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ANÁLISE INSTRUMENTAL APLICADA À FARMÁCIA Profª. Isabela Pereira Gomes CRONOGRAMA Atividades Avaliativas Oficial 1: 70% do 1º bimestre - 7 pontos Parcial 2: 30% do 2º bimestre – 3 pontos – Relatórios, atividades em sala e resumo manuscrito Encontro Data Conteúdo 1 06/08 Introdução a Análise Instrumental, Exercícios 2 20/08 Aula prática I - Normas de laboratório, vidrarias, preparo de soluções – Lab. 211 3 03/09 Aula prática II – UV curva de calibração – Lab. 211 4 17/09 Aula teórica Introdução aos métodos Cromatográficos 5 01/10 Aula prática III – CCD – Lab. 211 6 08/10 AVALIAÇÃO OFICIAL 1 – TEÓRICO PRÁTICA 7 15/10 Recesso escolar 8 29/10 Aula teórica Introdução aos métodos espectroscópicos 9 12/11 Aula prática IV – Doseamento UV – Lab. 211 10 26/11 Aula teórica IV e RMN AVALIAR RESUMO MANUSCRITO Toda aula presencial tem que entregar o resumo manuscrito da unidade que foi vista no portal MODELO DE RELATÓRIO Disponibilizado no portal - mensagens MODELO DE RELATÓRIO Times tamanho 12 e com espaçamento 1,5 entre as linhas e duplo entre parágrafos Não esquecer de colocar citação e referência bibliográfica MODELO DE RELATÓRIO MODELO DE RELATÓRIO MODELO DE RELATÓRIO O que foi citado no texto deve estar na referência bibliográfica no final MODELO DE RELATÓRIO Todo texto científico deve possuir a citação da fonte em que foi retirado. Todo texto científico deve ser escrito com as próprias palavras. CÓPIA OU PLÁGIO É CRIME O Relatório deverá ser enviado por e-mail: isabelasje@hotmail.com CONTEXTUALIZAÇÃO E APLICAÇÃO DOSEAMENTO DE FÁRMACOS VERIFICAR A PRESENÇA DE CONTAMINANTES DOSEAMNETO DE METAIS PESADOS CONTROLE DE QUALIDADE Determinação da composição química de amostras Análise toxicológica DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE AMOSTRAS DESCONHECIDAS CONTEXTUALIZAÇÃO E APLICAÇÃO Ultravioleta Infravermelho RMNHPLC Eletroquímica ANÁLISE INSRTUMENTAL MERCADO DE TRABALHO Análise clínica Indústria de alimentos Indústria petroquímica – plástico, borracha, tintasIndústria Farmacêutica Toxicologia – perícia criminal ANÁLISE INSRTUMENTAL Pesquisa e desenvolvimento MERCADO DE TRABALHO 38 a 48% de álcool É a 3ª bebida destilada mais consumida no mundo e a 1ª no Brasil Para garantir a qualidade do produto, análises devem ser realizadas Análise da presença de espécies metálicas - COBRE Em concentrações elevadas, torna-se prejudicial à saúde humana ANÁLISE INSTRUMENTAL INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS QUÍMICA ANALÍTICA é um conjunto de técnicas destinadas a determinação da composição química de amostras. Determinação qualitativa ou quantitativa. CAFÉ 1 A 2,5% DE CAFEÍNA 7 A 10% ÁCIDOS CLOROGÊNICOS AMINOÁCIDOS, ETC INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS Os métodos analíticos são classificados como: - Clássicos – métodos de via úmida – precederam os métodos instrumentais por um século ou mais - Instrumentais QUÍMICA ANALÍTICA é um conjunto de técnicas destinadas a determinação da composição química de amostras. Determinação qualitativa ou quantitativa. Química analítica qualitativa Química analítica quantitativa MÉTODOS INSTRUMENTAIS O que está presente?? Quanto está presente?? INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS MÉTODOS CLÁSSICOS - Os componentes de interesse - Reações específicas gerando produtos que são reconhecidos por meio das cores, pontos de ebulição ou fusão, solubilidade – QUALITATIVA - Reconhecimento por medidas gravimétricas ou volumétricas – QUANTITATIVA ANALITO INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS MÉTODOS CLÁSSICOS - GRAVIMETRIA: método clássico - realizar a pesagem de um elemento ou composto definido em sua forma mais pura que é separado de uma quantidade ou amostra previamente conhecida. - VOLUMETRIA: método clássico - medição do volume de um reagente necessário e suficiente para efetuar determinada reação - titulação. Um indicador é usado para indicar quando uma reação se completou. Química analítica quantitativa INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS MÉTODOS CLÁSSICOS PROPRIEDADES VOLUME MÉTODOS INSTRUMENTAIS CONDUTIVIDADE INTERAÇÃO DE ÁTOMOS COM A RADIAÇÃO PESO Século XX FLUORESCÊNCIA Eletroanalítico Cor ANÁLISE QUÍMICA Composição Química das amostras MÉTODOS CLÁSSICOS MÉTODOS INSTRUMENTAIS QUALITATIVOS QUANTITATIVOS Ponto de ebulição Ponto de fusão Volumetria Gravimetria Baseados nas propriedades físicas e químicas Propriedades elétricas INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS Propriedades ópticas Espectrométrico Fluorescência Propriedades fluorescência MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS PROPRIEDADES CARACTERÍSTICAS MÉTODOS INSTRUMENTAIS Emissão de radiação Espectroscopia UV, fluorescência, Absorção de radiação Espectroscopia UV, infravermelho, RMN Espalhamento de radiação Turbidimetria, Raman Refração de radiação Refratometria Rotação de radiação Polarimetria, Dicroísmo circular Potencial elétrico Potenciometria Carga elétrica Coulometria Corrente elétrica Amperometria, Polarografia Resistência elétrica Condutometria Razão massa/carga Espectrometria de massas Características térmicas Calorimetria diferencial de varredura Necessitam de fonte de energia para estimular uma resposta mensurável CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS E FÍSCIAS ÚTEIS MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS CROMATOGRÁFICOS Grupo de procedimentos utilizados para separar analitos muito semelhantes entre si CROMATOGRÁFICOS MÉTODOS INSTRUMENTAIS Fonte de energia Resposta Fonte de energia Sistema em estudo Informação analítica Um instrumento para análise química converte informação sobre as características físicas ou químicas de um analito em informação que pode ser manipulada e interpretada por um ser humano. MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Resposta Informação analítica Descodificada As formas como essa codificação ocorrem são chamadas de “Domínios de dados” Objetivo final é obtenção de um resultado numérico que seja proporcional à característica físico-química de interesse do analito. MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS NÃO é fácil selecionar o método mais adequado. MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Definição do problema - Qual exatidão necessária - Qual a quantidade de amostra disponível - Qual é a faixa de concentração do analito - Quais componentes da amostra podem causar interferência - Quais são as propriedades físicas e químicas da amostra Característica de desempenho do instrumento - Precisão - Sensibilidade - Limite de detecção - Seletividade MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Critérios para seleção de métodos instrumentais Amostra: porção de um determinado material que representa a totalidade Analito: espécie que se deseja determinar em uma amostra Matriz: conjunto de todos os constituintes que compõem uma amostra Curva analítica ou curva de trabalho ou curva de calibração: representação gráfica da resposta do instrumento em função da concentração do analito provenientes de soluções-padrão Branco: sinal do instrumento na ausência do analito Limite de detecção: concentração ou massa mínima do analito que pode ser detectada em nível confiável pelo equipamento Exatidão: grau de concordância entre o valor medido (média de várias replicatas) e o valor de uma referência padrão Precisão: grau de concordância mutua entre os dados que foram obtidos do mesmo modo. Fornece uma medida de erro aleatório ou indeterminado de uma análise. MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS SELETIVO Capacidade de medir com precisão um composto específico mesmo em presença de outros componentes, como impurezas, produtos de degradação, etc. MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS • Repetibilidade: Grau de concordância entre resultados independentes obtidos com o MESMO MÉTODO, NO MESMO MATERIAL DE TESTE, SOB AS MESMAS CONDIÇÕES (mesmo dia, mesmo operador, mesmo equipamento) • Reprotutibilidade: Grau de concordância entre resultados independentes obtidos com o MESMOMÉTODO, PARA UM MATERIAL IDÊNTICO, SOB CONDIÇÕES DIFERENTES (dias diferentes, diferentes operadores, diferentes equipamentos) MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Etapas Exemplos de procedimentos Amostragem Depende do tamanho e natureza física da amostra Preparação da amostra Redução do tamanho, homogeneização, secagem, determinação do peso ou volume Dissolução da amostra Aquecimento, diluição com uso de solventes Remoção de interferentes Filtração, extração com solvente, separação cromatográfica Medidas na amostra Padronização, calibração Resultados Tratamento dos dados, cálculos Apresentação dos resultados Gráficos, tabelas Etapas de uma análise instrumental MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Amostragem Por mais que um equipamento atenda aos melhores critérios de medição, se a amostra enviada ao laboratório não for representativa do material, ou se o método de preparo da amostra não for adequado, o resultado obtido não representará a realidade da amostra. MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Como regra, diz-se que, aproximadamente, 1/3 do erro proveniente de uma análise é decorrente de uma amostragem inadequada. Amostragem • Estágios anteriores à amostragem Material a granel Parcelas Parcelas Parcelas Amostra bruta Amostra Laborial Amostra de análise • Material a granel pode não ser homogêneo • Retira-se amostra primária dividida em parcelas de forma aleatória • A combinação forma a amostra bruta – grande para análise • Amostra bruta é dividida para ser enviada ao laboratório de análise – amostra laborial • Amostra laborial pode necessitar de um pré- tratamento para então chegar à amostra de análise Se o material de análise for homogêneo – uma única amostra primária basta MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Amostragem MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS PROBABILÍSTICA NÃO-PROBABILÍSTICA Todos os elementos da população têm a mesma probabilidade de integrarem a amostra – base matemática Amostragem MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Amostragem Definição Aleatória simples Seleção da amostra por sorteio ou tabela de números Amostragem MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Amostragem Definição Aleatória Estratificada O lote é dividido em sublotes e, então, uma amostragem aleatória simples é realizada Amostragem MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Amostragem Definição Aleatória Sistemática O produto é ordenado e a retirada da amostra é feita periodicamente. Por exemplo, para estudar a satisfação de um serviço, podemos eleger sistematicamente e perguntar a 1 de cada N clientes que nos visitam. Amostragem MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Amostragem Definição Conglomerado Dividir a população em grupos com características específicas. Seleção aleatória de um grupo para estudo. Por exemplo, se queremos estudar qual a proporção de argentinos que fumam, podemos dividir o total da população em províncias e selecionar algumas delas para estudo. Etapas Exemplos de procedimentos Amostragem Depende do tamanho e natureza física da amostra Preparação da amostra Redução do tamanho, homogeneização, secagem, determinação do peso ou volume Dissolução da amostra Aquecimento, diluição com uso de solventes Remoção de interferentes Filtração, extração com solvente, separação cromatográfica Medidas na amostra Padronização, calibração Resultados Tratamento dos dados, cálculos Apresentação dos resultados Gráficos, tabelas Etapas de uma análise instrumental MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Técnica Principais características Extração liquido-líquido Utilizada para a extração de compostos pouco voláteis. Produz grandes quantidades de resíduos químicos. Extração em Fase Sólida Utilizada para matrizes complexas. Altas recuperações do analito. Extração por Fluído Supercrítico Utilizada para amostras sólidas, semissólidas ou líquidas. Não necessita de solventes orgânicos. Cromatografias Utilizadas para separar analito muito semelhantes entre si Remoção de interferentes MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS O senhor João Pedro, produtor de cachaças artesanais, contratou o laboratório de análises físico-químicas MetalLabor para realizar as análises de metais requeridas na legislação, já que ele tem interesse em iniciar a exportação para outros países. O laboratório contratado se responsabilizou por todo o processo analítico, desde a coleta do material até a emissão do resultado final. Assim que recebeu o laudo com os resultados, João Pedro percebeu que a concentração de cobre encontrada foi de 6 mg.L-1. Desconfiado do resultado, contratou um segundo laboratório, LabSulTox, para realizar a análise de cobre no mesmo lote de cachaça e, dessa vez, o resultado obtido foi de 1,8 mg.L-1. (Obs: limite máximo permitido em vários países é de 2 mg.L-1.) Baseado nos seus conhecimentos, quais são as possíveis causas dessa variação tão grande nos resultados da análise de cobre? SITUAÇÃO PROBLEMA - VOCÊ É O FARMACÊUTICO MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS 1. Qual tipo de análise foi feita? Qualitativa ou quantitativa? Clássica ou instrumental? 2. O que pode ter acontecido? Lote produzido não foi uniforme – problema no processo de produção. 3. Outra hipótese pode ser um problema na amostragem ou mesmo no procedimento analítico. 4. Como resolver essa questão? Não se pode confiar em nenhum dos dois resultados. 5. Uma hipótese seria coletar amostras periodicamente do mesmo lote e analisá-las em um mesmo laboratório. SITUAÇÃO PROBLEMA - VOCÊ É O FARMACÊUTICO MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS SITUAÇÃO PROBLEMA - VOCÊ É O FARMACÊUTICO Caso os resultados forem diferentes, pode- se mudar de laboratório. Se ainda sim os resultados ficarem diferentes, o problema estará no lote, no processo de produção. MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS SEÇÃO 1.2 A maioria dos métodos analíticos, independentemente da propriedade a ser medida, requer algum tipo de calibração e, para isso, são utilizados padrões analíticos. Padrões analíticos são soluções líquidas de uma espécie química com estabilidade e natureza confiáveis Geralmente, apresentam alto grau de pureza e podem ser adquiridos por fornecedores específicos, ou ainda podem ser preparados no próprio laboratório, dependendo da estrutura disponível. Calibração e padronização de métodos instrumentais CALIBRAÇÃO determina a relação entre a resposta analítica e a concentração do analito. Geralmente é realizado pelo uso de padrões químicos. TIPOS DE CALIBRAÇÃO: - Calibração com padrões externos - Método de adição de padrão - Método do padrão interno MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Calibração e padronização Calibração com padrão externo • É o método mais utilizado devido à sua simplicidade e facilidade de interpretação. • Dados conhecidos da concentração do padrão de calibração são combinados com dados de uma amostra de concentração desconhecida para gerar uma resposta ao problema. • A denominação de padrão externo é devido ao fato de que o padrão está separado, ou fora de contato, com a amostra de concentração desconhecida. • Envolve a comparação da resposta instrumental da amostra com a resposta instrumental do padrão. MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Calibração e padronização Calibração com padrão externo • Vantagem: é simples de realizar e se aplica a um conjunto grande de técnicas instrumentais. • Desvantagem: o método não permite corrigir o efeito da matriz, quando existente, na qual se encontra o analito. • Para se elaborar a curva de calibração é necessário medir a resposta do instrumento para um determinado número de concentrações do padrão analítico (4 pontos). Sa α C MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Calibração e padronização Exemplo de Calibração com padrão externo • Solução “z” de concentração conhecida – padrão externo • Mede absorbância no espectrofotômetro Absorbância: absorção de luz pelo cromóforo presente na amostra Cromóforo: grupos funcionais que absorvem radiação eletromagnéticaX Y Concentração padrão Absorbância 0,1 0,0025 0,2 0,0058 0,3 0,0081 0,4 0,0104 MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS R2 – Coeficiente de determinação. Quanto maior o R2, mais explicativo é o modelo. 99,12% da varável dependente (absorbância) é explicada pela concentração da amostra (varável independente). Calibração e padronização Exemplo de Calibração com padrão externo MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Calibração e padronização Exemplo de Calibração com padrão externo Como calcular a concentração da minha solução amostra? X Y Concentração padrão Absorbância 0,1 0,0025 0,2 0,0058 0,3 0,0081 0,4 0,0104 ? 0,0090 Y = 0,026x + 0,0002 0,0090 = 0,026x + 0,0002 x = 0,034 MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Calibração e padronização Calibração por adição de padrão • Importante para a análise química quantitativa de espécies inorgânicas e orgânicas pelo fato de permitir atenuar os efeitos de interferência da matriz • A adição de padrão é especialmente apropriada quando a composição da amostra é desconhecida ou complexa e afeta o sinal analítico • Na prática, as soluções padrão da curva analítica são preparadas na matriz da amostra contendo o analito • A concentração do analito, na amostra desconhecida, é determinada por extrapolação, fazendo y na equação da reta igual a zero (e tomando o módulo de x), ou pela fórmula: 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 𝑐𝑥 = 𝑏 . 𝑐𝑝 𝑎 . 𝑉𝑎 MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Calibração e padronização Exemplo calibração por adição de padrão Alíquotas de 10 ml de uma amostra de água natural foram pipetadas para balões volumétricos de 50ml. Volumes extados de 0,00; 5,00; 10,00; 15,00; e 20,00 ml de uma solução padrão contendo 11,1 ppm de Fe3+ foram adicionados em cada balão, seguidos de excesso de íon tiocianato, para formar o complexo de cor vermelha Fe(SCN)2+. Após diluição ao volume, as respostas do instrumento S para cada uma das cinco soluções, medidas com um colorímetro, foram 0,240; 0,437; 0,621; 0,809 e 1,009, respectivamente. Qual a concentração de Fe3+ na amostra de água? MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS Calibração e padronização Exemplo calibração por adição de padrão X Y Volume padrão (ml) Absorbância 0,00 0,240 5,00 0,437 10,00 0,621 15,00 0,809 20,00 1,009 MÉTODOS ANALÍTICOS INSTRUMENTAIS INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS Calibração e padronização Exemplo calibração por adição de padrão Y = ax + b Y = 0,0382x + 0,2412 𝑐𝑥 = 𝑏 . 𝑐𝑝 𝑎 . 𝑉𝑎 𝑐𝑥 = 0,2412 . 11,1 0,0382 . 10 𝑐𝑥 = 2,677 0,382 𝑐𝑥 = 7,01 ppm Fe3+ Determinação de Fe3+ em água por colorimetria Concentração de padrão (cp) 11,1 ppm Volume de amostra (Va) 10 ml INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS Calibração e padronização Exemplo calibração por adição de padrão Y = ax + b Y = 0,0382x + 0,2412 0 = 0,0382x+ 0,2412 x = -6,31 ml • Esse valor de concentração do analito da amostra também pode ser calculado por extrapolação gráfica • Volume de padrão (x) correspondente ao zero de absorbância – y = 0 X Y Volume padrão (ml) Absorbância 0,00 0,240 5,00 0,437 10,00 0,621 15,00 0,809 20,00 1,009 -6,31 0 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS Calibração e padronização Exemplo calibração por adição de padrão X Y Volume padrão (ml) Absorbância 0,00 0,240 5,00 0,437 10,00 0,621 15,00 0,809 20,00 1,009 -6,31 0 𝑐𝑥 = 𝑉𝑝. 𝑐𝑝 𝑉𝑥 𝑐𝑥 = 6,31.11,1 10 𝑐𝑥 = 7,01 𝑝𝑝𝑚 𝐹𝑒3+ INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS Calibração e padronização Calibração com padrão interno • Neste método, uma quantidade conhecida do padrão interno é adicionada a todas as amostras. • Entretanto, obter um padrão interno com propriedades físico-químicas compatíveis com o analito não é simples. • O padrão interno não deverá estar presente na amostra, ou se estiver, deverá ser em quantidades abaixo do limite de detecção. • O padrão interno deve prover um sinal que seja similar ao sinal do analito, mas suficientemente diferente, de forma que os dois sinais sejam distinguíveis pelo instrumento. Lítio é um bom padrão interno para determinar sódio e potássio no sangue, pois o comportamento químico do lítio é similar aos dois analito, mas ele não ocorre naturalmente no sangue INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS Calibração e padronização Exemplo de calibração com padrão interno Determinação de sódio em sangue por espectrometria de chama usando lítio como padrão interno Concentração de padrão interno - 1.000 ppm de Li Concentração de padrão de Na (ppm) INa ILi INa/ILi 0,10 0,11 86 0,001279 0,50 0,52 80 0,0065 1,00 1,8 128 0,014063 5,00 5,9 91 0,064835 10,00 9,5 73 0,130137 4,4 95 0,046316 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS Calibração e padronização Exemplo de calibração com padrão interno Determinação de sódio em sangue por espectrometria de chama usando lítio como padrão interno Concentração de padrão interno - 1.000 ppm de Li Concentração de padrão de Na (ppm) INa ILi INa/ILi 0,10 0,11 86 0,001279 0,50 0,52 80 0,0065 1,00 1,8 128 0,014063 5,00 5,9 91 0,064835 10,00 9,5 73 0,130137 4,4 95 0,046316