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Reitor Sérgio Carlos de Carvalho Vice-Reitor Décio Sabbatini Barbosa Diretor Luiz Carlos Migliozzi Ferreira de Mello Conselho Editorial Abdallah Achour Junior Daniela Braga Paiano Edison Archela Efraim Rodrigues Ester Massae Okamoto Dalla Costa José Marcelo Domingues Torezan Luiz Carlos Migliozzi Ferreira de Mello (Presidente) Maria Luiza Fava Grassiotto Otávio Goes de Andrade Rosane Fonseca de Freitas Martins A Eduel é afiliada à PRÁTICAS DE GENÉTICA, BIOLOGIA MOLECULAR, BIOTECNOLOGIA E EVOLUÇÃO Catalogação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) Bibliotecária: Aparecida de Lourdes Mariani – CRB 9/1230 P912 Práticas em genética, biologia molecular, biotecnologia e evolução [livro eletrônico] / Rogério Fernandes de Souza, Mariana A. Bologna Soares de Andrade, Carlos Roberto Maximiano da Silva [organizadores]. – Londrina : Eduel, 2018. 1 Livro digital : il. Vários autores. Inclui bibliografia. Disponível em: http://www.eduel.com.br ISBN 978-85-7216-953-0 1. Genética – Prática. 2. Biologia molecular – Prática. 3. Biotecnologia – Prática. 4. Evolução (Biologia) – Prática. I. Souza, Rogério Fernandes de. II. Andrade, Mariana A. Bologna Soares de. III. Silva, Carlos Roberto Maximiano da. CDU 575 Direitos reservados à Editora da Universidade Estadual de Londrina Campus Universitário Caixa Postal 10.011 86057-970 Londrina – PR Fone/Fax: 43 3371 4673 e-mail: eduel@uel.br www.eduel.com.br SUMÁRIO Apresentação Unidade 1 - Ciclo Celular MITOSE EM RAIZ DE CEBOLA OU DE MILHO OBTENÇÃO DE CÉLULAS METAFÁSICAS EM ANIMAIS OBTENÇÃO DE CÉLULAS MEIÓTICAS DE PLANTAS A PARTIR DE ANTERAS DE MILHO MEIOSE EM TESTÍCULOS DE GAFANHOTO Unidade 2 - Estudos Cariotípicos ANÁLISE CARIOTÍPICA E MONTAGEM DE CARIÓTIPOS CITOGENÉTICA HUMANA Unidade 3 - Biologia Molecular CONSTRUINDO UM MOLDE DA MOLÉCULA DE DNA Unidade 4 - Genética Qualitativa e Quantitativa NOÇÕES DE PROBABILIDADE APLICADA À GENÉTICA A PRIMEIRA LEI DE MENDEL – UMA SIMULAÇÃO A SEGUNDA LEI DE MENDEL – UMA SIMULAÇÃO HERANÇA GENÉTICA DO MILHO SUPERDOCE: PRIMEIRA LEI DE MENDEL MOSCAS DROSÓFILAS COMO MODELO PARA ESTUDOS DE GENÉTICA MENDELIANA GENÉTICA QUANTITATIVA: COMPONENTES DE VARIÂNCIA, HERDABILIDADE E GANHO DE SELEÇÃO Unidade 5 - Genética aplicada à Biotecnologia PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA QUEM É O PAI DO BEZERRO? SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES RESTRIÇÃO DE DNA DE BACTERIÓFAGO LAMBDA (λ) E MAPAS DE RESTRIÇÃO Unidade 6 - Genética de populações e evolução biológica SIMULAÇÃO DO EQUILÍBRIO DE HARDY- WEINBERG SIMULANDO A AÇÃO DA SELEÇÃO NATURAL NA ESPÉCIE HUMANA O JOGO DA DERIVA DETERMINAÇÃO DO LIMIAR GUSTATIVO À FENILTIOCARBAMIDA O COEFICIENTE DE ENDOCRUZAMENTO E O EQUILÍBRIO DE WRIGHT ESTUDO DE SIMILARIDADE GENÉTICA COM MARCADORES MOLECULARES AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA E CONSERVAÇÃo DE ESPÉCIES UTILIZANDO MARCADORES AFLP SIMULAÇÃO DA TEORIA DOS JOGOS EVOLUTIVOS Respostas às Questões APRESENTAÇÃO Os conhecimentos nas áreas da Genética, Evolução e Biotecnologia estão em constante crescimento e isso causa impacto no ensino desses conteúdos. Nota-se cada vez mais a necessidade de que eles sejam contextualizados para que os estudantes compreendam os diferentes aspectos dessas áreas da ciência. Por outro lado, muitos obstáculos se apresentam quando se pensa em desenvolver atividades práticas: falta de laboratório, de recursos e de tempo, aliada a materiais caros e à carência de práticas com caráter investigativo nos livros. Inclusive no ensino superior. Elaborar atividades com caráter investigativo compreende o desenvolvimento de trabalhos práticos. Pode-se compreender trabalho prático como qualquer atividade que comporte a manipulação de materiais, objetos ou organismos com a finalidade de se observar fenômenos. Portanto, isso pode ocorrer em laboratório, no campo e na própria sala de aula. Nesta perspectiva, este livro foi desenvolvido com o objetivo de oferecer propostas de atividades práticas para aulas de Genética, Evolução e Biotecnologia dos cursos de graduação. Nessa elaboração, participam professores e pesquisadores das áreas relacionadas à temática do livro. O resultado foi um material que apresenta uma compilação de atividades, desde as mais utilizadas por professores até propostas inovadoras. O livro está divido em seis unidades: Ciclo Celular, Estudos Cariotípicos, Biologia Molecular, Genética Qualitativa e Quantitativa, Genética Aplicada à Biotecnologia e Genética de Populações e Evolução Biológica. Em cada uma das unidades são apresentadas propostas para serem desenvolvidas com estudantes que possuam Genética, Evolução ou Biotecnologia nos seus currículos. Quanto à estrutura dos capítulos, são propostas de aulas que envolvem simulações, práticas em laboratórios, atividades de campo e análise de materiais. Em todos eles há uma breve contextualização do conteúdo a ser desenvolvido, o detalhamento da atividade e dos procedimentos necessários e, ao final, questões problematizadoras. Esperamos, com este material, auxiliar a prática de professores dessas áreas com as propostas de aulas contextualizadas e possíveis de serem desenvolvidas em diferentes situações. Os organizadores UNIDADE 1 - CICLO CELULAR MITOSE EM RAIZ DE CEBOLA OU DE MILHO Carlos Roberto Maximiano da Silva Ana Lúcia Dias I��������� Quando uma célula eucariótica se multiplica, ela passa por uma série de transformações, muitas das quais podem ser facilmente observadas à luz de um microscópio óptico, principalmente as modificações sofridas pelas cromatinas. O processo de divisão celular é chamado de mitose (do grego mitos = fio + ose = estado de). Esta envolve a separação das cromátides irmãs, que resultam da duplicação do DNA durante a fase S da interfase. No decorrer dela, a estrutura da cromatina se condensa e ocorre a separação e a migração das cromátides para os polos da célula, bem como a divisão do citoplasma. Com isso, uma célula, chamada de célula- mãe, origina duas células filhas que compartilham a mesma informação genética. Não é fácil analisar a mitose nas células vivas, pois a divisão celular é um processo dinâmico e ininterrupto. Além disso, o núcleo, organelas e componentes citoplasmáticos apresentam-se normalmente incolores. Por esse motivo é necessário utilizar fixadores, que matam as células e fazem com que elas estacionem em determinados estágios da divisão, e corantes, que permitirão a visualização dessas estruturas. De acordo com as características celulares e o nível de condensação da cromatina, convencionou-se dividir a mitose em 4 fases, denominadas prófase, metáfase, anáfase e telófase. Em vegetais, os melhores materiais para a observação dessas fases constituem os tecidos em crescimento, como brotos de caules e de folhas e as pontas das raízes, também chamados de meristemas apicais e radiculares, respectivamente. Do ponto de vista didático, podemos utilizar os meristemas radiculares de cebola (Allium cepa; 2n = 16 cromossomos) e de milho (Zea mays; 2n = 20 cromossomos) para esse tipo de estudo, tendo em vista que estas são de fácil germinação, além de apresentarem cromossomos grandes e prontamente identificáveis. O������� Identificar as diferentes fases da mitose, relacionando-as com as alterações sofridas pela cromatina ao longo da divisão celular, por meio do preparo de lâminas a fresco que podem ser observadas em microscópio óptico. M������� Raízes de cebola e/ou milho; Corante orceína acetoclorídrica; Meio de montagem (verniz, bálsamo do Canadá, Entellan® ou Permount®) – opcional; Ácido acético a 50%; Microscópio óptico; Copos, lâminas, lamínulas, placas de Petri, vidro relógio (opcional), pinças, estiletes, tesouras, esmalte incolor, lamparina de álcool, papel sulfite e lápis. P��������� � ��������� Colocar uma cebola emborcada em um copo com água, deixando a região onde se formam as suas raízes (o disco ou caule) em contato com a água (Figura 1A); Se for utilizar milho,colocar os grãos em um recipiente com algodão úmido para que ocorra a germinação; Deixar as raízes crescerem até que atinjam aproximadamente 12 cm, o que demora cerca de 1 semana; Cada cebola permite montar entre 10 a 20 lâminas. A�������� I – O������ ������� ���� ���������� �� ����������� ������ O professor pode optar por preparar as lâminas junto com os estudantes, que serão descartadas após as atividades, ou então montar lâminas permanentes, que poderão ser utilizadas nas aulas práticas subsequentes. O preparo desses dois tipos de lâminas é explicitado a seguir. Figura 1: (A) Cebola após aproximadamente 1 semana de cultivo; (B) Retirada dos meristemas apicais das raízes; (C) Material necessário para a coloração dos componentes celulares: lamparina de álcool, pinça, placa de Petri e corante orceína acetoclorídrica Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva. Procedimento 1. Cortar de 3 a 4 raízes em tamanhos de 1 a 2 cm na parte apical e transferi-las para uma placa de Petri contendo orceína acetoclorídrica (Figuras 1B e C); 2. Aquecê-las sobre uma lamparina de álcool até a emissão de vapores sem, contudo, deixar que a solução ferva (Figura 2A); 3. Esfriar por 5 minutos; 4. Repetir esta operação 2 vezes mais e, após o 3º aquecimento, repousar por 15 minutos; 5. Colocar uma raiz sobre uma lâmina limpa, separar os 2-3 mm apicais, desprezando o resto da estrutura (Figura 2B); 6. Cobrir com cuidado com uma lamínula, procurando evitar a formação de bolhas (Figura 2C); 7. Com um lápis ou com a base de uma pinça, bater suavemente a preparação para se obter uma extensão unicelular (Figura 2D); 8. Envolver a lâmina com a lamínula em um papel de filtro e apertar a região da lamínula (Figura 2E) para esmagar as células; 9. Com um pedaço de papel de filtro, eliminar o excesso de corante; 10. Vedar a lamínula com esmalte incolor (Figura 2F); 11. Observar ao microscópio óptico à procura de células coradas (Figura 3). Figura 2: Procedimentos para a manufatura da lâmina: (A) Aquecimento das raízes até a emissão de vapores; (B) Isolamento dos meristemas apicais; (C) Cobertura com a lamínula; (D) Esmagamento com a pinça; (F) Esmagamento com papel filtro e retirada do excesso de corante e (F) Vedação Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva. Produzindo lâminas permanentes Caso seja de interesse obter lâminas permanentes, em vez de vedar o material com o esmalte, pode-se utilizar um meio de montagem (verniz, bálsamo do Canadá, Entellan® ou Permount®), seguindo o procedimento abaixo: 1. Colocar a lâmina com a lamínula virada para baixo em um vidro relógio com ácido acético 50% até esta se soltar; 2. Deixar a lâmina secando em um suporte e colocar a lamínula em um frasco contendo xilol; 3. Passar uma lamínula nova em xilol e colá-la com uma gota de meio de montagem sobre a lâmina que estava secando; 4. Em uma lâmina nova, colocar uma gota de meio de montagem e colar sobre ela a lamínula mantida no xilol. Figura 3: Lâmina de células de raiz de cebola observada ao microscópio óptico em aumento de 40 vezes Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva. A�������� II – O��������� ������� ��������� �� ����������� ������ A mitose é convencionalmente dividida em quatro fases: prófase, metáfase, anáfase e telófase, de acordo com as características da cromatina (Figura 4). As características de cada uma delas são descritas a seguir: Prófase: a membrana do núcleo está se desmontando e, ao mesmo tempo, se inicia a condensação gradual das cromátides. No início, vemos inúmeros “fios” emaranhados (as cromátides) que, ao longo desta fase, vão ficando grossos e se posicionando no centro da célula; Prometáfase: Ao final da Prófase e início da Metáfase, uma fase intermediária chamada prometáfase pode ser identificada. Esta é muitas vezes confundida com a Metáfase, porém, nela, os cromossomos não estão totalmente condensados; Metáfase: As cromátides irmãs alcançam o grau máximo de condensação, sendo denominados de cromossomos, e os seus centrômeros são posicionados no centro da célula, a chamada placa equatorial. Lembrando que, de acordo com o preparo da lâmina, os cromossomos metafásicos poderão estar menos ou mais espalhados no campo de visão; Anáfase: As cromátides irmãs dos cromossomos começam a se separar e a se descondensar. Portanto, nela podemos ver dois grupos de cromátides migrando em direção aos polos opostos da célula; Telófase: Pode ser confundida com a Anáfase, uma vez que também temos as cromátides separadas nos dois polos da célula. Contudo, nela, as cromátides estão visivelmente descondensadas formando o que parecem ser dois núcleos em uma mesma célula. A célula, por sua vez, começa a sofrer citocinese e ter a membrana que envolve o núcleo restaurada. Lembrando que neste tipo de procedimento não é possível observar a citocinese. Procedimento 1. Para a execução dessa atividade é preciso ter em mãos lâminas recém-preparadas ou permanentes, contendo raiz de cebola ou de milho fixadas e coradas; 2. Estas lâminas devem ser observadas ao microscópio óptico, procurando-se identificar as células que apresentem as diversas fases da mitose; 3. Desenhar as diferentes fases da mitose, tentando ressaltar os aspectos mais importantes de cada uma delas. Q������� � ����� ����������� 1. Quando, durante o ciclo celular, tem lugar a duplicação do material genético e quando os cromossomos atingem o seu grau máximo de condensação? 2. Qual seria a diferença entre cromátides irmãs e não irmãs? E entre cromossomos homólogos e não homólogos? 3. Em quais situações os organismos pluricelulares apresentarão células se dividindo por mitose? Figura 4: Imagem de células de raiz de cebola obtidas por microscopia ótica em aumento de 1000 vezes: (A) Célula em Intérfase; (B a E) Prófase; (F) Prometáfase; (G e H) Metáfase; (I a K) Anáfase e (L e M) Telófase Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva. B����������� �������� JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A. Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. OBTENÇÃO DE CÉLULAS METAFÁSICAS EM ANIMAIS Carlos Roberto Maximiano da Silva Maria José Sparça Salles Wagner José Martins Paiva I��������� A melhor fase do ciclo celular para se observar os cromossomos é a metáfase, pelo fato deles atingirem o máximo de condensação, tornando evidente tanto as cromátides como a posição dos centrômeros. Isso permite detectar possíveis alterações cromossômicas estruturais e numéricas nos organismos, bem como comparar as estruturas cromossômicas entre diferentes espécies. Para facilitar a obtenção de células metafásicas, utiliza-se células ou tecidos com alto índice de proliferação celular, tais como os linfócitos e a medula óssea. Os linfócitos do sangue periférico, apesar de fornecerem culturas de curta duração, são de fácil obtenção, podendo ser empregados em exames rotineiros de laboratório. Além disso, o seu uso evita o sacrifício dos animais, o que não acontece quando se opta pelo tecido de medula óssea. Isso porque, em espécies de pequeno porte, como ratos e camundongos, isso é feito a partir da retirada do fêmur. Em organismos maiores, como os humanos, pode-se fazer uma punção da medula do osso esterno ou da crista ilíaca. Uma vantagem em se analisar metáfases de medula óssea é a possibilidade de verificação do efeito de mutagenicidade in vivo. O teste citogenético de mutagenicidade in vivo, considerado de curta duração, detecta o potencial que um composto químico tem de induzir alterações estruturais e numéricas nos cromossomos da espécie. Nesse tipo de estudo, normalmente são utilizados animais jovens, tecidos com alto índice de proliferação celular e com um tempo de ciclo mitótico relativamente curto. O������� Apresentar as técnicas de obtenção de metáfases a partir de linfócitos do sangue periférico e da medula óssea, que podem ser utilizadas tanto em atividades de aulas práticas como na rotina de laboratóriosde estudos citogenéticos. O���������� ����������� Os procedimentos aqui trabalhados utilizam reagentes tóxicos. Portanto, é necessário extremo cuidado ao manipulá-los. Deve-se utilizar luvas e jaleco durante todo o procedimento, manter os reagentes em ambiente adequado e verificar com antecedência se há todo o material disponível para os procedimentos. Ademais, todas as normas de bioéticas devem ser seguidas quando for necessário sacrificar animais. Atividade I – Obtenção de células metafásicas a partir de linfócitos do sangue periférico Caso se deseje trabalhar essa atividade com os estudantes, é importante lembrar que são necessárias 72 horas para a incubação dos linfócitos em meio de cultura contendo fito-hemaglutinina, mais 2 horas de tratamento com colchicina, antes de se iniciar o processo de preparo, coloração e montagem das lâminas. Como alternativa, o professor pode programar e executar em sala de aula somente as etapas posteriores ao tratamento com a colchicina. Material 1 a 5 mL de sangue periférico; Ácido acético (PA); Colchicina 4 x 105 M; Corante Giemsa; Fito-hemaglutinina (PHA); Heparina sódica (5000 UI); Meio de cultura para linfócitos (RPMI-1640-Gibco); Metanol (PA); Solução hipotônica de KCl (0,075 M); Soro bovino fetal estéril; Tampão Sörensen [(NaH2 PO4) 0,2 M + (Na2HPO4.H2O) 0,2 M]; Centrífuga de 800 a 1000 rpm; Estufa à temperatura de 37°C; Seringa e agulha descartáveis; Frascos de cultura (estéreis), tubos de ensaio, pipetas Pasteur, lâminas, lamínulas e lamparina de álcool. Procedimento As metáfases para as análises dos cromossomos serão obtidas segundo a técnica modificada de Moorhead et al. (1960), que consiste dos seguintes passos: 1. Dependendo do tamanho do animal, coletar de 1 a 5 mL de sangue periférico – do plexo oftálmico, do tecido circulatório dos membros etc – com uma seringa descartável contendo 0,1 mL de heparina; 2. Manter a seringa em posição vertical, com a agulha voltada para cima, até a sedimentação das hemácias; 3. Em uma capela estéril, transferir 0,5 mL do plasma para um frasco contendo 7,5 mL de meio de cultura RPMI 1640 à temperatura ambiente, 2 ml de soro bovino fetal e 0,2 mL de fito-hemaglutinina; 4. Manter o frasco encubando em estufa em temperatura constante de 37°C por 72 horas; 5. Adicionar 0,1 mL de solução de colchicina 4 x 105 M ou 0,00l6% ao frasco de cultura para cada 5 mL de meio; 6. Manter incubado por 2 horas; 7. Transferir o conteúdo do frasco para um tubo de ensaio e centrifugar a 800/1.000 rpm por 5 minutos, desprezando o sobrenadante; 8. Com auxílio de uma pipeta Pasteur, ressuspender as células sedimentadas suavemente em 10 mL de solução hipotônica de KCl 0,075 M aquecida a 37°C; 9. Manter o material em estufa a 37°C por 10 minutos; 10. Centrifugar a 1.000 rpm por 5 minutos, desprezando o sobrenadante; 11. Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, ressuspender o sedimento em 5 mL de fixador Carnoy modificado (3 partes de metanol para 1 parte de ácido acético) recém-preparado (este deve ser preparado no início do processo e não pode ser armazenado, pois degrada rapidamente, formando aldeído acético); 12. Centrifugar a 1.000 rpm por 5 minutos, desprezando o sobrenadante; 13. Repetir os passos 11 e 12; 14. Fazer a diluição necessária, com algumas gotas de fixador, de acordo com a quantidade de material obtido; 15. Distribuir 3 gotas deste material em lâminas limpas e conservadas em água gelada, inclinando-as levemente; 16. Após secagem, corar com uma solução de Giemsa diluído em tampão Sörensen (1:30), preparado momentos antes do uso, durante 5 minutos; 17. Lavar em água corrente e deixar secar; 18. Observar as lâminas ao microscópio óptico, inicialmente com objetiva de 10X e, quando localizar uma metáfase, centralizar no campo e passar para a objetiva de 40X; 19. Em seguida, observar com a objetiva de 100X (não esquecer de utilizar o óleo de imersão); 20. Escolher uma metáfase, observá-la com a objetiva de 100X, desenhar os cromossomos e classificá-los em seus respectivos grupos, de acordo com o tamanho e posição do centrômero, conforme especificado na Figura 1. Figura 1: Classificação dos cromossomos de acordo com a posição do centrômero Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza. A�������� II – O������� �� ������� ����������� � ������ �� ������ ����� Essa técnica pode ser empregada em roedores, aves e outros animais de pequeno porte. Para a apresentação em aula, sugerimos que se utilize ratos de laboratório e que o animal seja abatido seguindo as normas éticas. Para animais de médio e grande portes, considerar a possibilidade de obtenção de medula óssea a partir da punção do osso esterno. Essa técnica também permite analisar os efeitos de um mutagênico nos cromossomos, de animais que receberam recentemente alguma substância mutagênica. Material Um camundongo ou um rato; Ácido Acético (PA); Água destilada; Colchicina 0,1 M; Corante Giemsa; Éter; Metanol (PA); Solução hipotônica de KCl (0,075 M); Tampão Sörensen [(NaH2 PO4) 0,2 M + (Na2HPO4.H2O) 0,2 M]; Estufa à temperatura de 37°C; Centrífuga de 800 a 1000 rpm; Bisturi, alfinetes, tesoura, gazes, algodão, lâminas, lamínulas, pipeta Pasteur, Beckers, tubos de ensaio, seringa com agulha e lamparina. Procedimento 1. Injetar na cavidade peritoneal do animal 1 mL de colchicina 0,1 M para cada 100 g de peso e aguardar 2 horas (Figura 2B); 2. Anestesiar o animal com éter, dissecá-lo na região dos fêmures (procedendo a partir da face externa e região posterior da coxa evitará o corte da artéria femoral e o sangramento, o que atrapalha o processo de extração), descarnando e limpando completamente (Figura 2C e D); 3. Extrair os fêmures e cortá-los na região das epífises (Figura 2E); 4. Com auxílio de uma seringa, injetar 10 mL de solução hipotônica no canal ósseo para a retirada da medula, vertendo o conteúdo de cada fêmur em um tubo de ensaio diferente (Figura 2F); 5. Homogeneizar com a pipeta Pasteur ou com a própria seringa com agulha 6. Manter o tubo de ensaio em estufa a 37°C de 10 a 15 minutos; 7. Centrifugar por 10 minutos a 1.200 rpm; 8. Desprezar o sobrenadante e agitar para ressuspender as células; 9. Colocar 3 mL de fixador Carnoy modificado (3 partes de metanol para 1 parte de ácido acético) recém-preparado (este deve ser preparado no início do processo e não pode ser armazenado, pois degrada rapidamente, formando aldeído acético); 10. Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, ressuspender as células; 11. Centrifugar por 5 minutos a 1.200 rpm, descartando o sobrenadante; 12. Repetir os passos 9 a 11; 13. Ao sedimento, acrescentar 0,2 mL de fixador Carnoy modificado e ressuspender o material com uma pipeta Pasteur; 14. Preparar as lâminas pelo método de espalhamento, pingando um ou duas gotas da suspensão de células em lâminas limpas contendo um filme de água destilada gelada, mantendo-as inclinadas a aproximadamente 45° durante o processo; 15. Após a secagem das lâminas, corar com uma solução de Giemsa diluído em tampão Sörensen (1:30), preparado momentos antes do uso, durante 5 minutos; 16. Após 5 minutos, lavar as lâminas em água corrente e colocar para secar ao ar livre; 17. Observar ao microscópio óptico, inicialmente com objetiva de 10X e, quando localizar uma metáfase, centralizar no campo e passar para a objetiva de 40X; 18. Em seguida, observar com a objetiva de imersão; 19. Escolher uma metáfase, desenhar os cromossomos e classificá-los em seus respectivos grupos, de acordo com o tamanho e posição do centrômero (Figura 1). Figura 2: Extração do fêmur de um roedor: (A) Material necessário; (B) Injeção de colchicina na cavidade peritoneal; (C) Dissecação a partir da face externa da coxa; (D) Exposição do fêmur; (E) Corte na região da epífise e (F) Injeção solução hipotônica no canal ósseo Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva e Cynthia Marcon Cunha. Q������� � ����� ����������� 1. Qual a finalidade de se adicionar fito-hemaglutinina ao meio de cultura durante a incubação e por que os linfócitos devem ser incubadospor até 72 horas em meio de cultura? 2. Qual seria a finalidade do uso de colchicina durante o processo de obtenção de células metafásicas? 3. Por que as células metafásicas precisam passar por uma solução hipotônica antes de serem fixadas? 4. O que pode ser observado ao microscópio óptico quando se utiliza a objetiva de 10X? Qual é o aspecto das metáfases com esse grau de amplificação? 5. Quando usamos a objetiva de 40X é possível determinar o número e a forma dos cromossomos? E na objetiva de imersão (100X), qual será o aspecto dos cromossomos? 6. Qual seria a utilidade prática de se obter células metafásicas? Em que situações isso é normalmente realizado? B����������� �������� GUERRA, M. Introdução à Citogenética Geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1988. KASAHARA, S. Práticas de Citogenética. Ribeirão Preto: SBG, 2001. MOORHEAD, O. P.; NOWELL, P. C.; MELLMAN, W. J.; BATTIPS, D. M. HUNGERFORD, D. A. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Experimental Cell Research, v. 20, n.3, p. 613-16.1960. SIVIERO, F. Biologia Celular: bases moleculares e metodologia de pesquisa. São Paulo: Roca, 2013. OBTENÇÃO DE CÉLULAS MEIÓTICAS DE PLANTAS A PARTIR DE ANTERAS DE MILHO Carlos Roberto Maximiano da Silva Ana Lúcia Dias Lucia Giuliano Caetano I��������� A meiose (do grego meiosis = divisão ao meio) é o processo de divisão celular pelo qual as espécies de reprodução sexuada costumam formar os seus gametas. Os organismos que realizam este tipo de reprodução possuem dois conjuntos de cromossomos, cada um herdado de um de seus parentais. Por esse motivo, eles são chamados de diploides (ou 2n). Por outro lado, os gametas produzidos por esses indivíduos possuem apenas um conjunto cromossômico, sendo por isso chamados de haploides (n). Pelo fato de os descendentes serem formados pela união de gametas haploides de seus parentais, a meiose garante que o número cromossômico da espécie se mantenha o mesmo ao longo das gerações. Este mecanismo de divisão celular ocorre em duas etapas sucessivas, de tal forma que, a partir de uma célula diploide, são originadas quatro células haploides. Além disso, outros fenômenos de grande importância genética também ocorrem durante a meiose, tais como a sinapse, com o pareamento de cromossomos homólogos; a permuta, que envolve a troca de partes entre os cromossomos homólogos; e a segregação do material paterno e materno, com a distribuição ao acaso dos cromossomos pareados para os dois polos da célula. Isso resulta em células haploides com conjuntos cromossômicos únicos em termos de combinações genéticas. Devido a todos esses processos, a divisão meiótica é complexa. Mas, para efeito didático, ela é dividida em meiose I (divisão reducional) e meiose II (divisão equacional). A meiose I consta da prófase I (subdividida em leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e diacinese), metáfase I, anáfase I, telófase I e intercinese (com a formação das díades). A meiose II consta da prófase II, metáfase II, anáfase II e telófase II (com a formação das tétrades). A Figura 1 esquematiza algumas das principais etapas do processo de divisão meiótico. Figura 1: Esquema representando algumas das fases do processo de divisão meiótica: (A) Célula em intérfase com 2n = 4 cromossomos; (B) Metáfase I; (C) Anáfase I; (D) Células filhas produzidas no final da primeira divisão meiótica, contendo um cromossomo de cada par; (E) Metáfase II; (F) Anáfase II e (G) Células filhas (gametas) produzidas após a segunda divisão meiótica com n = 2 cromossomos Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza e Carlos R. M. da Silva. O������� Preparar lâminas a partir de anteras de milho para a identificação e observação das diferentes fases da meiose em microscópio óptico. M������� Anteras de milho de diferentes idades; Fixador (3 partes de álcool para 1 de ácido acético); Corante carmim propiônico e/ou orceína; Ácido acético a 60%; Microscópio óptico; Frascos de armazenamento, isqueiro, lâminas, lamínulas, estiletes, pinças, pregos, placas de Petri, esmalte incolor, lupa, papel filtro, papel sulfite e lápis. P��������� � ��������� O milho (Zea mays) é um excelente material para a visualização das diferentes fases da meiose por ser facilmente cultivável, permitir a obtenção de uma grande quantidade de anteras (onde são formados os grãos de pólen) a partir do seu pendão e apresentar cromossomos grandes e em pequena quantidade (2n = 20). Para se ter sucesso na realização dessa prática, as anteras deverão ser colhidas na fase em que o milho ainda esteja soltando os pendões. Estas deverão ser expostas e fixadas em uma solução de ácido acético e álcool (3:1) de 12 a 24 horas, seguido de duas trocas deste fixador, com espaçamento de 4 horas entre elas. Após 4 horas da última troca, pode-se guardar no congelador ou no freezer por tempo indeterminado. O������ ������� �� ���������� ����� �� ������ 1. Limpar lâminas e lamínulas e colocá-las em uma estante ou suporte (Figura 2A); 2. Separar o material que será utilizado na preparação das lâminas (Figura 2B); 3. Retirar do congelador o frasco com as anteras fixadas, deixando que alcancem a temperatura ambiente; 4. Colocar as anteras em uma placa de Petri com água a temperatura ambiente, deixando-as por 10 minutos; 5. Separar as anteras (Figura 2C) de diferentes regiões do pendão para se obter células em diferentes fases da meiose – no ápice do pendão estarão as anteras mais claras, onde as fases iniciais da meiose serão mais frequentes, e na base do pendão estarão as anteras mais amareladas, com as fases finais da meiose; 6. Transferir as anteras – no máximo 3 delas – para uma lâmina limpa e, com o auxílio de uma lupa e agulhas, separar as anteras das brácteas (Figura 2D), sendo estas últimas descartadas; 7. Colocar sobre as anteras uma gota do corante carmim propiônico (Figura 2E); 8. Cortar as anteras e esmagá-las levemente com as agulhas para que as células se soltem (Figura 2F); 9. Passar um prego sobre a lâmina, sem tocá-la, para que o material se core melhor (Figura 2G); 10. Aquecê-la levemente e cobrir com uma lamínula; 11. Envolver a lâmina com um pedaço de papel filtro dobrado ao meio; apoiar com os dedos entre as duas extremidades da lamínula, para que esta não se movimente e, com o polegar, apertar para realizar o esmagamento das células (Figura 2H); 12. Vedar as bordas da lamínula com o esmalte incolor e esperar que este seque; 13. Observar ao microscópio óptico, procurando por células que apresentem as diferentes fases da meiose; 14. Desenhar as células com as diferentes fases da meiose, procurando destacar os seus aspectos mais relevantes; 15. Ordenar as imagens, de acordo com as fases da divisão meiótica; 16. Para facilitar a identificação das células em diferentes fases da meiose, basta comparar as imagens obtidas ao microscópio com aquelas apresentadas na Figura 3. Figura 2: Coloração das anteras de milho – (A e B) Material necessário para o preparo das lâminas; (C) Separação das anteras; (D) Retirada das brácteas; (E) Coloração; (F) Dilaceração do tecido; (G) Intensificação da ação do corante e (H) esmagamento do material após a colocação da lamínula Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva e Renata da Rosa. Figura 3: Fases da meiose – (A) Leptóteno; (B) Zigóteno; (C) Paquíteno; (D) Diplóteno; (E) Diacinese; (F) Metáfase I; (G) Anáfase I; (H) Telófase I – note, no meio da célula, o início da citocinese, separando-a em duas; (I) Prófase II; (J) Metáfase II; (K) Anáfase II; (L) Telófase II – em início da citocinese na célula esquerda; (M) Citocinese e (N) Tétrades Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva. B����������� �������� JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A. Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. MEIOSE EM TESTÍCULOS DE GAFANHOTO Renata da Rosa Raquel Bozini Gallo Thayná Bisson Ferraz Lopes I��������� A meiose éa divisão celular responsável pela formação dos gametas. Nos animais, ela apresenta os mesmos estágios encontrados nas células vegetais. Entretanto, os tecidos onde ocorre são diferentes. Nos animais, a meiose acontece nos ovários das fêmeas e nos testículos dos machos. Dentre os insetos, os gafanhotos constituem um ótimo material para estudos meióticos em células animais, pelo fato de muitas espécies desse grupo possuírem um número pequeno de cromossomos (comumente 2n = 24), cromossomos grandes, além de apresentarem uma grande quantidade de células em diferentes estágios da meiose. Esses fatores em conjunto facilitam bastante os estudos citogenéticos. Para esse tipo de análise, o ideal é que os meiócitos, ou seja, as células em meiose, sejam obtidos de gafanhotos machos. Isso porque os ovários das fêmeas possuem uma baixa taxa meiótica, além de normalmente se apresentarem repletos de ovos com muito vitelo, o que dificulta a análise dos cromossomos. Por esse motivo, é importante saber identificar o tecido testicular dos machos e retirá- los com muito cuidado, para que as células não sejam rompidas. Os testículos estão posicionados lateralmente no abdome dos gafanhotos, logo acima da inserção do último par de pernas. Eles possuem uma coloração esbranquiçada e um formato semelhante a um “cacho de bananas”. Ademais, as condutas éticas quanto ao uso de animais devem ser sempre seguidas. Por isso, antes de se eutanasiar um animal, ele deve ser anestesiado para a retirada do tecido e, quando for o caso, o restante das estruturas corporais deve ser descartado em lixo hospitalar apropriado. O������� Preparar lâminas a partir de testículo de gafanhoto para identificação e observação das diferentes fases da meiose em microscópio óptico convencional. M������� Placas com cera ou isopor para fixar os insetos; Soro ou solução fisiológica; Solução fixadora (3 partes de álcool para 1 de ácido acético); Corante orceína lacto-acética; Ácido acético 60%; Microscópio óptico; Frascos de armazenamento, isqueiro, microtubos, lâminas, lamínulas, estiletes, pinças, tesouras, alfinetes, seringas com agulhas, placas de Petri, esmalte incolor, lupa, papel filtro, papel sulfite e lápis. A�������� I – R�������� �� ���������� �� ��������� Esta etapa pode fazer parte da atividade prática, ou então, ser anterior a ela. Neste caso, os testículos poderão ser armazenados em freezer até o momento do uso. Procedimento 1. Material necessário: pinça, alfinetes, tesoura, microtubo, solução fisiológica, solução fixadora e um suporte para fixar o inseto, que pode ser uma placa com cera ou parafina (Figura 1A); 2. Anestesiar o gafanhoto, por meio de congelamento ou eterização, para que este não sinta dor ou sofrimento durante o procedimento; 3. Com o animal anestesiado, fixe-o com alfinetes na placa com cera ou parafina (Figura 1B) e exponha o abdome (Figura 1C); 4. Com a tesoura, faça um corte longitudinal na região dorsal do abdome (Figura 1D); 5. Fixe o tecido epidérmico com alfinetes para facilitar a visualização dos testículos (Figura 1E); 6. Aplicar solução fisiológica suficiente para cobrir todos os tecidos (Figura 1E), a fim de manter os tecidos nutridos; 7. Retirar os testículos com uma pinça (Figura 1F); 8. Colocá-los em um microtubo contendo solução fixadora (Figura 1G), mantendo-os por 30 minutos (Figuras 2F e 2G); 9. Trocar a solução fixadora e repetir os passos 7 e 8 mais uma vez (Figura 1H); 10. Armazenar o testículo em freezer a -20ºC, até o momento do preparo das lâminas. Figura 1: Procedimento para a retirada dos testículos de gafanhoto: (A) Material necessário; (B) Fixação do inseto; (C) e (D) Exposição e corte do abdome; (E) Fixação do tecido epidérmico e aplicação de solução fisiológica; (F) e (G) Retirada e transferência dos testículos e (H) Manutenção em solução fixadora Fonte: Elaborada por Renata da Rosa. A�������� II – O������� �� ������� ��������� � ������ �� ��������� �� ��������� Esta etapa visa obter lâminas semipermanentes de células em meiose para observação ao microscópio óptico. Sendo assim, é preciso ter em mãos os testículos de gafanhotos previamente extraídos e fixados. Procedimento 1. Material necessário: pinça, seringas com agulhas, esmalte incolor, isqueiro, testículos fixados, ácido acético 60%, corante orceína lacto-acética, papel filtro, lápis, papel sulfite e microscópio óptico; 2. Limpar lâminas e lamínulas; 3. Separar material para ser utilizado (Figura 2A); 4. Retirar os testículos do microtubo (Figura 2B); 5. Colocá-los sobre uma lâmina e retirar um único túbulo, retornando o restante para o microtubo (Figura 2C); 6. Cobrir com ácido acético 60% por 10 minutos (Figura 2D), evitando colocar uma gota muito grande (o excesso pode ser retirado com um pedaço de papel filtro); 7. Com o auxílio de estiletes, dilacerar o material até que não se veja algum tipo de grumo, evitando assim que as células fiquem sobrepostas (Figura 2E); 8. Com o material dilacerado, pingar uma gota do corante orceína lacto-acética e, com um isqueiro, esquentar cuidadosamente para melhor fixação do corante (Figuras 2F e 2G); 9. Cobrir com uma lamínula (Figura 2H); 10. Envolver a lâmina com um pedaço de papel filtro dobrado ao meio; 11. Apoiar com os dedos entre as duas extremidades da lamínula, para que esta não se movimente e, com o polegar, apertar para realizar o esmagamento das células (Figura 2I); 12. Vedar a lamínula com o esmalte incolor e esperar que este seque (Figura 2J); 13. Observar ao microscópio óptico, procurando por células que apresentem as diferentes fases da meiose; 14. Desenhar essas células, procurando destacar os aspectos mais relevantes da meiose; 15. Ordenar as imagens, de acordo com as diferentes etapas da divisão meiótica. Figura 2: Procedimento para a coloração das células meióticas de testículos de gafanhoto: (A) Material necessário; (B) Retirada dos testículos do microtubo; (C) Transferência para uma lâmina; (D) Colocação de ácido acético; (E) Dilaceração do tecido; (F) Coloração; (G) Aquecimento; (H) Cobertura com lamínula; (I) Uso de papel filtro para o esmagamento e retirada do excesso de corante e (J) Vedação com esmalte incolor Fonte: Elaborada por Renata da Rosa. Observações É importante preparar várias lâminas, pois é comum não se encontrar todas as fases da meiose em uma única lâmina. Sendo assim, os estudantes podem trocar as lâminas entre si, para que consigam observar a maior quantidade de etapas desse processo de divisão celular. Q������� � ����� ����������� 1. Na Figura 3 são apresentadas algumas fases da meiose de gafanhotos. Quais delas você encontrou nas lâminas que preparou ou estudou? Quais são as características de cada fase que você encontrou? 2. O que são quiasmas e em qual fase do ciclo de divisão meiótico é possível identificá-los? Por quê? 3. Os gafanhotos possuem sistema de determinação sexual XX/X0. Em quais das fases foi possível identificar os cromossomos sexuais? Como eles aparecem? 4. Quais são as principais diferenças entre a meiose em células vegetais e animais? Figura 3: Algumas fases da divisão meiótica em gafanhotos: (A) Interfase; (B) Prófase I – leptóteno; (C) Prófase I – zigóteno; (D) Prófase I – paquíteno; (E) Prófase I – diplóteno; (F) Prófase I – diacinese; (G) Metáfase I; (H) Metáfase II; (I) Anáfase II; (J) Telófase. As setas indicam o cromossomo X Fonte: Elaborada por Raquel Bozini Gallo e Thayná Bisson Ferraz Lopes. B����������� �������� GUERRA, M.; SOUZA, M. J. Como observar cromossomos: um guia de técnicas em citogenética vegetal, animal e humana. Ribeirão Preto: Fundação de Pesquisas Científicas de Ribeirão Preto, 2002. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A. Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. UNIDADE 2 - ESTUDOS CARIOTÍPICOS ANÁLISE CARIOTÍPICA E MONTAGEM DE CARIÓTIPOS Ana Lucia Dias Carlos Roberto Maximiano da Silva I���������A descrição das características do conjunto cromossômico de uma espécie é denominada de cariótipo. Este conjunto de cromossomos se originou na fecundação, quando duas células haploides (n) se fusionam para formar uma célula diploide (2n). Com isso, um organismo costuma possuir cada cromossomo em duplicata. Cada espécie possui normalmente um cariótipo típico com número e morfologia cromossômica próprios. O Quadro 1 mostra a variação na quantidade de cromossomos observada em algumas espécies de animais domésticos. Podemos perceber números cromossômicos bastante próximos, como na cabra (2n = 60), no asno (2n = 62) e no cavalo (2n = 64); idênticos, como no búfalo, no gado e na cabra, todos com 2n = 60; ou, então, bastante discrepantes, como no porco (2n = 38) e no cão (2n = 78). Entretanto, isso é apenas uma pequena amostra do que pode ser encontrado na natureza. Como exemplo de variação máxima possível da quantidade de cromossomos em uma célula somática, o nematoide parasita de cavalo, Parascaris univalens, possui apenas 2 cromossomos, contra os 1.260 cromossomos encontrados na planta Ophioglossum reticulatum (Ophioglossaceae). Quadro 1: Número cromossômico diploide (2n) para algumas espécies de mamíferos Nome comum Gênero e espécie 2n Nome comum Gênero e espécie 2n Búfalo Bison bison 60 Cabra Capra hircus 60 Gato Felis catus 38 Cavalo Equus caballus 64 Gado Bos taurus/B. indicus 60 Humano Homo sapiens 46 Cão Canis familiaris 78 Porco Sus scrofa 38 Asno Equus asinus 62 Ovelha Ovis aries 54 Fonte: Elaborado pelos autores. Caracterização dos cromossomos metafásicos Cariótipo ou cariograma é a descrição clara e precisa das características do conjunto cromossômico de uma determinada espécie. A área da biologia que faz uso de estudos cariotípicos é conhecida como citogenética. Para a caracterização e identificação dos cariótipos, alguns aspectos dos cromossomos são observados. Por exemplo, cada cromossomo mitótico apresenta uma região estrangulada denominada centrômero ou constrição primária que é um ponto de referência citológico básico e divide os cromossomos em dois braços: p ou C para o braço curto e q ou L para o longo (Figura 1). A princípio, as características mais evidentes de um cariótipo são a posição do centrômero, bem como o número e o tamanho dos cromossomos. Quanto à posição do centrômero, os cromossomos podem ser classificados em: metacêntricos, submetacêntricos, acrocêntricos e telocêntricos. Este parâmetro pode ser definido numericamente por meio da chamada razão entre braços (r = q/p), seguindo-se a regra presente na Figura 1. Figura 1: Nomenclatura cromossômica, baseada no tamanho dos seus braços curtos e longos Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza Com base na posição do centrômero e no tamanho dos cromossomos estes são pareados dois a dois. Estes pares são formandos por cromossomos do mesmo tamanho e com a mesma posição de centrômero, sendo chamados de cromossomos homólogos. A montagem de um cariótipo inicia-se pelos pares maiores e que tenham uma mesma posição centromérica, e termina-se com os pares menores, conforme exemplificado na Figura 2. Para os organismos que têm cromossomos sexuais, tanto os do sistema XX/XY quanto os do sistema ZZ/ZW, um dos sexos não formará pares idênticos para tais cromossomos (respectivamente, os machos no sistema XX/XY e as fêmeas no sistema ZZ/ZW). Isso pode ser visto na Figura 2, onde o cromossomo X não está pareado com o cromossomo Y, uma vez que ambos são heteromorfos. Lembrando que os cromossomos não sexuais são também chamados de autossomos. Figura 2: Cariótipos de suínos (Sus scrofa; 2n = 38) fêmea e macho, com dois cromossomos sexuais e 36 autossomos. Observe os cromossomos sexuais, indicados como XX e XY Fonte: Elaborada por Juceli Gonzalez Gouveia Após a montagem do cariótipo, costuma-se fazer um esquema, chamado de idiograma (Figura 3), para que os cromossomos sejam melhores analisados e identificados, bem como para anotar alterações ou regiões de interesse nestes. O������� Demonstrar como os cromossomos de uma ou mais espécies são analisados e classificados. M������� Uma cópia das fotografias de metáfases de diferentes espécies, disponíveis nos Apêndices para cada estudante ou grupo de estudantes; Papel sulfite para montagem dos cariótipos; Tesoura e cola em bastão. Figura 3: Idiograma de suínos (Sus scrofa; 2n = 38) fêmea (A) e macho (B). Compare o idiograma com o cariograma apresentado anteriormente Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza e Carlos R. M. da Silva P����������� Essa atividade pode ser feita individualmente ou em grupo, da seguinte maneira: 1. Recortar os cromossomos, um a um (de cada animal em separado) e ordená-los de acordo com o tamanho (do maior ao menor) e semelhança morfológica (posição do centrômero e tamanho de braços); 2. Classificar os cromossomos, seguindo a nomenclatura cromossômica descrita na Figura 1; 3. Se os cromossomos sexuais puderem ser reconhecidos, colocá-los separados, por último; 4. Depois de organizado, colar os cromossomos no sulfite, seguindo o modelo organizacional apresentado na Figura 2; 5. Quando possível, classificar os cariótipos de acordo com o sexo cromossômico. Q������� � ����� ����������� 1. Qual seria o número diploide de cada espécie analisada? 2. Identifique os cariótipos de acordo com o sexo cromossômico e dê a constituição cromossômica (número de automossomos e cromossomos sexuais) de cada um. 3. Diferencie cada espécie em relação aos tipos cromossômicos (forma e quantidade). B����������� �������� GODAY, C.; PIMPINELLI, S. Cytological analysis of chromosomes in the two species Parascaris univalens and P. equorum. Chromosoma, v. 94, n. 1, p. 1-10, 1986. GUERRA, M. Introdução à citogenética geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1988. NICHOLAS, F. W. Introdução à genética veterinária. Porto Alegre: ARTMED, 1999. PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A. Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de genética. 6. ed. Tradução de Cláudia Lúcia Caetano de Araújo. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. APÊNDICES Fonte: Elaborado por Mariana Campaner Usso e Fábio Hiroshi Takagui. Fonte: Elaborado por Juceli Gonzalez Gouveia. CITOGENÉTICA HUMANA Wagner José Martins Paiva Maria Eliane Longhi Barroso I��������� A citogenética humana é o estudo dos cromossomos humanos por meio de sua estrutura e herança, organizado em um cariótipo. Cariótipo, termo originário do grego karyon (κόμβου) = “nó” e typos (τύπου) = tipo, é uma representação de forma clara e precisa das características do conjunto cromossômico de uma espécie. Utiliza- se cariótipos em estudos de comparação da constituição cromossômica das espécies, para examinar a variação entre indivíduos de uma mesma espécie, para estudos evolutivos, dentre outras aplicações. No Homo sapiens, o cariótipo é essencial como diagnóstico relacionado às alterações numéricas e estruturais dos cromossomos, bem como no diagnóstico pré-implantação, pré-natal e na citogenética do câncer. Portanto, em um cariótipo, procura-se representar a disposição dos cromossomos em pares homólogos de forma sistemática para descrever o complemento cromossômico, normal ou anormal, de um indivíduo, de um tecido ou de uma linhagem celular. A citogenética humana se inicia com Flemming, em 1882. No entanto, somente a partir da década de 1950 é que este campo de pesquisa se desenvolveu, quando Tjio e Levan (1956) verificaram que o número correto de cromossomos da espécie humana era de 46 cromossomos nas células diploides e não 48 cromossomos como apontavam estudos anteriores. A mesma dupla observou que a colchicina impedia a progressão da célula além da metáfase e que uma solução hipotônica permitia o espalhamento dos cromossomos na célula metafásica nas lâminas de microscopia. Outros fatores que incrementaram a citogenética foram o desenvolvimento do método de cultura de leucócitos periféricos por Moorhead et al. (1960) e a utilização dafito-hemaglutinina, um agente mitogênico sobre estas células, conforme descrito por Nowel (1960). Com estas técnicas estabelecidas, foi possível organizar os cromossomos humanos em diferentes grupos, baseados em seu tamanho e localização do centrômero. Isso facilitou a sua contagem e identificação, bem como a detecção de aberrações cromossômicas numéricas, como a trissomia 21 na síndrome de Down (LEJEUNE; GAUTIER; TURPIN, 1959), 45,X0 na síndrome de Turner (FORD et al., 1959), 47,XXY na síndrome de Klinefelter (JACOBS; STRONG, 1959), trissomia 13 (PATAU et al., 1960) e trissomia 18 (EDWARDS et al., 1960). A primeira descrição de uma anomalia envolvendo uma aberração estrutural foi o caso hoje chamado de cromossomo Filadélfia, envolvendo os cromossomos 9 e 22. Este foi visto em um paciente com leucemia mieloide crônica (NOWELL; HUNGERFORD, 1960). A análise citogenética foi melhorada com o desenvolvimento de protocolos de coloração descritos inicialmente por Caspersson, Zech e Johansson (1970), que apresentavam o bandamento por utilização de Quinacrina fluorescente (Banda Q), o que permitiu a diferenciação dos cromossomos do mesmo grupo. Posteriormente, outras técnicas de coloração foram desenvolvidas, como o bandamento G, R, C e NOR, cada uma com suas propriedades e aplicações peculiares. Estes padrões de bandas são semelhantes a códigos de barras que permitem aos citogeneticistas identificar cromossomos, detectar sutis deleções, inversões, inserções, translocações, locais frágeis e outros rearranjos mais complexos. Atualmente, o mais utilizado é o bandamento G, por seu custo e eficiência. Quanto a organização do cariótipo humano, os cromossomos metafásicos foram classificados primeiramente em sete grupos, por sugestão de Patau na Conferência de Denver em 1960 e posteriores revisões nas Conferências de Londres em 1963 e Chicago, em 1966. Várias revisões ocorreram até que, em 1978, foi estabelecido “O Sistema Internacional de Nomenclatura em Citogenética Humana” (ISCN) que teve sua última revisão em 2012 em Seattle, EUA, resultando no ISCN (2013) que estabelece os atuais parâmetros da citogenética humana. O� ������� ������������ Os cromossomos metafásicos constituem o melhor material para os estudos cariotípicos devido ao seu elevado grau de condensação. Esta característica facilita a observação tanto de cromátides como da posição dos centrômeros. Um fator importante nos estudos citogenéticos é a utilização de células oriundas de um tecido com alto índice mitótico que levarão a um bom número de metáfases analisáveis. O cariótipo pode representar o conjunto de cromossomos somáticos (2n) ou gaméticos (n) da espécie, podendo ser apresentado na forma de cariograma ou idiograma. O cariograma é construído a partir da imagem de uma metáfase real em que todos os cromossomos estejam bem corados e individualizados, conforme o bandamento utilizado. O termo idiograma é reservado para a representação esquemática do cariótipo “ideal”, utilizando valores médios da posição do centrômero e o tamanho de cada cromossomo do conjunto haploide. Na construção de um cariótipo, os cromossomos metafásicos dessa imagem são emparelhados. Após a análise visual, estes são enumerados em uma ordem determinada e, no caso humano, divididos e classificados em 7 grupos (A-G), mais os cromossomos sexuais, conforme demonstrado na Figura 1. Isto pode ser feito manualmente, recortando-se os cromossomos dessa imagem, ou a partir de softwares especiais. O número cromossômico dentro de uma espécie é, geralmente, constante e, no caso humano, o número diploide (2n) é de 46 cromossomos. O tamanho dos cromossomos metafásicos varia de aproximadamente 0,5 μm até cerca de 36 μm em todos os eucariotos. O tamanho médio na maioria das espécies é de aproximadamente 5 a 6 μm. O tamanho cromossômico pode ser caracterizado pela porcentagem de cada cromossomo em relação à extensão total do conjunto haploide. De acordo com a posição do centrômero, os cromossomos podem ser classificados em: metacêntrico, submetacêntrico, acrocêntrico e telocêntrico (não existente na espécie humana), conforme o tamanho dos braços do cromossomo. Esta posição centromérica pode ser definida numericamente pela razão de braços (r) e pelo índice centromérico (ic), conforme as equações abaixo: r = q e ic = p x 100 p p + q onde, p = comprimento do braço curto e q = comprimento do braço longo, ambos em μm. Consequentemente, os cromossomos são agrupados em: Cromossomo r ic Metacêntrico 1,00 – 1,49 50,0 – 40,1 Submetacêntrico 1,50 – 2,99 40,0 – 25,1 Acrocêntrico 3,00 – ∞ 25,0 – 0,01 Telocêntrico ∞ 0 Fonte: Elaborado pelos autores. Figura 1: Cariótipo idealizado com um idiograma e um cromossomo normal corado (CTG). Note que há a formação de par entre o idiograma e a foto cromossômica real e que, no total, são apresentados 48 pares e não 46, pelo fato de estarem representados os dois cromossomos sexuais. Consequentemente, em um cariótipo normal, indivíduos do sexo masculino terão 22 pares autossômicos e, nos cromossomos sexuais, um cromossomo X e um Y. Por sua vez, indivíduos do sexo feminino terão 22 pares autossômicos e, nos cromossomos sexuais, dois cromossomos X Fonte: Elaborada por Wagner J. M. Paiva C������������ ��� ����������� ������� ��� ���������� G O bandamento G é atualmente o método de diferenciação dos cromossomos mais utilizado nos laboratórios de citogenética humana. Neste método, após a obtenção das lâminas com as metáfases, se realiza um tratamento com tripsina e posterior coloração com Giemsa (GTG banding: G-bands by trypsin using Giemsa). Nesta técnica de bandamento, obtêm-se bandas claras e escuras. As claras compreendem regiões ricas em GC e as escuras, em AT. Isso é semelhante ao obtido com o bandamento Q, porém, com um risco e custo bem menor ao laboratório. Na descrição da coloração obtida, as regiões e bandas cromossômicas são numeradas do centrômero para o telômero (Telômero ← Centrômero → Telômero), conforme exemplificado na Figura 2. Assim, região é área do cromossomo localizada entre 2 bandas marcadoras adjacentes e banda é a parte do cromossomo que se distingue dos segmentos adjacentes por ser mais clara (negativa) ou mais escura dentro de uma região. Um braço que não tenha banda marcadora consistente é constituído apenas por uma região. Figura 2: Nomenclatura utilizada para se referir a uma determinada região cromossômica Fonte: Elaborada por Wagner J. M. Paiva Para designar a localização da região e da banda, quatro itens são necessários: (1) o número do cromossomo, (2) o símbolo do braço, (3) o número da região e (4) o número da banda dentro dessa região. Esses dados são colocados sem espaçamento ou pontuação. Se houver a subdivisão de uma banda, um ponto decimal é posto após a designação da banda original, seguido pelo número atribuído a cada sub-banda. Por exemplo, no caso da região 9p21 (Figura 2), se 9p21 for subdividida, as sub-bandas serão denominadas 9p21.1, 9p21.2 e 9p21.3, sendo que a sub-banda 9p21.1 é proximal ao centrômero e a 9p21.3 distal, de acordo com o ISCN (2013). Dessa forma, os cromossomos humanos são agrupados em A, B, C, D, E, F e Sexuais em um cariótipo normal (hipotético), considerando-se as suas características individuais, tais como o tamanho, posição do centrômero e padrão de bandamento GTG (Figura 1). A seguir, são apresentadas as características dos cromossomos humanos quando feito o bandamento CTG e a tipificação das suas regiões e bandas. São dadas as características gerais do grupo, cromossomo e seus braços, bem como suas regiões e bandas em um total mediano de 400 a 450 bandas cromossômicas. Os valores entre parêntesis indicam o total de regiões presentes em cada braço cromossômico: Grupo A – apresenta os maiores cromossomos do cariótipo humano Cromossomo 1 – o maior cromossomo da espécie: p(3): Região 1 com banda pequena e intensidade de coloração média próxima ao centrômero, seguida por banda negativa. Região 2 com banda de tamanho médio, mais corada e com uma banda negativa maior.Região 3 com banda escura e mais 3 bandas pouco coradas, intercaladas por 4 bandas negativas. q(4): Região 1 com banda escura abaixo do centrômero de tamanho variável (devido a heterocromatina). Região 2 com uma banda pouco corada e intercalada por 2 negativas maiores. Região 3 com banda escura de tamanho médio seguida de uma negativa. Região 4 com banda de coloração média seguida de negativa e banda menor, próxima ao telômero. Cromossomo 2 – o segundo maior cromossomo da espécie e o maior submetacêntrico: p(2): Região 1 com banda negativa próxima ao centrômero, seguida por banda escura, pequena e coloração média e, novamente banda negativa e outra escura. Região 2 com banda clara e outra média, intercaladas por 3 bandas negativas. q(4): Região 1 com banda negativa seguida de outra de intensidade clara. Região 2 inicia-se com banda negativa seguida por banda escura. Região 3 tem 2 bandas escuras intercaladas por 3 bandas negativas. Cromossomo 3 – o terceiro maior cromossomo humano e no qual as bandas podem parecer simétricas: p(2): Região 1 com banda escura junto ao centrômero, seguida por banda negativa e outra menos corada. Região 2 com 2 bandas negativas intercaladas por uma banda escura e, no final, outra banda escura junto ao telômero. q(2): Região 1 com banda negativa logo abaixo do centrômero de tamanho variável, seguida de banda escura. Região 2 com duas bandas escuras e outra clara, intercaladas por 4 bandas negativas. Grupo B – os cromossomos são submetacêntricos bem acentuados Cromossomo 4 – submetacêntrico, onde o braço curto é bem menor e, em geral, é mais escuro: p(1): Região 1 com banda escura entre duas bandas negativas. q(2): Região 1 com uma banda negativa junto ao centrômero seguida de banda escura. Região 2 constituída de duas bandas negativas seguida de duas bandas escuras, alternadamente. Região 3 com banda escura entre duas bandas negativas. Cromossomo 5 – submetacêntrico, onde o braço curto é bem menor; ligeiramente mais claro que o cromossomo 4: p(1): Região 1 com banda clara junto ao centrômero e, posteriormente, uma banda escura entre outra banda negativa. q(3): Região 1 com uma banda escura entre duas bandas negativas. Região 2 com uma banda escura contígua à região 1 e à banda quatro, seguida de uma banda negativa e outra corada. Região 3 com duas bandas negativas intercaladas por uma banda corada. Grupo C – maior grupo de cromossomos, sendo todos submetacêntricos de tamanho médio Cromossomo 6 – o maior do grupo, com quatro bandas escuras evidentes no braço q: p(2): Região 1 com uma única banda escura próxima ao centrômero. Região 2 com 3 bandas negativas intercaladas por banda escura e outra mais clara próxima ao telômero. q(2): Região 1 com duas bandas escuras separadas por banda negativa. Região 2 com três bandas negativas intercaladas por duas bandas coradas, sendo uma de coloração escura e outra média, em sequência. Cromossomo 7 – o segundo maior do grupo, com banda bem característica próxima ao telômero no braço p: p(2): Região 1 com banda escura e fina junto ao centrômero e outra também fina, intercaladas por duas bandas negativas. Região 2 de coloração média seguida de banda negativa terminal. q(3): Região 1 com banda negativa média junto ao centrômero. Região 2 uma banda escura e tamanho médio, e uma negativa em sequência. Região 3 com banda média de cor escura e uma banda clara, intercaladas entre bandas negativas. Cromossomo 8 – apresenta bandas escuras e finas: p(2): Região 1 com banda negativa junto ao centrômero, seguida de banda de coloração clara e fina. Região 2 com banda clara e fina entre duas bandas negativas. q(2): Região 1 com duas bandas negativas entre uma banda fina de coloração média. Região 2 com duas bandas escuras sendo a última, ligeiramente, maior e mais escura, entremeadas por uma banda negativa, que também ocorre após a última banda escura de tamanho relativamente grande. Cromossomo 9 – próximo ao centrômero, apresenta uma região de heterocromatina de tamanho variável de características herdáveis: p(2): Região 1 com banda curta e coloração de intensidade média próxima ao centrômero e uma banda negativa. Região 2 com banda escura e outra mais difusa, intercaladas por duas bandas negativas, sendo a última até o telômero. q(3): Região 1 com banda clara de tamanho variável desde o centrômero (devido a heterocromatina), seguida por banda negativa. Região 2 com duas bandas escuras entremeadas por uma banda negativa, seguidas de banda negativa terminal. Cromossomo 10 – apresenta bandas escuras e claras e um braço q bem característico, com bandas bem claras: p(1): Região 1 com três bandas negativas, intercaladas por uma de coloração clara média e outra muito clara. q(2): Região 1 com uma banda negativa junto ao centrômero. Região 2 com banda escura e espessa, seguida de outras duas bandas escuras e finas entre três bandas negativas. Cromossomo 11 – apresenta duas bandas escuras bem definidas em cada braço dos cromossomos: p(1): Região 1 com banda escura em meio a duas bandas negativas. q(2): Região 1 com uma banda fina e escura junto ao centrômero, seguida de banda negativa e outra escura e grande. Região 2 com uma banda negativa grande, seguida de uma banda clara e fina e outra banda negativa fina. Cromossomo 12 – o braço p é bem menor do que o q: p(1): Região 1 apresenta uma banda escura centralizada entre duas bandas negativas. q(2): Região 1 apresenta uma banda escura e fina, contígua ao centrômero, seguida de uma banda negativa de tamanho médio, uma banda de coloração mediana e outra negativa bem fina. Região 2 com uma banda média e escura seguida de banda negativa grande, depois banda clara e fina seguida de banda negativa terminal. Grupo D – cromossomos acrocêntricos e com satélites nos seus braços curtos Cromossomo 13 – com duas bandas escuras bem características e centrômero bem corado: p(1): Região 1 pouco corada sendo, em grande parte, possível observar os satélites mais corados. q(3): Região 1 com banda fina e clara entre duas bandas negativas. Região 2 com uma banda escura e outra negativa. Na Região 3, novamente uma banda escura e outra negativa, esta última sendo terminal. Cromossomo 14 – apresenta duas bandas escuras bem características e centrômero com coloração mediana: p(1): Região 1 pouco corada e em grande parte é possível observar os satélites mais corados, de modo semelhante ao cromossomo 13. q(3): Região 1 inicia-se com banda negativa e banda escura, conseguinte à região 2. Região 2 inicia com a região 1 em uma banda escura (existe a possibilidade de visualizar uma separação se houver maior distensão cromossômica) e segue com uma banda negativa bem fina, uma banda clara também bem fina e depois outra banda negativa maior. Região 3 tem início com uma banda escura pequena e uma banda negativa terminal. Cromossomo 15 – apresenta, como um todo, pouca coloração: p(1): Região 1 pouco corada e, em grande parte, é possível observar os satélites mais corados de modo semelhante aos cromossomos 13 e 14. q(2): Região 1 com banda fina e coloração média entre duas bandas negativas. Região 2 apresenta banda estreita de média coloração entre duas bandas negativas, seguida de uma banda clara, outra banda negativa maior, uma banda clara bem fina e uma banda de coloração média fina, tendo entre si uma banda negativa e junto ao telômero, outra banda negativa. Grupo E – todos submetacêntricos Cromossomo 16 – submetacêntrico, no entanto, devido a variação de região heterocromática muitas vezes parece metacêntrico: p(1): Região 1 é única com três bandas negativas intercaladas por duas bandas claras e finas. q(2): Região 1 com banda escura próxima ao centrômero de tamanho variável, seguida de uma banda negativa. Região 2 com banda escura de tamanho médio entre duas bandas negativas. Cromossomo 17 – um pouco menor que o 16, com menos bandas e coloração menos intensa: p(1): Única região, apresenta uma banda clara e estreita entre duas bandas negativas. q(2): Região 1 com banda negativa e outra clara efina, próximas ao centrômero. Região 2 com banda negativa grande, seguida de banda escura e depois outra banda negativa terminal. Cromossomo 18 – o menor do grupo, sendo submetacêntrico e bem acentuado: p(1): Braço com uma única região, com banda negativa ocupando-o quase todo e com uma banda junto ao telômero, clara e fina. q(2): Região 1 com banda fina negativa, seguida de banda escura mediana. Região 2 com banda negativa grande, uma escura mediana, seguida de outra banda negativa terminal, bem fina. Grupo F – metacêntricos pequenos, ligeiramente menores que o cromossomo 18 e pouco maiores que os cromossomos do grupo G Cromossomo 19 – apresenta uma banda escura em torno do centrômero e bandas negativas em quase toda extensão dos dois braços, sendo o restante pouco corado: p(1): Banda negativa em quase toda extensão do braço sendo, às vezes, difícil a sua visualização. q(1): Banda negativa em quase toda extensão do braço, seguido de uma banda clara junto ao telômero. Cromossomo 20 – muito semelhante ao 19, no entanto, apresenta bandas mais evidentes: p(1): Braço com uma região, com banda de tamanho e coloração mediana, intercalada por duas bandas negativas. q(1): Única região com uma banda negativa grande, seguida de banda clara e outra banda negativa terminal. Grupo G – acrocêntricos pequenos (os menores da espécie) e com satélites no braço p Cromossomo 21 – tem uma banda escura em torno do centrômero e bandas negativas em quase toda extensão dos dois braços: p(1): Uma única região que apresenta variação de tamanho e intensidade de coloração, com os satélites as vezes mais corados. q(2): Região 1 constituída de banda negativa fina próxima ao centrômero e região 2 com banda mediana e escura seguida por banda negativa grande e terminal. Cromossomo 22 – composto quase que totalmente por bandas negativas: p(1): A única região presente tem variação de tamanho e coloração com os satélites as vezes mais corados. q(1): Região com apenas com uma banda clara e fina entre duas bandas negativas. Sexuais – dois cromossomos que podem ser pares homólogos (2 cromossomos X) ou não homólogos (1 cromossomo X e um Y) no sexo heterogamético: Cromossomo X – de tamanho semelhante aos cromossomos do grupo C e com 3 bandas escuras bem características: p(2): Região 1 é uma banda negativa próxima ao centrômero. Região 2 com banda média e escura bem marcada e outra de coloração média, intercaladas entre bandas negativas. q(2): Região 1 com banda negativa junto ao centrômero. Região 2 com banda mediana e escura bem evidente, seguida de banda negativa grande, uma banda escura e outra banda negativa terminal. Cromossomo Y – acrocêntrico e ligeiramente maior que os cromossomos do grupo G. Normalmente não apresenta satélite no seu braço curto, como os cromossomos 21 e 22. Tem um tamanho variável entre os indivíduos, mas é constante em um mesmo indivíduo: p(1): Única região, com banda negativa mediana seguida de banda de coloração média e bem fina junto ao telômero. q(1): Braço com única região que inicia com bandas finas, sendo uma de coloração negativa e outra mediana. Depois apresenta outra banda negativa seguida de banda escura até o telômero, que é de tamanho variável, conforme o indivíduo. O������� Introduzir elementos básicos da classificação dos cromossomos humanos e da montagem de um cariótipo com o método mais usual dentro dos serviços de aconselhamento genético. M������� Uma cópia das Fotografias de metáfases humanas, disponíveis nos Apêndices para cada estudante ou grupo de estudantes; Papel sulfite para montagem dos cariótipos; Tesoura e cola em bastão. P����������� Essa atividade pode ser realizada individualmente ou em grupo, da seguinte maneira: 1. Preparar as folhas de sulfite para a montagem do cariograma, visando a identificação de cada par cromossômico dentro de cada grupo, conforme modelo da Figura 1; 2. Classificar os cromossomos de cada metáfase, conforme as regras do ISCN 2013, descritas no item “Classificação dos cromossomos humanos via bandamento G”; 3. Recortar os cromossomos e colá-los na sua posição correspondente no cariograma. Q������� � ����� ����������� 1. Quantos cromossomos foram identificados em cada metáfase? 2. Os cariótipos montados correspondem a indivíduos do sexo masculino ou feminino? 3. Os cariótipos correspondem a uma pessoa citogeneticamente normal? Como você chegou a essa conclusão? 4. Qual seria o diagnóstico para os cariótipos considerados anormais? Quais as características clínicas (físicas e neuropsicológicas) dos indivíduos que apresentarem tais resultados? P��� ��������� 1. Discuta qual foi a maior dificuldade encontrada na classificação dos cromossomos. 2. Qual a importância das modernas técnicas de identificação dos cromossomos? 3. Qual a importância em se identificar indivíduos afetados por alterações citogenéticas? 4. Além dos achados citogenéticos proporcionados por esta prática, existem outras alterações citogenéticas registradas pela literatura? B����������� �������� CASPERSSON, T.; ZECH, L.; JOHANSSON, C. Differential binding of alkylating fluorochromes in human chromosomes. Experimental Cell Resarch, v. 60, n. 3, p. 315-319, 1970. EDWARDS, J. H.; HARNDEN, D. G.; CAMERON, A. H; CROSSE, V. M.; WOLFF, O.H. A new trisomic syndrome. Lancet, v.1, n.7128, p. 787-790, 09 Apr. 1960. FORD, C. E.; JONES, K. W.; POLANI, P. E.; DE ALMEIDA, J. C.; BRIGGS J. H. A sex-chromosome anomaly in a case of gonadal dysgenesis (Turner’s syndrome). Lancet, v.1, n.7075, p. 711-713, 04 Apr. 1959. JACOBS, P. A.; STRONG, J. A. A case of human intersexuality having possible XXY sex-determining mechanism. Nature, v. 2, p. 164-167, 1959. LEJEUNE, J.; GAUTIER, M.; TURPIN, R. Etude des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. Comptes Rendus Academies des Sciences, Paris, v. 248, p. 1721-1722, 1959. MOORHEAD, O. P.; NOWELL, P. C.; MELLMAN, W. J.; BATTIPS, D. M. HUNGERFORD, D. A. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Experimental Cell Research, v. 20, n.3, p. 613-16.1960. NOWEL, P. C. Phytohaemagglutinin: An initiator of mitosis in cultures of normal human leukocytes. Cancer Research, v. 20, p. 462-466, 1960. NOWELL, P. C.; HUNGERFORD, D. A. A minute chromosome in human granulocytic leukemia. Science, v. 142, p. 1497, 1960. PATAU, K.; SMITH, D. W.; THERMAN, E.; INHORN, S. L. WAGNER, H. P. Multiple congenital anomaly caused by an extra autosome. Lancet, v.1, n. 7128, p. 790- 793, 09 Apr. 1960. SHAFFER, L. G.; McGOWAN-JORDAN, J.; SCHMID, M. (Ed.). ISCN 2013: An International System for Human Cytogenetics Nomenclature. Basel: Karger, 2013. TJIO, J. H.; LEVAN, A. The chromosome number of man. Hereditas, v. 45, p. 1-6, 1956. APÊNDICES Fonte: Elaborados por Wagner J. M. Paiva e Maria E. L. Barroso. UNIDADE 3 - BIOLOGIA MOLECULAR CONSTRUINDO UM MOLDE DA MOLÉCULA DE DNA Rogério Fernandes de Souza Fernanda Simões de Almeida Leda Maria Koelblinger Sodré I��������� A vida é caracterizada por uma extraordinária diversidade, mas as instruções codificantes de todos os organismos vivos estão escritas a mesma linguagem genética – a dos ácidos nucleicos. O Ácido Desoxirribonucleico ou simplesmente DNA é a molécula dos seres vivos para armazenar e transmitir as informações genéticas que orientarão a estruturação e o funcionamento do organismo. O DNA é um polímero de unidades estruturais chamadas nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto por um grupamento fosfato, um açúcar (desoxirribose) e uma base nitrogenada (adenina, timina, guanina ou citosina). Os nucleotídeos são unidos covalentemente entre si para a formação de cada fita da molécula de DNA. Isso ocorre por meio de ligações fosfodiéster, nas quais um grupamento fosfato une o átomo de carbono 5’ de uma pentose com o carbono 3’ de uma outra. E as duas fitas são estabilizadas a partir de ligações de hidrogênio que se formam entre as bases nitrogenadas: adenina pareando-se com a timina e citosina pareando-se com a guanina. O DNA consiste em doisfilamentos nucleotídicos que se helicoidizam um ao redor do outro para formar uma dupla-hélice. Os açúcares e fosfatos ficam do lado externo da hélice, e as bases ficam empilhadas no interior. Os dois filamentos têm polaridade inversa e são complementares, unidos por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas de cada filamento. O������� Construir um molde didático tridimensional da molécula de DNA para permitir que os estudantes consigam perceber os principais aspectos relacionados à estrutura e ao papel dessa molécula no armazenamento e transmissão da informação genética. M������� Uma cópia dos moldes de pares de bases (A-T = Adenina- Timina) e (G-C = Guanina-Citosina), disponíveis nos Apêndices, para cada grupo de estudantes; Canudos plásticos de refresco (de uma única cor para cada molécula); Cordonê ou barbante fino; Palitos de madeira para picolé; Cola branca ou em bastão; Fita crepe; Furadeira elétrica com broca pequena para madeira (7/64 ou 4,0 mm); Tesoura ou estilete; Papel sulfite colorido (duas cores). P��������� � ��������� A quantidade de material apresentada a seguir permite a construção de um molde da molécula de DNA. O professor deverá calcular a quantidade de material a ser preparado de acordo com o número de equipes e proceder da seguinte maneira: 1. Separar 12 palitos de sorvete, amontoá-los em grupos de 6 palitos, passar uma fita crepe nas duas bordas para mantê- los unidos e para diminuir o risco de esses serem partidos durante a perfuração; 2. Com o auxílio de uma furadeira elétrica com broca para madeira, fazer um furo próximo a cada ponta dos palitos de sorvete, para permitir que o molde seja montado; 3. Para ajudar a diferenciar os pares de nucleotídeos, o molde A-T pode ser impresso ou xerocado em uma cor de sulfite e o molde G-C em uma outra cor. P����������� Essa prática deve ser realizada por diferentes grupos de estudantes, a fim de que estes possam comparar as semelhanças e diferenças (em termos de sequências nucleotídicas) entre os moldes construídos. Pode-se pedir, inclusive, que estes transcrevam e traduzam as suas moléculas de DNA. 1. Recortar os moldes A-T e G-C nas regiões indicadas; 2. Cortar os canudos de refresco em pedaços iguais de 3,5 cm; 3. Cortar duas tiras de aproximadamente 1,5 m de barbante e fazer um nó em uma das pontas de cada tira; 4. Dobrar um molde (A-T ou G-C) na região pontilhada e colar em um palito de sorvete, conforme demonstrado na Figura 1(A), de modo a permitir que um mesmo par de bases possa ser visto dos dois lados; Figura 1: Forma de montagem do molde de DNA: (A) Dobrar cada molde de bases nitrogenadas na região pontilhada, indicada pelas setas, e colar em um palito de sorvete. (B) Montar o molde de DNA, usando o barbante, os canudinhos de refresco e os moldes colados nos palitos de sorvete Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza. 1. Passar cada uma das tiras de barbante em um dos furos de um palito de sorvete que não tenha nenhum molde colado, de acordo com o esquema da Figura 1(B) 2. Enfiar um pedaço de canudo em cada barbante, seguido de um palito de sorvete com o molde colado, repetindo esse procedimento até acabarem todos os moldes; 3. Finalizar com um canudo e um palito de sorvete sem nenhum molde, fazendo um nó em cada fita de barbante; 4. Usar os dois palitos das pontas (sem moldes) como apoio para demonstrar como a molécula de DNA se dobra (com giro para a direita) para formar a dupla hélice. Q������� � ����� ����������� 1. A estrutura montada é baseada no modelo de Watson e Crick, proposto em 1953. Olhando para ela quais são as principais conclusões que se pode tirar sobre o modelo de duplo filamento da molécula de DNA? 2. Comparando o modelo construído com os de seus colegas, em que ele é diferente? 3. Observando a molécula construída discuta onde estaria contida a informação genética? 4. Considerando que cada molécula construída pelos grupos seja um gene, como poderia ser a definição, a esse nível, do que seria um gene? B����������� �������� PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A. Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de genética. 6. ed. Tradução de Cláudia Lúcia Caetano de Araújo. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. APÊNDICES Fonte: Elaborado por Rogério F. de Souza. Fonte: Elaborado por Rogério F. de Souza. UNIDADE 4 - GENÉTICA QUALITATIVA E QUANTITATIVA NOÇÕES DE PROBABILIDADE APLICADA À GENÉTICA Rogério Fernandes de Souza I��������� Qual seria a chance de alguém ser atingido por um meteorito ou de ganhar na loteria? Ou de Maíra e João, que tiveram meninas nas três primeiras gestações, venham a ter agora um menino, na sua quarta gravidez, conforme representado no heredograma da Figura 1? Esses exemplos, embora tão distintos, compartilham uma coisa em comum: eles envolvem situações futuras para as quais ainda não sabemos os resultados e que poderão acontecer pelo menos de duas maneiras diferentes. Mas, seria possível determinar com exatidão a chance de ocorrência de cada um desses eventos? Bem, existe uma área da ciência, chamada de Estatística, que se utiliza de teorias probabilísticas para calcular a possibilidade que eventos como esses, que ocorrem de uma maneira regular, venham a se repetir no futuro. Figura 1: João e Maíra tiveram três filhas. Qual seria a probabilidade da quarta criança ser um menino? Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza. Mas, o que seriam as teorias probabilísticas e como elas podem responder a tais tipos de questões? Do Latim probare = provar/testar, probabilidade é a palavra usada em estatística para se referir a situações que podem ter diferentes resultados. E o que sorte e azar têm a ver com probabilidade? Bem, de um modo geral chamamos de sorte quando obtemos um resultado que nos é vantajoso, como ganhar na loteria. Por outro lado, se nos for nocivo, como nascermos com uma doença hereditária, falamos de azar. Acontece que as teorias probabilísticas usadas pelos estatísticos são ferramentas muito úteis justamente porque permitem que calculemos a chance de termos sorte ou azar em uma série de situações. E embora, à primeira vista, elas pareçam complicadas ou deem a impressão de que servem apenas para resolver coisas sem muita importância, como determinarmos a chance de alguém ser atingido por um meteorito, elas estão definitivamente inseridas na nossa sociedade. Das análises feitas em uma previsão eleitoral, passando pelo lançamento de satélites em órbita da Terra até os testes de eficiência de novos medicamentos para o combate ao câncer, tudo isso é apoiado por cálculos probabilísticos e por testes estatísticos. E, embora não resolvam o nosso problema de origem hereditária, elas podem nos ajudar mostrando, por exemplo, quais serão os riscos de passarmos essa mesma característica para os nossos descendentes. Ou seja, as teorias probabilísticas e a estatística nos ajudam nas tomadas de decisões. Em determinadas áreas da genética, ter esse tipo de informação é uma questão crucial. N����� �� ������������� Para entendermos duas das principais regras das teorias probabilísticas muito utilizadas em genética, podemos programar uma série de sorteios com moedas comuns. Por exemplo, se alguém lançar uma moeda para o alto e eu apostar que ela cairá com a cara voltada para cima, qual será a chance que eu acerte? Neste caso, como demonstrado na Figura 2A, existem dois eventos ou situações possíveis: Evento 1, ela cair com a cara voltada para cima e, Evento 2, ela cair com a coroa voltada para cima. Por esse motivo, dizemos que o nosso espaço amostral, ou seja, o total de eventos possíveis, é 2. Como eu apostei em apenas uma de duas possibilidades, a probabilidade (P) que eu ganhe será: P(sortear cara) = Sortear cara = 1 ou 0,5 (50%)Espaço amostral 2 Podemos agora estender o nosso raciocínio para dois sorteios independentes. Sorteios independentes são aqueles onde o resultado de um deles não interfere no resultado dos outros, como acontece quando
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