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INSULINA E OS MÉTODOS DE ANÁLISE
 
Sanches, G.M; Viana, L.L.; Foloni, M.S.; Chessa, N.L.
Centro Universitário das Américas – FAM
E-mail: natalialchessa@gmail.com
 
RESUMO 
A insulina é um importante hormônio produzido pelo pâncreas e é também responsável pela manutenção do metabolismo junto à glicose. Seu déficit pode acarretar em uma doença conhecida como diabetes. Esse estudo tem como objetivo realizar uma revisão na literatura sobre a insulina, bem como suas principais características químicas, métodos de verificação deste hormônio no corpo humano, análises quantitativas para identificação de doenças e possíveis tratamentos. Enfatiza os seguintes temas: estrutura e síntese, classificações, importância no organismo, resistência insulínica, índices de Homa tipo IR e BETA e o teste ELISA.
Palavras chave: Insulina; Diabetes; Resistência insulínica; Bioquímica; Teste ELISA.
ABSTRACT
Insulin is an important hormone produced by the pancreas and is also responsible for maintaining glucose metabolism, its deficit can lead to a disease known as diabetes. This study aims to conduct a review in the literature about insulin, as well its main chemical characteristics, methods of verification of this hormone in the human body, quantitative analyses for identification of diseases and possible treatments. It emphasizes the following themes: structure and synthesis, classifications, importance in the organism, insulin resistance, IR and BETA homa indices and the ELISA test.
Keywords: Insulin; Diabetes; Insulin resistance; Biochemistry; ELISA test.
INTRODUÇÃO
A história da insulina
A descoberta da insulina foi um marco memorável na história do tratamento de diabetes e resultou em um prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia pelo feito dos estudiosos.
Com o objetivo de tratar uma das doenças mais antigas da humanidade, o diabetes mellitus, em 1889, estudos com a retirada do pâncreas de cães possibilitaram a descoberta de efeitos similares ao diabetes, como diurese freqüente, sede incontrolável e emagrecimento acentuado, isso porque a remoção do pâncreas provoca a perda de glicose na urina e o aumento da mesma no sangue.
Com isso, em 1921, na tentativa de demonstrar que a secreção exócrina pancreática poderia destruir o composto químico sintetizado pelas ilhotas celulares do tecido pancreático capazes de regular a glicose, descobertas em 1869 por Langerhans, a insulina foi descoberta e isolada por Banting e Charles Best.
O primeiro estudo realizado com humanos foi em 1922, com um menino de 14 anos chamado Leonard Thompson que estava em estado clínico crítico. Foram injetados 15 ml de extrato pancreático, que num primeiro momento não teve efeito e resultou num abscesso no local da aplicação. Desta forma, o cientista JB Collip purificou este extrato pancreático e aplicou novamente no paciente, ocasionando uma resposta imediata de reversão da hiperglicemia e glicosúria.
Em suma, a insulina, secretada pelas células beta pancreáticas encontradas nas ilhotas de Langerhans, é uma das principais proteínas com hormônios anabólicos conhecidos. Dentre as principais funções do pâncreas, 98% dessas estão relacionadas com a secreção de enzimas digestivas para o intestino. As ilhotas pancreáticas representam a função endócrina do órgão, e secretam, além da insulina, outros hormônios importantes para a regulação do metabolismo, em especial o metabolismo da glicose.
Tipos De Insulina
Dentre os principais marcos da história da insulina, está a assinatura do primeiro contrato para fabricação e distribuição em massa do hormônio com a Eli Lilly and Company of Indiana. A primeira insulina comercializada era chamada de Insulina R 
(regular) e exigia de três a quatro aplicações por dia para manter o equilíbrio metabólico, pois tinha efeito de curta duração.
Após anos de estudos e desenvolvimentos de novos tipos de insulinas cada vez mais tecnológicas e funcionais, chegamos às insulinas comercializadas nos dias de hoje, grande parte conhecida como insulina humana, desenvolvidas em laboratórios a partir do DNA recombinante e se aproximando muito do hormônio produzido pelo pâncreas. Atualmente é possível encontrar no mercado insulinas com variados tipos de ação, de acordo com seu tempo de ação no organismo, por outro lado, ainda não é possível ingerir o hormônio por cápsulas, somente através de aplicação na pele, via seringas ou canetas próprias para aplicação, isto porque sucos digestivos do estômago podem afetar a eficácia da insulina.
Dois tipos de insulina são fabricadas pelo pâncreas: a basal e a bolus. A primeira está presente de forma contínua no organismo e a segunda é produzida quando há aumento de açúcar no sangue, geralmente após uma refeição.
Em vista disso, hoje no mercado são oferecidos diversos tipos de insulinas que devem ser aplicadas de acordo com o tipo de diabetes e prescritas respeitando o número de unidades necessárias para o equilíbrio do metabolismo. Dentre essas temos as insulinas regulares, as de ação ultrarrápida (lispro/aspart), intermediária (NPH/lenta), inalável, análogos à insulina basal (Glargina), dentre outros.
Tabela 1 - Início e duração de ação aproximados das insulinas humanas e análogos.
 Fonte: Insulinoterapia em DM1 - Pires & Chacra.
Para melhor compreensão, o início da ação é a velocidade com que a insulina começa a trabalhar após a injeção, o pico é a hora em que a insulina atinge o ponto 
máximo em termos de redução da glicemia e a duração é o tempo que a insulina age no organismo.
Os portadores do diabetes tipo 1 precisam de tratamentos que liberem os dois tipos de insulina, basal e bolus, enquanto o tratamento dos pacientes diabetes tipo 2 é variável de acordo com a necessidade.
Estrutura e síntese
Formada por duas cadeias polipeptídicas (“A” e “B”) , a molécula da insulina (C254H337N65O75S6), é composta por 21 e 30 aminoácidos, respectivamente, e são ligadas por pontes de dissulfeto e tem uma massa 5.808 g/mol.
Figura 1 - Cadeia da insulina humana
Fonte: JE Online, 2017.
A síntese da insulina se dá pela sua ligação de alta especificidade e afinidade ao receptor localizado na membrana plasmática, desencadeando uma resposta celular. Quando este receptor é ativado, a insulina passa a agir sobre a glicose, lipídeos, entre outros, garantindo efeito metabólico.
Casos de anormalidades nos receptores de insulina ou até mesmo falhas nos passos de sinalização pós-receptor ocorrem em estados de doenças ocasionando na resistência dos tecidos.
Existem dentro do pâncreas as chamadas ilhotas de Langerhansa na qual são classificadas como: Alfa, Beta, Delta e PP, são células endócrinas, cada qual cumprindo sua função, sendo as betas responsáveis pela produção de insulina, as alfas produção de glucagon, as deltas que liberam somatostatina, as PP que produzem peptídeos pancreáticos. Uma observação relevante: células endócrinas lançam seus produtos na corrente sanguínea, já as exócrinas lançam na superfície livre, ou seja, na superfície do corpo ou na luz de órgãos.
Figura 2 - Pâncreas 
Fonte: Só Biologia, 2008.
Importância no organismo
A grande importância da insulina no metabolismo está diretamente ligada ao controle de açúcares no sangue ingeridos por alimentos. A insulina é um hormônio secretado pelo pâncreas, que é um órgão muito importante apresentando algumas funções para o corpo como a produção de diversas substâncias como a amilase e a lipase que são enzimas que quebram os alimentos em pedaços menores. Tanta amilase como a lipase apresentam distinções nas suas funções como a digestão de carboidratos e atuação sobre a gordura, falta dessas substâncias ocasiona má absorção de nutrientes e emagrecimento precoce.
Os efeitos nas células alvo ocorrem por meio da sua ligação em receptores específicos que uma vez ativados desencadeiam uma cascata de processos bioquímicos. A liberação desse hormônio é regulada por um número de fatores estimulatórios e inibitórios, como a concentração de glicose no sangue, aminoácidos e ácidos graxos, bem como pelo sistema nervoso autônomo. Alémdisso, é o único hormônio capaz de diminuir diretamente os níveis de glicose plasmática. É considerada como um hormônio anabólico por promover o armazenamento de energias derivadas da alimentação. A insulina tem ação sobre a fisiologia das proteínas, incitando o transporte ativo celular de aminoácidos para os músculos e a síntese de proteínas musculares e coincidente diminui o catabolismo de proteínas. Além das proteínas, a insulina tem efeitos sobre o metabolismo de gorduras, promovendo a lipogênese e inibindo a lipólise.
Outro ponto muito importante a se levar em consideração é a regulação da glicemia no organismo que se refere à quantidade de glicose no corpo, que para a sua regulação depende principalmente de dois hormônios sendo eles a insulina que tem o papel de bloquear a produção excessiva de glicose no sangue, e o glucagon que é estimular a produção de glicose pelo fígado, sendo o oposto da insulina. Esta combinação faz com que haja o equilíbrio do organismo se mantendo sempre saudável.
A insulina age inicialmente na ligação com a subunidade alfa do receptor proteico de superfície celular (receptor enzimático tirosina-quinase (RTK) capaz de se autofosforilar e promover a atividade de tirosina-quinase, assim o resultado final da ativação do receptor será uma cascata de sinalização intracelular. Tal receptor está em 
mais de 200 mil na superfície das células dos tecidos adiposo, muscular e hepático. Os substratos IRS 1 e IRS 4 são os mais importantes do receptor de insulina, os quais irão integrar o metabolismo intermediário ao seu efeito celular final. Após a ativação desse receptor são desencadeadas as vias de sinalização celular da insulina. Sendo elas as que captam a glicose, fazem um aumento na síntese de glicogênio: IR/IRS/PI3K/Akt. Já as vias que promovem a proliferação e diferenciação celular são as IRS/MAPK.
Falta e excesso de insulina no organismo
A hiperglicemia ou excesso de glicose no sangue, ocorre devido aos ao aumento dos níveis de glicose no sangue. Isto se deve principalmente à diabetes que decorre em atributo a alterações ocorrida no pâncreas que começa a parar de produzir o hormônio insulina ou produz quantidade insuficiente para o organismo. Além disso, o excesso no organismo pode ser prejudicial à saúde. A glicose quando ultrapassa 160 a 180 mg/dl, o corpo arranja meios para excretar aquele açúcar e uma dessas maneiras é mandar todo açúcar para os rins, para eliminar na urina. Alguns sintomas nesta fase são a poliúria, que é o excesso de urina produzida no corpo, polidipsia que é a sede e a polifagia que seria a fome excessiva. Tudo isto acarretado pela hiperglicemia.
Já no outro lado temos a falta de insulina no corpo que é chamada hipoglicemia, ocorrida principalmente pela falta do hormônio na corrente sanguínea fazendo com que surjam sintomas como tontura, palidez e confusão mental. Contudo o maior problema dessa falta, está diretamente ligado a diabetes que acomete a maioria dos pacientes. 
Relação Insulina x Glicose
Afinal de contas qual a relação da glicose com a insulina? Basicamente a insulina coloca a glicose para dentro da célula, para que a glicose desempenhe sua função de combustível, e ao mesmo tempo bloqueia a quebra das proteínas e gorduras. A insulina é um controlador do glicogênio a partir de hidratos de carbono, já a glicose é o principal meio de energia para o organismo podendo ser usada sem a insulina somente no sistema nervoso central, nas células sanguíneas e nos rins, no restante dos tecidos do corpo ela só pode ser metabolizado com a presença da insulina.
Tipos de Diabetes
Atualmente todas as células do nosso corpo necessitam de glicose para funcionar adequadamente, isto se deve ao açúcar ser a fonte de energia para desencadear a maioria das funções metabólicas. A glicose entra no corpo por meio da inulina que será o hormônio responsável pelo controle e equilíbrio do açúcar no sangue, sendo assim se não houver níveis adequados de insulina ou até a deficiência deste hormônio, isto pode acarretar alguns tipos de diabetes.
Existem dois tipos de diabetes. No primeiro caso temos o diabetes do tipo 1 mais comum entre crianças e jovens, neste caso o pâncreas não produz ou produz quantidades mínimas de insulina, insuficientes para manter suas funções que seria fazer com que a glicose entre nas células. O que acontece especificamente neste caso é a destruição autoimune das células beta das ilhotas de Lagerhans, autoanticorpos contra as células beta contra a insulina, contra isso tecidos glutâmicos descarboxilases, contra tirosina fosfatase. O diabete do tipo 1 representa cerca de 10% a 20% dos casos de diabetes.
Já a diabetes do tipo 2 ocorre em pessoas adultas e neste caso o pâncreas produz insulina, mas apresenta defeitos não conseguindo exercer suas funções adequadamente, elevando a glicose no sangue e estimulando o pâncreas secretar mais insulina para o organismo. Suas células beta com acúmulo de insulina se deterioram. Assim, células betas destruídas não apresentam a produção de insulina, levando o indivíduo a ter a necessidade de tomar insulina e medicamentos para melhorar a sensibilidade à insulina. 
A diabetes tipo 2 é causada pela redução da sensibilidade dos tecidos-alvo ao efeito da insulina. Essa sensibilidade diminuída à insulina, é frequentemente descrita como resistência à insulina. Para conseguir prevalecer a resistência à insulina, para assim evitar o acúmulo de açúcares no sangue, deve haver um aumento na quantidade de insulina secretada. Ainda não se sabe a causa da diabetes tipo 2, o que se sabe é que fator hereditário tem importância, bem maior do que o diabetes do tipo 1 existindo uma conexão entre a obesidade e o diabetes do tipo 2.
Diabetes gestacional é outra forma de diabetes, mais parecida com o diabetes do tipo 2 pelas semelhanças clínicas que ambas apresentam. No período da gravidez, a 
placenta produz quantidades muito altas de hormônios, embora seja muito importante para construção do feto, os hormônios criam resistências à ação da insulina no organismo materno. A maioria das mulheres grávidas apresentam grãos de resistência à insulina, contudo mulheres com a diabetes gestacional apresentam uma exagerada resistência. A ocorrência dessa diabetes acontece por volta da vigésima quarta semana de gravidez, na fase na qual a maior produção de hormônios, sendo necessário o rastreamento da diabetes neste período. Resumindo, a diabetes gestacional é a alteração das concentrações de açúcares no sangue desaprendendo ou persistindo após o parto.
Métodos de tratamento
O controle do nível de açúcar no sangue por meio de dieta, medicamentos orais ou insulina é o principal tratamento para a diabetes. Também é necessário realizar exames regularmente para verificar a presença de complicações e diferenciar diabetes. Como temos 2 tipos de diabetes, apresentamos a cada um um tipo de tratamento.
Como o diabetes tipo 1 o tratamento para controlar a doença acontece por meio de injeções diárias de insulina ou uso de bombas de insulina que seria um dispositivo que fica junto ao corpo, injetando insulina através de tubos, dessa forma podemos controlar a insulina sob a pele. Este tipo de tratamento exige que seja medida o açúcar no sangue com algum tipo de frequência para verificar o equilíbrio no organismo, nem baixo e nem alto. Além disso, cada indivíduo precisa planejar toda a sua dieta e os níveis de atividades físicas recorrentes.
Os tratamentos para o diabetes tipo 2 são feitos por injeção de medicamentos que ajudam a controlar o açúcar no sangue. Alguns medicamentos como as sulfoniluréias (ex. glipizida, gliburida, tolbutamida e clorpromazida) conseguem reduzir adequadamente a concentração de glicose em indivíduos com diabetes do tipo 2, mas não são eficazes no diabetes tipo 1. Esses medicamentos também reduzem e estimulam o pâncreas a liberar insulina e aumentar sua eficácia no organismo. Um outro tipo de medicação oral, a metformina, não afeta a liberação de insulina, mas aumenta a resposta do organismo a sua própria insulina. O médiconão pode prescrever a metformina isoladamente ou combinada com a sulfonilureia. Uma outra medicação, a acarbose, retarda a absorção da glicose no intestino. Comumente, os hipoglicemiantes orais são prescritos para os 
indivíduos com diabetes tipo 2 quando a dieta e o exercício não conseguem reduzir adequadamente a concentração sérica de glicose.
Em alguns casos, os medicamentos podem ser tomados apenas uma vez por dia, pela manhã, embora alguns indivíduos necessitem de 2 ou 3 doses. Quando os hipoglicemiantes orais não conseguem controlar suficientemente a concentração sérica de açúcar, pode ser necessário o uso de injeções de insulina isoladamente ou combinado com hipoglicemiantes orais.
Insulina Inalável e o Dia internacional da Diabetes
Comemorado desde 1991 o Dia Mundial da Diabetes em 14 de novembro, data do nascimento do co-descobridor da insulina de Sir Frederick Banting, É um dia criado para conscientizar a respeito da diabetes. Falando de diabetes os portadores por sua vez precisam em determinados caso fazer uso de insulina, muitas vezes o processo pelo qual eles obtêm tal hormônio ocorre por meio de injeções, a fim de promover a qualidade de vida do portador foi desenvolvido um tipo de insulina inalável na qual chegou no Brasil em junho de 2019 pela aprovação da ANVISA. 
Comercializada em pó, em cartuchos com três tipos de dosagem. Ao ser aspirada a substância chega ao pulmão e é absorvida pela corrente sanguínea, na qual faz a sua função da insulina. Até agora, as insulinas disponíveis no mercado brasileiro eram apenas injetáveis. Seu preço está por volta de R$ 1.900 (versão com dosagem de 8 UI (unidades internacionais) e 90 refils. Por mais que ajude, essa nova descoberta infelizmente ainda não substitui todas as aplicações diárias de insulina(podendo substituir somente as aplicações de ação rápida ou ultrarrápida, utilizadas antes de cada refeição, depende de cada paciente e seu tipo de diabetes), contraindicada para menores de 18 e pessoas com problemas pulmonares.
Resistência à Insulina
A resistência insulínica, resistência à insulina ou apenas RI como também é conhecida, é o estado de saúde que precede a maioria dos casos de diabetes.
O organismo de uma pessoa que se encontra no estado de resistência insulínica, é incapaz de compor a quantidade necessária de insulina para a manutenção do metabolismo em condições normais.
A resistência à insulina é definida como a necessidade que um indivíduo tem em obter de 200 ou mais unidades de insulina ao dia para manter o controle glicêmico, evitando assim o uso descompensado de gorduras e proteínas a fim de obter energia quando a glicose não está disponível, processo esse conhecido como cetose.
Na maioria dos casos a resistência insulínica não traz grandes sintomas, mas se não for tratada a condição pode acarretar diversos problemas de saúde.
Foram comprovadas que diversas condições fisiológicas influenciam o nível de resistência insulínica, entre essas condições estão a obesidade, hipertensão, síndrome dos ovários policísticos, doenças autoimunes, infecções, estresse fisiológico, puberdade, gestação, envelhecimento, uso de medicamentos corticoides e inibidores de protease (enzima cuja função é quebrar ligações peptídicas entre aminoácidos das proteínas), predisposição genética, atividade física e estilo de vida também influenciam a frequência de aparecimento da RI.
Atualmente, não existe no mercado um teste específico para detecção da resistência insulínica, seu diagnóstico é feito a partir de uma avaliação médica e exames de sangue complementares.
Alguns exames laboratoriais podem ser solicitados ao paciente a fim de investigar a existência do distúrbio. Dentre os exames utilizados estão o de nível de glicemia, hemoglobina glicada (HbA1c), perfil lipídico e nível de insulina em jejum. Importante destacar que o perfil do paciente e suas comorbidades são levados em consideração para o diagnóstico da condição.
Para fins de tratamento, os alimentos de alto índice glicêmico, álcool e tabaco devem ser evitados. Uma rotina de exercícios pode ser indicada pelo médico. 
As complicações da condição de resistência insulínica apresentam importante papel no desenvolvimento da síndrome metabólica, como aumento da produção de insulina, diabetes tipo 2 ou intolerância à glicose e até mesmo obesidade e hipertensão.
 Índice de HOMA
O índice de HOMA é um cálculo fundamentado a partir das dosagens da insulina e da glicemia, descrito em 1985 por David Matheus. Podem ser realizados dois cálculos o HOMA-IR que qualifica a resistência insulínica e o HOMA-BETA que qua qualifica a capacidade de secreção insulínica e determina a capacidade funcional das células beta pancreáticas 
O método é feito a partir de técnicas de quimioluminescência, colorimetria e enfim cálculo para determinação do índice e para realização do exame se faz necessário realizar jejum de 4 horas.
O exame é realizado a partir da coleta de uma amostra de no aproximadamente 1mL de sangue em tubo adequado que contém gel separador, é necessário a homogeneização imediata após a coleta e acondicionamento do tubo em repouso verticalmente para a completa retração do coágulo em temperatura ambiente, evitando assim a hemólise (rompimento de membrana das hemácias). Em seguida, o tubo com a amostra é centrifugado para obtenção do soro (sobrenadante). O acondicionamento da amostra é feito entre as temperaturas de 2ºC a 8ºC.
Fórmula 1: Determinação do índice de HOMA-IR
HOMA-IR = (Glicose em jejum (mg/dL) X 0,0555 X Insulina em jejum (uU/mL))/22,5
Fonte: HAOMA, 2022.
Tabela 1: Métodos e valores de referência
	Método
	Parâmetro
	Valor de referência
	QUIMIOLUMINESCÊNCIA/COLORIMETRIA/CÁLCULO
	Glicose
	70 a 99 mg/dL
	
	ÍNDICE DE HOMA-IR
	Inferior ou igual a 3,40
	
	Insulina
	1,9 a 23,0 µUI/mL
Fonte: HAOMA, 2022.
Fórmula 2: Determinação do índice de HOMA-BETA
HOMA-BETA = Insulina em jejum (uU/mL) X 20 / (Glicose em jejum (mg/dL) X 0,0555)-3,5
Fonte: HAOMA, 2022.
Tabela 2: Métodos e valores de referência
	Método
	Parâmetro
	Valor de referência
	QUIMIOLUMINESCÊNCIA/COLORIMETRIA/CÁLCULO
	Glicose
	70 a 99 mg/dL
	
	Índice HOMA-BETA
	167,0 a 175,0
	
	Insulina
	1,9 a 23,0 µUI/mL
Fonte: HAOMA, 2022.
 Índice de Quicki
O índice quantitativo de verificação de sensibilidade à insulina (QUICKI) é uma nova transformação matemática dos níveis de glicose e insulina no sangue em jejum. Em indivíduos obesos e diabéticos, o QUICKI tem uma correlação linear significativamente melhor com as determinações da secreção e da resistência à insulina.
Para realização do exame é necessário realizar o jejum de 8 horas.
Já a coleta é realizada utilizando material e meio de coleta adequados. Após a retração completa do coágulo, a amostra é centrifugada e acondicionada corretamente. 
Fórmula 3: Determinação do índice de QUICKI
QUICKI = 1 ÷ [Log insulinemia jejum (µU/mL) + Log glicemia jejum (mg/dL)]
Fonte: HAOMA, 2022.
Tabela 3: Métodos e valores de referência do Índice de QUICKI
	Método
	Parâmetro
	Valor de referência
	QUIMIOLUMINESCÊNCIA/COLORIMETRIA/CÁLCULO
	GLICOSE
	70 a 99 mg/dL
	
	INSULINA
	1,9 a 23,0 µUI/mL
Fonte: HAOMA, 2022.
Colorimetria
A palavra colorimetria vem do latim onde COLOR significa cor e METRIA significa medida. Logo, colorimetria é o método de análise científica que tem como fundamento a comparação de cores em uma faixa de comprimento de luz de uma cor com base em outra que é utilizada como padrão.
Na experiência, o processo compara a cor produzida a partir de uma reação química com uma cor padrão. De acordo com a intensidade da cor adquirida, obtém-se a concentração da substância analisada.
Em alguns casos, o resultado pode ser analisado e feito a olho nu porém não é o mais adequado. O método mais seguro de se interpretar a coloração de uma reação é realizado através de leitura no espectrofotômetro, equipamento cuja função é comparar a intensidade da cor obtida medindo a quantidade de fótons (a intensidade da luz) absorvida depois de passar pela amostra. Essa comparação é feita com uma padrão chamadode branco, cujo espectrofotômetro detecta um valor igual a zero.
Com base nas leituras realizadas, o resultado da análise é apresentado em um gráfico, chamado de espectro, fornecendo as informações de intensidade de cor a partir do comprimento de onda da fonte de luz.
Atualmente o método de exame feito com a técnica de colorimetria é um dos mais utilizados em análises laboratoriais de bioquímica clínica. A colorimetria também pode ser utilizada em outras áreas, desde que envolva substâncias químicas, em conjunto com o espectrofotômetro.
TESTE ELISA
O teste a ser explorado neste trabalho é o “ELISA” (do inglês “Enzyme Linked Immunosorbent Assay'') que se baseia nas reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. É um método colorimétrico, que visa quantificar o hormônio de insulina presente em uma amostra de sangue. 
A partir de um padrão de insulina fornecido com as devidas calibrações feitas de acordo com o Padrão Internacional da OMS de 1975 (66/304), é gerada uma curva padrão para o ensaio e então posteriormente todas as amostras de sangue deverão ser lidas na sob a curva padrão.
Para a preparação de padrões ou amostras diluídas, faz-se necessário a pipetagem para uma placa de microtitulação transparente revestida com um anticorpo monoclonal para capturar a insulina presente na amostra.
Após uma incubação de 60 minutos, a placa é lavada. Um anticorpo de insulina conjugado com peroxidase é adicionado e a placa é novamente incubada por mais 30 minutos, e então lavada. 
Finalmente, o substrato é agregado à placa, que reage com o anticorpo conjugado à insulina. Em uma terceira incubação, a reação é interrompida e a intensidade da cor gerada é lida no espectrofotômetro na faixa de 450 nm. O teste leva em torno de 2 horas para ser finalizado.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diante da pesquisa feita podemos concluir que a insulina é de suma importância para a sobrevivência do organismos, foi entendido os índices e suas relevâncias que quantificam a sensibilidade à insulina, medem também a capacidade das células beta de produzir a mesma. 
Compreendemos sua história e origem, sua estrutura molecular, a falta e o excesso dela no corpo, a doença mais conhecida devido a aspectos da insulina é a diabete, na qual tem sua história intimamente ligada à insulina, por fim o Teste ELISA, chegando assim a abordar grande parte do tema que tange à insulina.
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