminem quando um nucleotídeo determinado seja alcançado. Essas reações originam uma coleção de cópias diferentes de DNA que terminam em todas as posições no DNA original e se diferenciam no comprimento por apenas um nucleotídeo. Para determinação da sequência completa de um fragmento de DNA, primeiro há a separação da dupla fita de DNA em duas fitas simples e uma dessas fitas é utilizada de molde para o sequenciamento.
· São adicionados quatro desses terminadores de cadeia diferentes em quatro reações separadas de síntese de DNA em cópias do mesmo molde de DNA de fita simples. Cada uma dessas reações produz um grupo de cópias de DNA que terminam em pontos diferentes na sequência. Os produtos dessas quatro reações podem ser separados por eletroforese em gel, geralmente de poliacrilamida. Esses fragmentos recém-sintetizados podem ser identificados por um marcador fluorescente ou radioativo que realçam as bandas por estarem ligadas nos iniciadores ou finalizadores utilizados para estender a cadeia de DNA. As cópias do DNA irão correr em quatro canaletas em eletroforese. Cada uma dessas canaletas apresentará os fragmentos que terminaram em um determinado nucleotídeo, mas em diferentes posições no DNA.
· Esses fragmentos recém-sintetizados podem ser identificados por um marcador fluorescente ou radioativo que realçam as bandas por estarem ligadas nos iniciadores ou finalizadores utilizados para estender a cadeia de DNA. As cópias do DNA irão correr em quatro canaletas em eletroforese. Cada uma dessas canaletas apresentará os fragmentos que terminaram em um determinado nucleotídeo, mas em diferentes posições no DNA. Através da leitura dessas bandas em ordem, em todas as canaletas iniciando no final do gel, a sequência de DNA da fita recém-sintetizada pode ser determinada. Em suma, a técnica de Sanger usa a marcação radioativa para sequenciar o DNA, a partir de uma fita molde. De acordo com Fietto (2000), podemos sintetizar o método Sanger da seguinte maneira:
· 
Etapas do método Sanger
Desnaturação da fita dupla de DNA e obtenção de duas fitas simples;
· utilização das fitas para montar quatro reações independentes contendo os mesmos reagentes (exceto os finalizadores didesoxinucleotídeos que são adicionados separadamente de acordo com o tipo de reação);
· produção de fragmentos complementares ao DNA molde com diferentes tamanhos. O tamanho de cada fragmento está relacionado a posição que os finalizadores foram adicionados;
· o produto de cada uma das reações são colocados nas canaletas do gel de eletroforese;
· devido ao alto poder de separação dos fragmentos apresentado pelo gel é possível separar e visualizar os fragmentos diferentes;
· as bandas produzidas são lidas através de métodos radiográficos.
· A técnica de Sanger permitiu separar, inicialmente, de 200 a 300 nucleotídeos por corrida, ou seja, um verdadeiro avanço para época. Porém. o aprimoramento da técnica de Sanger levou, por volta de 1986, a empresa de biotecnologia Applied Biosystems a desenvolver uma máquina de sequenciamento automatizada com base no método de Sanger. A técnica automatizada permitiu um aperfeiçoamento na técnica, tornando-a mais simples, rápida e segura, principalmente por não usar componentes radioativos. A principal diferença é que essas máquinas usam diferentes marcadores fluorescentes para marcar cada um dos nucleotídeos. A leitura nesse caso acontece quando os marcadores fluorescentes inseridos nos nucleotídeos são estimulados por raio laser e emitem diferentes comprimentos de onda capazes de ser detectados.
· Além disso, com a adição de marcadores fluorescentes nos finalizadores foi possível realizar as quatro reações em um único tubo que seriam lidos por sequenciadores automatizados, realizando a corrida em apenas uma coluna. Apesar do custo das placas de vidro serem maior, as máquinas fazem o processo em muito menor tempo e gerando sequencias mais baratas, superando assim o método tradicional de Sanger. O sequenciamento do DNA atualmente é totalmente automatizado. Esses métodos permitiram gerar sequências de DNA, que antes pelo método tradicional levavam semanas a meses e eram extremamente trabalhosos, em 24 horas. A quantidade de dados criados nas técnicas automatizadas gerou a necessidade da criação de algoritmos de computador capazes de montar o genoma.
· Com a virada do milênio, novas abordagens foram desenvolvidas, denominadas de sequenciamento de nova geração ou NGS (Next Generation Sequencing). De acordo com Stroher (2018), elas se baseiamem um sequenciamento paralelo massivo gerando centenas de milhões de curtos fragmentos de DNA, com aproximadamente 30 a 400 nucleotídeos. As NGS mudaram o paradigma de sequenciamento usado há mais de trinta anos, mudando totalmente o patamar dessas técnicas e as metodologias utilizadas. Algumas diferenças podem ser observadas em relação ao número de etapas: na técnica de Sanger eram necessários dois processos, enquanto na nova geração à amplificação dos nucleotídeos e detecção podem ser realizados em uma única etapa
· A vantagem mais marcante em relação aos NGS é o custo: após o investimento com o equipamento, o valor por megabase é menos que $0,10, sendo possível sequenciar genomas completos em menos de uma semana. Outra mudança significativa é que o método de Sanger produz um baixo rendimento, ou seja, para obter bons resultados são necessárias altas concentrações de DNA. Além disso, ele fornece padrões únicos de sinal, em eletroforese, para cada sequência gerada. As NGS, por sua vez, pode ser realizada em baixas concentrações de DNA e produz milhares de sinais em paralelo para a mesma sequência, podendo ser usados pequenas amostras de DNA para realização do sequenciamento. Por fim uma, das diferenças que vale ser ressaltada é o tamanho da sequência produzida. No método de Sanger, mesmo após décadas de aprimoramento da técnica, é possível obter fragmentos com aproximadamente 100 pares de bases. Os primeiros sequenciadores na nova geração eram capazes de produzir fragmentos com apenas 150 a 200 pares de bases. Os sequenciadores atuais podem produzir bases de até 500 pares de bases (STROHER, 2018).
· Após mais de uma década da descrição dessas novas tecnologias, elas vêm ganhando maior notoriedade na ciência, com cada vez mais cientistas percebendo a superioridade dessas técnicas de nova geração. Uma consequência disso é o fato dos centros genômicos estarem diminuindo as rotinas com sequenciadores Sanger e aumentando as NGS.
· Segundo Ferreira (2003), a análise da sequência genética de vários organismos, em especial, do ser humano impulsionou várias áreas da ciência. A identificação do gene causador da doença de Huntington no cromossomo 4 foi um dos grandes sucessos alcançados por essas técnicas e que mostram o potencial de aplicação desse tipo de tecnologia. Hoje, já são mais de 1.000 doenças que tiveram as regiões cromossômicas especificas mapeadas. O estudo do genoma também permitiu demonstrar que os genes necessários para o desenvolvimento de um organismo como o ser humano, menos que 40.000 genes, é menor que a quantidade do genoma de uma planta como o arroz, mais que 40.000 genes. A quantidade de dados gerados até o momento nos diversos projetos genoma são imensos, a comparação de sequência genicas entre espécies é uma das melhores utilizações de dados. A partir do cruzamento dessas informações é possível a criação de catálogos completos de genes, e, consequentemente de proteínas dos organismos, o que permite desvendar o papel de ambos.
· Nesse contexto, a ampliação da área de bioinformática, para que seja possível interpretar esses dados, provenientes de diversos tipos de pesquisas genômicas, é fundamental. A expectativa, a longo prazo, é utilizar esses dados para entender os complexos mecanismos moleculares que operam dentro da célula, ou seja, determinar as complexas interações proteicas que controlam as várias funções celulares, incluindo respostas ao estresse fisiológico, entre outros.
· Diversas aplicações ainda podem ser atribuídas às técnicas de sequenciamento genético, o conhecimento tão detalhado do DNA humano possibilita a identificação as mutações que provocam as doenças genéticas. De acordo com Bruno (2017), a análise dessas mutações permite um maior entendimento dessas doenças e de sua evolução no organismo, possibilitando o desenvolvimento de terapias, testes diagnósticos, que atuem mesmo antes do aparecimento dos sintomas e também fármacos com maior especificidade. Outra das aplicações de grande impacto na sociedade é o diagnóstico molecular de doenças infecciosas. As técnicas de sequenciamento permitem a identificação de diversos microrganismos como bactérias, vírus, fungos, protozoários. Basta se conhecer a sequência total ou parcial do patógeno, para que possam se desenhar primers que serviram de sondas complementares específicos ao DNA do microrganismo especifico.
· Dessa forma, é coletado material biológico do indivíduo e são feitos os processos de extração de DNA, juntamente ao DNA do patógeno. Caso o paciente esteja infectado, apenas o DNA do patógeno será amplificado em PCR, já que os primers adicionados se ligaram ao DNA do microrganismo. A partir desse método, é possível também fazer a quantificação dos agentes infecciosos, sendo esse procedimento importantes para: avaliações de contaminantes ambientais; determinação do nível de infecções; dosagem de carga viral; concentração de agentes patogênicos em vacinas.
· As tecnologias do DNA, em especial seu sequenciamento, tem aplicações também na identificação de paternidade e culpados em crimes. Essa área é conhecida como ciência forense e foca no estudo dos polimorfismos de pequenas sequências de nucleotídeos que se repetem em sequência. Várias áreas como essas, denominadas microssatélites, são identificadas gerando um padrão de bandas em eletroforese semelhante a um código de barras. Visto que combinação de dois alelos de cada uma das várias regiões analisadas determinam perfis únicos de DNA para cada indivíduo, exceto para gêmeos univitelinos, possibilitando a identificação de parentesco ou do DNA de vítimas ou criminosos cadastrados.
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· A PCR é usada hoje em muito laboratórios de pesquisa, de diagnóstico ou nas mais variadas industrias, tendo aplicações na identificação de DNA fetal, teste pré-natal, identificação de DNA bacteriano, observar polimorfismos. O mercado busca profissionais altamente especializados nessas mais variadas tecnologias de DNA e quem tenham disponibilidade para capacitação constate e verdadeiro amor pela genética e biologia molecular, a realização de cursos de especialização, cursos de pós-graduação são o caminho mais indicado para entrar nesse mercado, já que exigida excelência aos profissionais que trabalharam com técnicas, por vezes, de alta complexidade.