Aula Prática - Extração e Purificação do DNA

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Extração e Purificação do DNA 
1. Lise Celular (tampão de lise) 
2. Purificação (desnaturante/desnaturação protéica) 
3. Precipitação DNA (etanol absoluto) 
4. Lavagem do DNA (etanol 70%) 
5. Ressuspensão (TE) 
 
 Os alunos deverão se dividir em grupos de 3 a 5 pessoas 
 Utilizando uma pinça cada grupo deverá obter sua amostra de fígado 
 Em um microtubo de 1,5ml, introduzir os materiais biológicos coletados 
 Adicionar 800 μL da solução de lise de membrana (SLM) e acrescentar 5 μL de proteinase K. 
Homogeneizar com auxilio do vórtex e colocar em banho-maria por 20 min a 55ºC 
(lise de membrana = atua sobre os lipídeos, promovendo o rompimento das membranas e a 
liberação do conteúdo celular. Diferentes tipos de detergentes são utilizados, como o dodecil 
sulfato de sódio (SDS) e brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB); Proteinase K = enzima que tem 
como função acelerar a reação química e desnaturar as proteínas que estão no citoplasma que 
são consideradas degradantes, que degradam o material biológico que eu quero manter 
integro. Além de inativar as nucleases que poderiam degradar o DNA ou o RNA durante a 
purificação; Banho-maria = para desnaturar as enzimas) 
 Centrifugar por 5 min a 8000 RPM 
 Desprezar o sobrenadante e soltar bem a o pellet do fundo do tubo (colocar em uma 
temperatura elevada para agilizar o pellet a secar, com tempo vai na temperatura ambiente) 
 No fluxo laminar, adicionar 400 μL da solução de lise nuclear (SLN), 100 μL de NaCl (5M), e 500 
μL de fenol:clorofórmio (1:1). Em seguida, homogeneizar bem, pipetando a amostra várias 
vezes. Centrifugar por 10 min a 8000 RPM. (purificação = tentar eliminar as impurezas, o 
máximo possível que tenha naquela solução; Usar a lise nuclear para tentar lesionar o núcleo, 
desestabiliza utilizando sal, deixa a solução bem salina e coloca o fenol:clorofórmio, que vai 
ajudar a separar as fases do tubo de ensaio, desnaturar mais proteínas - a proteinase não é o 
suficiente; Centrifugar pra realmente separar essas fases = a fase aquosa (transparente) é de 
interesse porque possui o DNA) 
 Transferir 300 μL da fase superior para um tubo novo sem aspirar à fase intermediária (muito 
cuidado neste momento), e adicionar 500 μL de etanol (-20ºC) 
(não da pra usar todo o liquido da fase aquosa do DNA para colocar no PCR e para correr na 
eletroforese, é através da precipitação que o DNA vai aparecer/ quanto mais gelado o etanol 
estiver, menos solúvel o DNA vai estar (esbranquiçado), aglutinando e mais rápida vai ser a 
precipitação, induzindo a transição estrutural nas moléculas e fazendo com que os ácidos 
nucléicos agreguem ainda mais) 
 Ressuspender o pellet em etanol a 70% (para eliminar impurezas presentes na amostra) 
 Homogeneizar bem por inversão e centrifugar por 15 min a 12000 RPM 
 Desprezar o sobrenadante e secar o tubo em papel. Secar o pellet 
 Adicionar 50 μL de TE (tampão). Estocar a -20ºC (pega o DNA puro e coloca na solução tampão 
para preservar e usar para fazer o PCR) 
Obs (soluções prontas): -SLM (pH8): 0,01 M Tris-HCl, 320mM sacarose, 5mM MgCl2, 1% Triton X 
100. -SLN (pH8): 0,01 M Tris-HCl, 11,4 mM citrato de sódio, 1mM EDTA, 1% dodecil sulfato de 
sódio (SDS)