Apoptose: Morte Celular Programada

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Apoptose
 1951 – morte celular como componente normal do desenvolvimento animal (importante tanto para o desenvolvimento embrionário quanto para processos em adultos)
 1965 – “morte programada”: uma série de eventos que culmina na morte da célula (morte celular ativa)
 1972 – Apoptose vs Necrose
 Características de Necrose: 
- Aumento do volume do citoplasma, 
- Destruição de organelas, 
- Rompimento da membrana e extravasamento do conteúdo da célula
- Morte celular passiva ou acidental
 Características da Apoptose: 
- Encolhimento do citoplasma 
- Condensação da cromatina
- Circunvoluções da membrana plasmática
- Organelas ficam intactas até quase o final do processo
- Sem extravasamento do conteúdo (corpos apoptóticos)
- Célula morta costuma se encontrar entre células vivas e é removida por fagocitose
- Morte celular programada ou regulada
 Morte celular regulada não é sinônimo de apoptose – apoptose é um tipo de morte regulada. 
Fragmentação internucleossomal do DNA
É a fragmentação entre os nucleossomos (duas voltas de DNA nas proteínas histonas), porém mais intensamente na cromatina em configuração aberta; consequência da atividade de uma endonuclease. Essa fragmentação característica do genoma pode ser identificada in situ pela técnica TUNEL.
A técnica TUNEL (Terminal deoxinucleotidil transferase Uracil Nick End Labeling) consiste na adição, por meio da enzima terminal deoxinucleotidil transferase (TdT), de nucleotídeos modificados e marcados com moléculas fluorescentes no terminal 3OH’ às fitas de DNA fragmentadas. 
A condensação da cromatina pode ser marcada com DAPI para avaliar a atividade apoptótica. Se houver uma maior condensação, então temos uma maior indução de apoptose. 
Indução de Apoptose
Exposição de Fosfatidilserina (PS)
A Fosfatidilserina normalmente se encontra no folheto interno da membrana plasmática, mas na apoptose é movida para a membrana externa, servindo como sinal para a ação de macrófagos. A exposição da fosfatidilserina (PS) pode ser marcada como anexina V. 
Indutores de Apoptose
- Dano no DNA 
- Proteínas mal enoveladas
- Infecção viral
- Falta de suporte trófico (falta de sinais e fatores que permitem a sobrevivência da célula)
Mecanismos de apoptose
Os mecanismos de apoptose dependem das características morfológicas e de mecanismos ativadores de caspases. As caspases são cisteínas proteases (possuem uma cisteína no sítio ativo) ativadas durante a apoptose, que clivam substratos específicos. Elas são sintetizadas na forma de procaspases que são clivadas e ativadas por outras caspases, resultando em uma cascata de ativação proteolítica. Existem duas classes de caspases, 
1. Iniciadoras (cas-8 e cas-9) se encontram em monômeros no citosol. Iniciam o processo apoptótico.
2. Efetoras (cas-3) já se encontram em dímeros. Ativada pela caspase iniciadora. 
Para a ativação de caspases é preciso que ocorra um sinal apoptótico. Primeiramente, as caspases iniciadoras são ativadas por aproximação (procaspases em monômeros, que se aproximam, se auto clivam, se tornando caspases iniciadoras). Os sinais apoptóticos disparam um conjunto de proteínas adaptadoras, carregando múltiplos sítios de ligação para o domínio aminoterminal da caspase. 
Uma vez que as células adaptadoras tenham ligado, as caspases iniciadoras dimerizam e são, desse modo, ativadas, levando a clivagem de um sitio específico nos seus domínios de proteases. Cada domínio de protease é assim rearranjado em uma subunidade maior e uma outra subunidade menor. 
Após a clivagem em um sítio do domínio de protease por uma caspase iniciadora, o dímero de caspases efetoras sofre uma mudança conformacional que o ativa. A caspase efetora cliva uma variedade de proteínas-chave, levando à morte controlada da célula.
As caspases efetoras tem alvos específico de ação como: 
- Proteínas de citoesqueleto e de adesão como, actina e proteínas associadas a actina; filamentos intermediários; tubulinas; focal adhesion (FAK), cateninas e caderinas
- Lâmina Nuclear
- Fatores de transcrição e tradução
- Proteínas de Golgi e Retículo Endoplasmático para a fragmentação dos mesmos
- Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) a atividade de PARP depleta a célula de ATP, portanto a quebra de PARP mantém os estoques de ATP necessários para a apoptose. 
- Inativa o ICAD que libera a endonuclease CAD (caspase activated dnase)
- Inativa enzimas de reparo de DNA
- Mdm-2 (murine double minute) proteína que ao ser clivada libera a p53 que se transloca para o núcleo e ativa Bax.
A fragmentação internucleossomal do DNA é feita pela CAD (caspase activated DNAse) → CAD inativa está ligada a iCAD (inibidora de CAD), e caspase-3 cliva iCAD, o que permite a ação da DNAse.
Vias de início da apoptose
Ambas as vias são independentes, só se encontram nas caspases efetoras. 
Via Extrínseca Via de receptores de morte na superfície celular.
Essa via é ativada pela ligação nos receptores FasL, TNF-R, TRAIL (receptores de morte). A ativação de Fas na superfície da célula alvo pelo ligante Fas na superfície de um linfócito T (citotóxico) matador dispara a via extrínseca. 
Quando ativado pela ligação do ligante Fas, domínios de morte na cadeia citosólica dos receptores de morte Fas, ligam-se a proteínas adaptadoras intracelulares, que por sua vez, ligam caspases iniciadoras, formando um complexo de sinalização indutor de morte (DISC). Uma vez dimerizadas e ativadas em DISC, as caspases iniciadoras clivam seus parceiros e então ativam caspases efetoras para induzir apoptose.
Via Intrínseca Via mitocondrial
Essa via depende da liberação de proteínas mitocondrial no citosol. Estímulos apoptóticos intracelulares provocam a liberação do citocromo C na mitocôndria, que interage com APAF-1. 
A ligação do citocromo C induz APAF-1 a se desenovelar parcialmente, expondo um domínio que interage com o mesmo domínio em outras moléculas ativadas de APAF-1. Sete proteínas APAF-1 ativadas formam um grande complexo na forma de um anel chamado apoptossoma. 
Cada proteína APAF-1 contém um domínio de recrutamento de caspases (CARD) e esses agrupados acima do eixo central do apoptossoma. Os CARDs ligam-se em domínios similares em múltiplas moléculas de caspases-9, que são então recrutadas para o apoptossoma e ativadas. Uma vez ativadas, a capase-9 cliva, dessa forma, as caspases efetoras que vão induzir a apoptose. 
Como ocorre a liberação do citocromo C
A família BCL-2 possui proteínas anti-apoptóticas e pró-apoptóticas, que impedem e contribuem, respectivamente, para a saída do citocromo C.
 Estímulo apoptótico → proteínas pró-apoptóticas Bax e Bak formam oligômeros na membrana mitocondrial externa permitindo a saída do citocromo C da mitocôndria para o citoplasma, enquanto as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 ou Bcl-XL impedem a formação dos oligômeros. Se houver Bcl-2 o suficiente para impedir a ação de Bax, a tendência é a sobrevivência. 
Fatores de sobrevivência (suporte trófico) ativam receptores que induz fatores de transcrição, que induzem a expressão da proteína Bcl-2, bloqueando a apoptose. 
Nível de Bcl-2: muito importante; existem proteínas da família BCL-2 que possuem apenas o domínio BH3 chamadas de pro-apoptotic BH3-only proteins (Bad, Bim, Bid, Puma, Noxa), que auxiliam a saída do citocromo C da mitocôndria inibindo Bcl2, o que impede a inibição da ação de Bax.
Mecanismos moleculares de controle da família BCL-2
· A p53 modula a transcrição de genes da família BCL-2, como Noxa, Puma e Bax
 → resposta ao dano de DNA.
· CHOP (ou GADD153) diminui a transcrição do gene da proteína Bcl-2; CHOP (fator de transcrição) é ativada quando há o comprometimento no enovelamento proteico (estresse de retículo endoplasmático)
· Exemplo de modificações pós-traducionais: proteína Bad não fosforilada se liga a Bcl-XL, que não se liga ao Bax, que se liga a outras Bax, proporcionando a saída do citocromo C da mitocôndria → APAF-1 → caspase-9; quando está fosforilada, Bad se liga a 14-3-3, permitindo que Bcl-XL iniba a ação de Bax → sobrevivência. [a célula édependente de IL-3 como fator trófico, que permite por vias de sinalização a fosforilação de Bad → sobrevivência].
· Outro exemplo: via de ERK (quinase) → fosforilação de Bim → sinal para que seja ubiquitinada (degradação) → ação anti-apoptótica
· Outro: Bid pode ser clivada por caspase-8 (iniciadora ativada por receptor de morte) por um estímulo apoptótico → ativação de Bid (tBid) → apoptose. (crosstalk via intrínseca e extrínseca)
· Adendo: estresse no retículo → ativação da caspase-12, mas em células Bax-/- e Bak-/- não há a clivagem (ativação) de cas-12; Bax e Bak podem estar localizados no próprio retículo, além da mitocôndria.
· Existe trabalhos que afirmam que cas-12 purificada in vitro pode gerar cas-9, ou seja, clivar procaspase-9.
 Via extrínseca
Via intrínseca