proteinas recombinantes ED

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Expressão de 
Proteínas 
Recombinantes
Professora Sílvia Schreiber
silvia.schreiber@estacio.br
Mas, se além de produzir cópias idênticas de um gene,
Você precisar produzir as proteínas que esses genes codificam?
Proteínas → macromoléculas 
presentes em todas as nossas 
células - peças chave nos 
processos biológicos
Compostas por uma combinação 
de subunidades monoméricas 
chamadas de aminoácidos
1982 → insulina recombinante foi aprovada nos EUA 
1ª proteína terapêutica produzida por técnicas biotecnológicas
Função → composição AA e estrutura
Proteínas Recombinantes
A produção de proteínas recombinantes permite obter benefícios em várias áreas:
- farmacologia
- biologia;
- bioquímica;
- microbiologia;
- genética;
- biotecnologia;
- agricultura...
São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes clonados 
através da técnica de DNA recombinante
Como obter uma proteína recombinante depois 
de obter o gene de interesse?
Expressão Heteróloga 
Induzir um organismo a expressar uma determinada proteína de 
interesse, a qual originalmente não expressa
Produção de proteínas em grande quantidade: 
➢ estudos estruturais e funcionais
➢ fins terapêuticos e profiláticos
➢ utilização em escala industrial
Melhoramento animal e vegetal
Plantas resistentes a pragas e a diferentes meios nutritivos
Animais de maiores dimensões, mais férteis e carne com maior qualidade
Criação de modelos animais
Estudo da estrutura, função e regulação de um gene, além de facilitar a compreensão da
fisiopatologia da doença
Principais Aplicações
Fármacos e fatores de coagulação
Terapia Gênica
Possibilidade de introdução de um gene num organismo e consequente correção de
doenças genéticas
Exemplos de Proteínas Recombinantes
⚫ Hormônio de crescimento humano – administração durante a infância →
correção dos casos de nanismo
⚫ Anticoagulantes – ativadores de plasminogênio tecidual que por sua vez ativam a
plasmina, enzima que dissolve os trombos → evita ataques cardíacos
⚫ Superóxido Dismutase – previne oxidação das células
⚫ Anticorpos monoclonais – usados em testes
diagnósticos; transporte direcionado (farmacos,
toxinas, componentes radioativos para terapia
cancerígena)...
➢ conhecer toda a sequência nucleotídica que deseja utilizar
➢ conhecer todo o tamanho da sua sequência
➢ conhecer o organismo do qual a sequência será obtida
Determinação do vetores de expressão:
✓ Tamanho do fragmento de DNA incorporado
✓ Capacidade de expressar a ptn em um determinado tipo celular (bactérias,
fungos, células de insetos ou mamíferos)
✓ Durabilidade de expressão
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Vetores de expressão
Vetores de expressão
Precisam possuir promotores de
transcrição derivados da célula
hospedeira imediatamente adjacentes
ao sítio de inserção
Devem conferir altos níveis de
expressão e ser induzíveis
Plasmídeos
Segmento de DNA independente ao cromossomo, encontrado em diversas bactérias
Conformação circular → aceitação e manutenção da integridade do DNA exógeno que será
incorporado
Plasmídeos
origem de replicação própria → independente dos cromossomos
Vetores virais 
mais utilizados na produção da Vacinas
Por serem vetores vivos, ao serem utilizados na produção de vacinas, os indivíduos
imunizados desenvolvem ampla gama de respostas imunológicas, incluindo
respostas citotóxicas células T-CD8 dependentes e a produção de anticorpos
Vírus não patogênicos, altamente atenuados, que 
são capazes de produzir antígenos de outros 
patógenos quando inoculados em indivíduos 
vacinados
Exemplo de vetores mais utilizados em Terapia Gênica:
Vetor YACVetor YBAC
Transformação bacteriana
Inserção do vetor contendo seu gene de interesse para que, por meio 
da expressão heteróloga, o produto do gene seja expresso 
Transformação
Célula incorpora e exprime um fragmento de material genético exógeno
Métodos de introdução do DNA recombinante:
✓ Eletroporação;
✓ Transformação Química
✓ Bombardeamento de DNA revestido de Tungsténio
(biobalistica);
✓ Microinjeção
Modern Genetic Analysis
Eletroporação
Pulso elétrico é aplicado às células
bacterianas → aumento temporário da
permeabilidade das suas membranas
(formação de poros) → passagem de
macromoléculas, como o plasmídeo
Transformação Química
Células bacterianas incubadas com uma
solução de cloreto de cálcio (CaCl) em
baixas temperaturas, na tentativa de
inibir a repulsão eletrostática entre o
plasmídeo e a membrana celular →
choque térmico → bactérias tornam-se
receptoras ao vetor
Biobalística
Descrito de diferentes formas e denominado de
várias maneiras: bombardeamento de partículas,
bombardeamento de micropartículas, aceleração
de partículas, biolística, “gene gun”, entre outros
Método físico para a introdução de ácidos nucléicos e outras substâncias
no interior de células e tecidos intactos, pela aceleração de
micropartículas de metal a alta velocidade
Microinjeção
Processo preciso e específico para introdução de macromoléculas de material
exógeno, utilizam-se microscópio, micromanipuladores (micropipetas de vidro e
microseringas), câmara asséptica que não sofra vibrações, com temperatura e
umidade relativa controlada dentro de uma célula ou compartimentos específicos dela
de maneira não letal
Método trabalhoso, requerer instrumentos caros, grande habilidade de manuseio e
muito tempo, não sendo indicado quando se deseja um grande número de proteínas
Como selecionamos as bactérias 
recombinantes em um meio de cultura?
• Meio sólido 
• Meio Líquido 
MEIO DE CULTURA 
SELETIVO
Extração e purificação de proteínas
• Extração → lise celular
• Purificação → Cromatografia de afinidade (ezm/substrato)
Confirmação da transformação por PCR de 
colônia e Eletroforese
Mas como selecionar a região que vai expressar a 
proteína de interesse, sendo que o RNA contem 
exons e introns?
• Bactéria não faz splicing → ela vai tentar sintetizar a ptn a partir do
pré-RNAm (exons e introns)
• Necessidade de um fragmento de DNA que só contenha exons
DNA COMPLEMENTAR - cDNA
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Selecionar somento o RNAm maduro → adição da Cauda Poli A =~200 Adenosinas
Produção do DNA dupla fita, complementar ao RNAm 
Produção de proteínas recombinantes em E. coli
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Bastante explorada nas últimas décadas;
Vantagens em relação aqueles desenvolvidos para outros organismos:
a) custo mais baixo dos nutrientes utilizados para sua multiplicação;
b) tempo curto para acumulação de biomassa;
c) possibilidade de escalonamento na produção;
d) facilidade de manipulação do sistema.
Desvantagens:
a) Não realiza MPTs;
b) Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias;
c) Dobramento incorreto de proteínas;
d) Degradação proteolítica;
A substituição dos produtos extraídos de animais pelos fabricados de maneira
recombinantes trouxe diversas vantagens, das quais podemos destacar:
✓aumento de pureza e concentração do componente ativo
✓facilidade de escalonar
✓possibilidade de fazer um produto “sob-medida”
✓custo-benefício de produção
Embora já existam diversas proteínas recombinantes disponíveis no mercado, a
projeção é de aumento na quantidade e qualidades desses produtos
biotecnológicos