Aula 14 Técnicas Imunológicas (1)

Prévia do material em texto

Técnicas Imunológicas
Prof. Tulio Queto
● Todas as técnicas se baseiam na interação 
Antígeno-Anticorpo.
● Tudo começou com imunopreciptação, técnica que 
ainda hoje é utilizada para alguns testes como 
hemaglutinação. (Devido aos complexos imunes)
• As reações de aglutinação decorrem da ligação entre o Ac e Ag
particulado.
• É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de 
Ac, que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.
• Agregação visível de partículas
Eritrócitos 
Bactérias 
Fungos 
Látex
o Fatores que influenciam a formação dos agregados
• Classe do anticorpo envolvido.
• Concentração iônica e pH do meio.
• Presença de macromoléculas, íons, enzimas e 
conservantes.
• Tempo e temperatura.
• Padronização adequada da suspensão de micropartículas 
ou células.
• Concentração ótima de antígeno ou Ac a ser fixado nas 
micropartículas ou células.
• Estabilidade da ligação do Ag/Ac e acessibilidade dessa 
molécula nas micropartículas ou células.
Vantagens:
• Baixo custo.
• Boa especificidade.
• Leitura visual.
• Facilidade de execução.
Desvantagens:
• Baixa sensibilidade.
• Reprodutibilidade dos lotes de reagentes.
• Acessibilidade molecular para interação Ag-Ac.
• Estabilidade da ligação do Ag/Ac no suporte.
• Aglutinação Direta
O antígeno faz parte naturalmente da membrana da célula
Anticorpos específicos promovem a haverá aglutinação dessas
Anticorpo Antígeno Complexo precipitado
Tipagem ABO
Testes confirmatórios para sífilis 
Aglutinação bacteriana
Presença de infecção
Diferenciação de espécies
Salmonelose aviária
Coriza infecciosa das galinhas
Micoplasmose 
Brucelose
• Tipagem ABO
Aglutinação Indireta
• Uso para detecção de Anticorpos ou Ag solúveis no soro investigado.
• do paciente.Esse método usa micropartículas inertes carregadas de 
antígenos ou anticorpos para detecção de amostras.
+
+
Incubados e 
colocados em 
placa
Particulas
revestidas
com hCG
Ac
Positivo não aglutina, pois osAc se ligaram 
ao hCG da urina na incubação
Soro anti hCG Urina
+
• Inibição da Aglutinação - Teste de gravidez
POSITIVO
Soro anti hCG
NEGATIVO
+ Urina
+
hCG
Incubados e 
colocados em 
placa
Ac
Negativo aglutina
• Teste de Coombs
• Ac antiimunoglobulinas 
(Robert Coombs).
• Doença Hemolítica do Recém Nato –
mãe produz IgG anti-Rh (DHRN)
• Não aglutinam os eritrócitos.
• Direto: Ac ligados aos 
eritrócitos fetais.
• Indireto: Ac anti-Rh não 
aglutinantes no soro materno.
• Permite detectar 
incompatibilidades Rh, 
prevenindo contra DHRN.
Imunopreciptação
• Técnica se baseia na observação de complexos imunes preciptados a olho nú.
• Teste utilizado para detectar a presença de anticorpo (ac) específicos em fluidos
corporais
• Possui boa especificidade com falhas de sensibilidade (Qualitativo)
• A formação do complexo ag/ac e sua precipitação permite a visualização do
teste
•Facilidade de confecção do teste
•Antígeno e anticorpo são colocados em meio semi-sólido ou líquido, interagem e 
precipitam formando uma linha de precipitação, que indica a presença do 
anticorpo no soro.
o Elementos necessários para a realização:
Gel de Agarose ou Ágar (o gel pode ser impregnado com Ac ou não a
depender do tipo de imunodifusão),
Antígeno purificado (imunodifusão dupla),
Anticorpo purificado (controle positivo),
Amostras a serem testadas,
Placa de poliestireno, Petri, ou lâmina de microscopia,
Cuba de eletroforese horizontal.
o Vantagens
• É um método de fácil execução,
•Não necessita de aparato sofisticado,
•Teste com boa especificidade (característica que indica que o teste em 
questão identificará somente o ag ou ac desejado) – menor risco de falsos-
positivos,
•Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo,
•Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo em comparação
com outras técnicas.
oDesvantagens
•Falhas em sensibilidade, o que indica um alto risco de falsos negativos,
•É um teste que apresenta alguns problemas com a 
reprodutibilidade,
•Apesar de ser um texte de rápida execução, o tempo de incubação é muito 
grande, de 24 até 72 horas em alguns casos.
•Difícil peservação do gel
• Não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas.
PRINCIPAIS TIPOS EM MEIO SEMI-SÓLIDO
•IMUNODIFUSÃO RADIAL: dosagem de ac ou ag
• IMUNODIFUSÃO DUPLA: detecção de ac
•IMUNOELETROFORESE: avaliação de imunoglobulinas
Zona de excesso 
de anticorpo
Zona de 
equivalência
Zona de excesso 
de antígeno
+ - -
+- -
Anticorpo livre
Antígeno livre
Precipitaçã 
o de 
anticorpo
Quantidade de antígeno adicionado
● Técnicas hoje variada das técnicas imunológicas
● ELISA
● Citometria de Fluxo
● Western Blot (Immunoblot)
● Multiplex
● ELISpot
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent
Assay
● Técnica para detecção de Antígenos
● Técnica para detecção de Anticorpos
● Qualitativo e Quantitativo
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA
• Teste de ligação primária
• ELISA indireto
• ELISA competitivo
• ELISA sanduíche (de captura)
• ELISA competitivo
DETECÇÃO DE ANTÍGENOS (Ag)
DETECÇÃO DE ANTICORPOS (Ac)
Cuidados na colheita 
de soros para uso no 
ELISA
Etapas ELISA
1. Diluição do soro sanguíneo
2. Incubação
3. Lavagem
4. Anticorpo conjugado à enzima
5. Incubação
6. Lavagem
7. Substrato
8. Incubação
9. Solução de parada
10. Leitura
Direto
ELISA DIRETO
ELISA-SANDUÍCHE (Captura)
ELISA Captura Indireto
Por Jefffrey M Vinocur
ELISA COMPETITIVO- detecção de Acs
Resultado
Curva de Calibração 
y = 0,0005x + 0,0312
R
2
 = 0,9849
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 500 1000 1500
TNF pg/mL
D
O
Ensaio Imunoenzimático
VANTAGENS
• Alta sensibilidade
• Boa especificiade
• Baixo custo
• Kits
• Versatilidade (amostras 
individuais e grande escala)
DESVANTAGENS
• Aparelhos para a lavagem das placas
• Espectofotômetro-leitura da reação
• Reações inespecíficas
• Problemas na pureza do antígeno 
para alguns tipos de vírus
Imunoblot / WesternBlot
Também conhecido como immunoblot, o western blot é uma 
técnica para detecção de proteínas qualitativo e semi-
quantitativo.
Os nomes western blot e northern blot são um trocadilho 
com o nome da técnica southern blot.
Assim como a técnica de northern blot (usada para detectar 
RNA) a western blot é derivada da técnica de detecção de 
DNA desenvolvida por Edwin Southern denominada southern
blot.
WESTERN BLOT
Southern Blot 
DNA - 1a
Northern Blot
RNA - 2a
Western Blot 
Proteína - 3a
WESTERN BLOT
Etapas em comum:
1 – Passagem da amostra por eletroforese em gel.
2 – Transferência da amostra do gel para uma 
membrana (normalmente nitrocelulose).
3 – Revelação da amostra usando sonda 
específica marcada:
a – Southern e Northern blot – seqüência
complementar de DNA marcada.
b – Western blot – Anticorpo específico contra 
proteína.
WESTERN BLOT
ETAPA 1 – Obtenção e preparo da Amostra
Qualquer proteína, de qualquer organismo, pode ser 
analisada por western blot, desde que se possua o 
anticorpo de revelação específico.
Para análise de proteínas do sangue (como 
anticorpos) utiliza-se o soro diretamente.
Para análise de proteínas intracelulares e proteínas de 
membrana, preciso romper a membrana da célula.
No caso de possuir parede celular, usar enzimas para 
destruir a parede.
WESTERN BLOT
Desnaturar as proteínas fervendo a amostra na 
presença do detergente dodecil sulfato de sódio 
(SDS) em tampão.
A proteína perderá sua configuração terciária ou 
quaternária e o enxofre mantem proteína desnaturada 
impedindo a formação das pontes dissulfeto.
ETAPA 1 – Obtenção e preparo da Amostra
WESTERN BLOT
ETAPA 2 – Eletroforese
Realizado preferencialmente em gel de poliacrilamida.
Normalmente chamado de SDS-PAGE pois o tampão 
de corrida possui SDS para manter a proteína 
desnaturada.
O tampão mantém a proteína toda com carga 
negativa.
WESTERN BLOT
Mistura de 
Proteínas
Amostra
gel de 
poliacrilamidaCarga Negativa
Carga Positiva
ETAPA 2 –
Eletroforese
ETAPA 2 –
Eletroforese
C
o
rr
e
n
te
 E
lé
tr
ic
a
Alguma destas 
bandas possui a 
proteína que eu 
quero?
ETAPA 3 – Transferência da amostra
Para avaliar as proteínas alvo, transfere-se as 
proteínas do gel para uma superfície lisa.
Com a amostra no meio do gel, fica extremamente 
difícil fazer o reconhecimento com anticorpo, por ser 
grande e não entrar no gel.
Portanto, a amostra é transferida para uma 
membrana, normalmente de nitrocelulose.
WESTERN BLOT
ETAPA 3 – Transferência da amostra
Amostras Separadas
Membrana de 
Nitrocelulose
Corrente 
Elétrica
WESTERN BLOT
Gel
Membrana de 
Nitrocelulose
Amostras
ETAPA 3 – Transferência da amostra
WESTERN BLOT
ETAPA 4 – Detecção e Revelação da Amostra
Realizada de duas maneiras. Direta ou indireta.
Primeiramente satura-se a membrana com proteína 
para evitar que o anticorpo se ligue inespecificamente 
a membrana promovendo marcação falso positiva.
Direta: Anticorpo de detecção marcado para 
revelação.
Indireta: Anticorpo primário de detecção. Anticorpo 
secundário de revelação.
WESTERN BLOT
Enz
Enz
Enz
Enz
Enz
ETAPA 4 – Detecção e Revelação da Amostra
Direta
WESTERN BLOT
Enz
ETAPA 4 – Detecção e Revelação da Amostra
Direta
Substrato
Produto 
Precipitado
WESTERN BLOT
ETAPA 4 – Detecção e Revelação da Amostra
Indireta
WESTERN BLOT
ETAPA 4 – Detecção e Revelação da Amostra
Indireta
Enz
Enz Enz
Enz
Enz
Enz
WESTERN BLOT
Enz
ETAPA 4 – Detecção e Revelação da Amostra
Direta
Substrato
Produto 
Precipitado
WESTERN BLOT
Outras Técnicas de Revelação da Amostra
Com Fluorescência, Radiação etc.
Técnica usada para detecção de Antígenos 
específicos. Devido ao custo, usada para confirmar 
dados de outros testes, como teste HIV.
WESTERN BLOT
Imunoistoquímica
E
Imunocitoquímica
• A imunoistoquímica combina técnicas histológicas, imunológicas e 
bioquímicas objetivando identificar componentes celulares ou 
tissulares através da reação com anticorpos específicos, em uma 
secção histológica, esfregaço ou suspensão celular.
• A denominação imunoistoquímica é habitualmente utilizada para a 
avaliação de fragmentos tissulares. Imunocitoquímica, por sua vez, 
se refere à avaliação a nível celular.
• Essa técnica imunológica possibilita visualizar distribuição e 
localização de componentes celulares específicos na célula/tecido. 
Para tal, o antígeno deve permanecer insolúvel e sua estrutura 
terciária deve estar preservada, permitindo a ligação com o 
anticorpo
• Técnica Qualitativa e Semi-Quantitativa
oVantagens
•Custo baixo a moderado.
•Alta sensibilidade e especificidade.
•Permite a análise de 1 ou múltiplos antígenos simultaneamente.
•Possibilidade de detecção e localização de proteínas 
intracelulares, bem como do tráfego intracelular. Para essa 
finalidade, as membranas celulares são solubilizadas com Triton.
•É possível analisar 1 antígeno particular em vários tecidos em 
uma mesma lâmina.
•Aplicável a células vivas.
•Padronização e realização simples.
•Necessidade de pequenas quantidades de tecido.
oDesvantagens
•Necessidade de mão de obra especializada.
•Processamento demorado da amostra.
•Não automação.
•Preparações não permanentes.
•Técnicas especiais para fixação e inclusão de tecidos para 
imunoistoquímica nem sempre estão presentes.
•Necessidade de microscopia especializada (quando usando 
fluorocromos).
•Variabilidade do resultado conforme a leitura realizada pelo 
observador na imunoistoquímica por fluorescência.
• O anticorpo de detecção, antígeno-específico, é marcado com uma 
substância fluorescente, elemento radioativo, ouro coloidal ou 
enzima.
• As amostras são, então, incubadas com substratos enzimáticos 
(quando Ac está marcado com enzima), produzindo um produto que 
sofre precipitação direta no corte histológico, gerando uma 
coloração, que reflete a distribuição do antígeno alvo no 
tecido/célula analisado.
• A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação é 
realizada em microscópio óptico comum ou fluorescente.
• Frequentemente o anticorpo de detecção é biotinilado (conjugado 
com biotina, uma vitamina com alta afinidade por estreptoavidina) 
nos ensaios enzimáticos. Essa metodologia serve para ampliar o 
sinal gerado, tornando o método mais sensível.
Princípios da Técnica
Enzima Cromógeno Cor do produto final
Peroxidase 
horseradish
3-amino-9-etilcarbazol Vermelho
4-cloro-1-naftol Azul
Reagente Hanker-Yates Azul escuro
Pironina alfa-naftol Vermelho púrpura
Fosfatase alcalina Naftol-AS-BI-Fosfato / Nova 
Fucsina (NABP/NF)
Vermelho intensao
Bromocloroindolil Fosfato / 
Tetrazolina Nitro Azul 
(BCIP/NBT)
Púrpura escuro 
intenso
Beta-D-
galactosidase 
derivada de 
bactéria
5-bromo-4-cloro-3 indolil beta-
D-galactopiranosídeo (BCIG)
Azul intenso
IMUNOISTOQUÍMICA – Princípios da Técnica
Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Coloração
DAPI 365 420 Azul
Fluoresceína (FITC) 495 525 Verde
Hoechts 33258 360 470 Azul
R-ficocianina 555, 618 634 Vermelha
B-ficoeritrina 545, 565 575 Laranja, vermelha
R-ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja, vermelha
Rodamina (TRICT) 552 570 Vermelha
Texas red 596 620 Vermelha
IMUNOISTOQUÍMICA – Princípios da Técnica
• Método direto.
• Método indireto.
• Método da Peroxidase-Antiperoxidase (PAP).
• Método do Complexo Avidina-Biotina-Peroxidase (ABC).
• Método da Estreptoavidina-Biotina-Peroxidase (ABP).
• Método da Estreptoavidina-Fosfatase Alcalina (SAAP).
IMUNOISTOQUÍMICA – Princípios da Técnica
• Inativação inadequada de enzimas endógenas.
• Difusão do Ag investigado do local de síntese para o tecido 
circundante.
• Presença de Ag em altas concentrações no plasma perfundindo o 
tecido anteriormente à sua fixação.
• Injúria física do tecido por dessecação ou fixação inadequada.
• Autólise.
IMUNOISTOQUÍMICA – Problemas
• Pigmentos teciduais coloridos similares ao produto final da reação.
• Reação cruzada inespecífica do Ac quando o epítopo do Ag a ser corado 
é partilhado com outras proteínas.
• Ingestão do Ag por fagócitos, resultando em coloração não 
normalmente observada nessas células.
IMUNOISTOQUÍMICA – Problemas
A imunoistoquímica pode ser utilizada:
Em neoplasias
•Diferenciar uma proliferação celular maligna e benigna.
•Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente indiferenciadas.
•Subtipagem de neoplasia para seleção terapêutica.
•Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas (ex: 
hormônios).
•Caracterizar a origem de carcinomas.
•Identificar micrometástases.
•Avaliação prognóstica (ex: detecção de receptores hormonais em neoplasia 
mamária).
•Orientação terapêutica.
IMUNOISTOQUÍMICA – Aplicações
oA imunohistoquímica pode ser utilizada:
•Para detecção de antígenos:
–Virais: dengue, febre amarela, citomagalovírus, adenovírus, 
etc.
–Bacterianos: micobactérias, leptospiras.
–De Fungos: Paracoccidioides, Histoplasma, etc.
–De Protozoários: Toxoplasma, Trypanosoma cruzi, Leishmania
sp, Plamodium sp.
–De Helmintos: Schistosoma.
IMUNOISTOQUÍMICA – Aplicações
Imunohistoquímica anti-tirosina hidroxilase
em estrutura axonal
Imunohistoquímica anti- ERB2
Imunohistoquímica: detecção de múltiplos antígenos
Citometria de Fluxo
Citometria de Fluxo
• Citometria: Análise quantitativa de parâmetros
celulares (células, núcleos, cromossomas,
mitocôndrias, etc)
• Citometria de Fluxo: Análise multiparamétrica de
partículas (uma a uma) em suspensão.
Princípio:
● Fazer passar as partículas em suspensão, de uma forma 
alinhada, por um feixe de luz
● A interacção das partículas com o feixe gera sinais que são 
captados por detectores apropriados
● A informação produzida pode ser gerada:
- Pela dispersão do feixe de luz
- Pela luz emitida por fluorocromos após excitação pelo 
feixe de luz
O que é um Citômetro de Fluxo?
Requisitos Básicos num Citômetro de Fluxo
•Suspensão de partículas
•Fluxo laminar
•Fonte de iluminação•Câmara de Fluxo
•Filtração da dispersão de luz e 
fluorescência
•Captação da dispersão de luz e 
fluorescência
•Conversão dos sinais em valores
analógico-digitais
•Aquisição, Processamento, Análise e 
Armazenamento no computador
Fluídos
Óptica
Electrônica
Injecção da amostra no líquido de envolvimento (sheath
fluid), passando por um pequeno orifício central do fluxo
(50-300 µm)
As partículas fluem no centro, não se misturando com o
restante líquido de envolvimento
A injecção da amostra em fluxo laminar e a regulação
da pressão são conseguidas através:
- Pressão Diferencial
- Velocidade de Fluxo
- Fluxo Contínuo
Fluídos
Agulha de
injecção
Dispersão laser
Líquido de
envolvimento
Ponto de Hidrofocagem
Laser
Câmara de Fluxo
Óptica
● Fontes de iluminação:
–Lâmpadas de Mercúrio
–Lasers
• Emite num 
comprimento de onda
(ex: 488 nm- azul), 
monocromático.
• Produz um feixe de luz 
coerente
Fotosensor de Dispersão Frontal (FS)
● Capta a intensidade da dispersão frontal
● A intensidade da dispersão frontal é proporcional ao
tamanho e forma das partículas
• .
Sensor de FS
Laser
Fotosensor de Dispersão Lateral (SS)
● Capta a intensidade e luz dispersa a 90o
● A intensidade dessa dispersão é proporcional ao tamanho,
granularidade e forma das partículas
Laser
Sensor
de FS
Sensor SS 900
Dispersão da Fluorescência
● A fluorescência emitida é detectada por fotosensores
que recebem o comprimento de onda seleccionado
● A especificidade da detecção de cada sensor é
controlada pela selecção do comprimento de onda,
através de uma conjugação de filtros e de espelhos.
Laser
Sensor de FS
Detectores de Fluorescência
(PMT1, PMT4 etc.)
Tipos de fluorocromos
Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission)
Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm)
FITC 488 525
Cy3 488 565
R-PE (PE) 488 575
Pe-Cy5 (TC1) 488 667
PerCP (BD2) 488 675
PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695
Texas Red 595 615
APC 633, 635 660
Cy5 633, 635 667
PMT
PMT
PMT
PMT
Filtros
Dicróicos
Filtros
Bandpass
Laser
1
2
3
4
Câmara de
Fluxo
Fotosensores
Captação dos Parâmetros de Análise:
Electrônica
Processamento
electrônico do sinal
gerado nos sensores
que é traduzido num 
histograma ou
scatter plot
O que podemos avaliar 
com um citômetro de 
Fluxo?
Tamanho (FSC)
Complexidade (SSC)
Fluorescência relativa.
(FL1, FL2, FL3,
Metabolismos
Receptores
ADN Citoquinas
Enzimas
Antígenos
celularesTamanho
Complexidade
Aplicações
Imunologia
Hematologia
Anatomia patológica
Biologia celular
Oncologia
Aplicações diversas
• Detecção de apoptose
• Permeabilidade membranar
• Mudanças do conteúdo de DNA
• Estudos enzimáticos funcionais
• Resistência a fármacos
Imunologia - Aplicações práticas
Separação de células sanguíneas
Diferenciação de sub populações de linfócitos T
Diferenciação linfócitos B
Diferenciação de células NK
Quantificação antigênica
Variações linfoproliferativas (idade, imunodeficiências, 
neoplasias, transplantes, doenças autoimunes, inflamações)
Ensaios de Fagocitose
Aplicações clínicas: são múltiplas principalmente na 
detecção de antígenos “alvo” nas células sanguíneas
• Classificação de leucemias
• Detecção de HIV
• Marcadores tumorais
• Na previsão da evolução do curso de doença
• Detecção microbiológica : bactérias, fungos,parasitas e 
vírus
• Detecção e quantificação de ac.nucleicos virais e 
antigénios virais
• Teste de susceptibilidade a drogas
• Grupos celulares
Granulócitos
Monócitos
Linfócitos
• Separação de células sanguíneas
Diferenciação da subpopulação de linfócitos
Os linfócitos T, originados no Timo experimentam 
maturação que resulta de um processo de selecção 
positiva e negativa, durante o qual se formam as 
células CD4 e CD8. Os linfócitos B originados na 
medula óssea vão expressando sequencialmente 
antigénios específicos CD19+, CD10+ e CD20+, até 
se diferenciarem terminalmente
em Igs.
As células NK carecem de marcadores
das células T ou B, mas são constitutivamente
citotoxicas. Na sua diferenciação
associam-se a marcadores de funções
linfocitárias: CD16
FACS
Fluorescence-activated cell sorter
• Permite separar subpopulações de
linfócitos com base nas diferentes
proteínas expressas á superfície (B, TCD4,
TCD8)
• Cada tipo celular é marcado com um
anticorpo específico que se encontra
acoplado a um corante fluorescente.
• O citómetro de fluxo detecta e conta
individualmente as células que passam
através do laser
488 nm laser
+
Placas Carregadas
Tubos para Recolha do 
Produto Separado
Sensor Fs
Detectores de 
Fluorescências
-
Luminex / Multiplex
● Multiplex – surge da ideia de unir o Elisa a Citometria.
● Cara
● Muito Rápida, sensível, customizável
● Qualitativa e Quantitativa
LUMINEX
Imunologia
Detecção de expressão de citocinas em larga escala para 
diferenciação de doenças
Bioquímica e BioMol
Rastreamento de Doenças Metabólicas, Doenças 
Genéticas e Imunodeficiências Primárias
Usos