DETERGENTE ENZIMÁTICO COMO INTERFERENTE NA AÇÃO DO LUMINOL

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USO DE DETERGENTE ENZIMÁTICO COMO INTERFERENTE NA AÇÃO DO LUMINOL
1 INTRODUÇÃO
O luminol é uma substancia química conhecida que foi criada em 1928 por H. O. Albrecht, já a descoberta de sua função foi realizada pelo químico Walter Specht em 1937 (QUICKENDEN; CREAMER, 2001). É muito utilizado em cenas de criminalística, quando existe a necessidade de identificar se existem vestígios de sangue em roupas, objetos, locais, entre outros (NAGESH; GHOSH, 2017). De acordo com Klein et al. (2019) a ocultação das provas de um crime, acontece de modos variados, que vão de limpeza com detergentes enzimáticos até a queima das provas, dificultando as investigações.
Os serviços nas áreas de intervenção pericial, possuem a necessidade de incorporar todas as competências da prática médico-legal e forense. São elas a toxicologia e a genética forense, as autópsias, os exames de clínica forense e os diversos testes forenses. Vemos também que dependem de vários tipos de recursos, como as evidencias físicas (NAGESH; GHOSH, 2017). Nas cenas de crimes, contudo, geralmente são encontrados diversos fluidos corporais ou seja evidencias físicas. São eles: saliva, suor, urina, sêmen, fluido vaginal e sangue que é ele um dos mais importantes (BRENZINI; PATHAK, 2018).
O sangue é um tecido líquido formado por diferentes tipos de células que são suspensas no plasma, possui uma coloração vermelha, que acontece devido à presença dos eritrócitos em sua composição. De importância máxima para os seres humanos e alguns seres vivos, dentro do organismo, ele é o responsável pelo transporte de substancias e defesa do corpo a agentes nocivos (SILVA, 2012).
 As principais células do sangue são os glóbulos vermelhos, os mesmos possuem o citoplasma constituído principalmente por hemoglobina, ela formada por quatro subunidades e cada subunidade é composta por um grupo heme (LUEDEKE; MILLER; SPRAGUE, 2016). Cada heme é formada por um anel protoporfirínico contendo um átomo de ferro, contudo, são designados como cadeias alpha e beta, contendo duas de cada. A cadeia alpha é composta por 141 aminoácidos e a cadeia beta por 146 (CAVALCANTI; BARROS, 2016).
A identificação de sangue com o luminol tornou-se possível devido à presença de íons Ferro II (Fe2+) contido no grupo heme da hemoglobina, o qual age como um catalisador na reação do luminol. Consequentemente, a quimiluminescência é imediata, indicando a presença do ferro contido no sangue (CRUZ, 2016). 
Para Butler, Chaseling e Wright (2019) é de suma importância em uma investigação que o material presente na cena de um crime não seja modificado, como por exemplo o DNA presente no sangue. Em estudos recentes, observamos que o luminol por ser aplicado direto na mancha ou local que possua sangue, pois não modifica o DNA.
 O luminol é um composto orgânico em pó, cuja fórmula molecular é C8H7N3O2, isto é, ele é formado por átomos de carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio. O reagente químico é usado juntamente ao peróxido de hidrogênio (H2O2); conhecido como água oxigenada, alguns hidróxidos e também outros produtos químicos, originando uma solução líquida (SOUZA; FERREIRA, 2018).
Conforme Park e Tsunoda (2018) o luminol tem seu uso designado especialmente para a descoberta de sangue oculto. É um teste baseado em oxidação, sendo assim, quando em contato com a hemoglobina ocorre a formação de uma luz azul-branco, ou seja, reação de quimiluminescência.
REVISÃO 
 A reação quimiluminescente é dividida em três etapas, sendo estas: a formação de um composto de alta energia; a decomposição desse composto ou sua interação com outros reagentes, formando estados eletrônicos excitados e a diminuição desse estado excitado (BARTOLONI, 2011). 
Figura 1: Diferentes graus de luminescência. Fonte: HOFMANN, 2018.
Para que seja realizado o teste com o luminol, os criminalistas precisam adicionar a mistura no local que possa ter sangue. Se a hemoglobina e a mistura de luminol entram em contato, o ferro na hemoglobina acelera a reação entre o peróxido de hidrogênio e o luminol. Nesta reação de oxirredução, o luminol perde átomos de nitrogênio e hidrogênio e adquire átomos de oxigênio, resultando em um composto denominado 3-aminoftalato o que dará origem a emissão de luz (SOUZA; FERREIRA, 2018). 
Figura 2: Representa a ação quimiluminescente do luminol quando em contato com o sangue. Fonte: CAVALCANTI; BARROS, 2016.
A presença de sague, quando encontradas em cenas de crimes, objetos ou tecidos são variadas, como gotas, respingos, manchas, poças ou impressões. Podemos observar também que um fator de interferência na detecção do sangue são as maneiras de como são ocultas. A lavagem em maquinas é uma delas, diminuindo sua detectabilidade, mas felizmente o luminol ainda consegue identificá-las (HOFMANN, 2018).
Podemos observar, que em materiais escuros a visualização de manchas de sangue é mais difícil, pois a olho nu não detectamos a presença das mesmas. Sendo assim, vários testes são utilizados para ajudar na detecção do sangue e entre eles, o luminol se mostrou o mais o mais eficaz, ajudando também identificar padrões de manchas de sangue (BUTLER; CHASELING; WRIGHT, 2019).
É importante ressaltar que algumas substâncias, em relação a quimiluminescência do luminol sobre o sangue, podem alterar seu efeito, ou seja, interferir na reação da produção da cor azulada, como por exemplo alimentos e bebidas antioxidantes. Contudo podem ser utilizados para ocultação de provas essências ao crime, isto é, promovendo resultados falsos-negativos (CAVALCANTI; BARROS, 2016). Também vemos que a luminescência gerada pelo hipoclorito presente em alvejantes domésticos é emitida em comprimento de onda diferente da luminescência emitida na presença de hemoglobina, e apresenta características e tempo de duração desiguais da luminescência gerada por manchas de sangue (CREAMER et al., 2003).
Detergentes, segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2019), são substâncias usadas para a limpeza e conservação de superfícies inanimadas. São constituídos principalmente por surfactantes, substâncias orgânicas ou inorgânicas, as quais facilitam a operação de limpeza. Mas também, a eficiência da limpeza se deve a todos os demais componentes de um detergente, ou seja, aos conservantes, espessantes e até enzimas.
Os detergentes enzimáticos são produtos com alta eficácia de limpeza, assim sendo usados na limpeza doméstica e hospitalar. Seu uso é voltado a dissolução de fluidos biológicos como sangue, escarro, muco, pus e urina quando presentes em superfícies benéficas a adesão microbiana. Isso faz com que a sobrevivência e viabilidade dos microrganismos seja mudada (SOUZA, 2017).
As proteases são as principais enzimas hidrolíticas que estão presentes nos detergentes enzimáticos, porém amilases, celulases e lipases também são encontrados. As proteases têm como função clivagem proteolítica, ou seja, é um mecanismo envolvido principalmente na coagulação e digestão sanguínea. As amilases catalisam a hidrólise do amido, as celulases catalisam a clivagem de celulose e as lipases catalisam a clivagem de ligações ésteres de lipídeos (SOUZA, 2017).
Schmidt et al. (2007) sugere que a quantidade de material biológico pode interferir na ação do detergente enzimático. Para que a limpeza seja eficiente e não aparecem resíduos nos processos que estão relacionadas a fluorescência, também é necessário tempo adequado na lavagem das superfícies ou na imersão dos artigos na solução enzimática. Esse tempo vai variar de acordo com cada fabricante.
A aplicação da quimiluminescência na área criminalística atualmente tem ganhado grande popularidade, já que existe uma grande divulgação realizada pela mídia, tanto para meio jornalístico informativo, assim como em séries policiais televisivas que hoje possuem grande sucesso, onde é destacado a forma de se utilizar o reagente luminol, para que ocorra a comprovação da presença de sangue em locais de crime, e/ou supostas armas e objetos que podem ter sido utilizadas para cometê-los, assim como em roupas e pertences pessoaisde pessoas suspeitas, e entre outros vários itens relacionados ao fato delitivo, mesmo que os mesmo tenham sido limpos e lavados. 
Sendo assim, o objetivo deste estudo foi analisar se a aplicação de detergente enzimático em manchas de sangue influencia na quimiluminescência do luminol.
A visualização e localização de vestígios relacionados com a cena do crime é um grande desafio nas ciências forenses. Geralmente, manchas de sangue ocorrem com frequência nas cenas do crime e podem, em princípio, ser detectadas a olho nu. Infelizmente, a exposição à água ou reagentes de limpeza dilui o sangue até que ele não possa mais ser detectado a olho nu (KULSTEIN; WIEGAND, 2018).
O Luminol é usado há muito tempo para detectar vestígios de sangue latentes durante as investigações policiais devido suas características positivas, porque é fácil de usar e não oferece riscos à saúde, ao mesmo tempo que fornece evidências de vestígios para análise de DNA (EDLER et al., 2017). 
O Luminol reage com o sangue, mas também com várias outras substâncias. É de conhecimento que diferentes tipos de raízes, certos corantes, metais ou agentes de limpeza também reagem positivamente ao luminol. No entanto, a quimiluminescência resultante é caracteristicamente diferente daquela desencadeada pelo sangue. Enquanto o luminol pode ser aplicado em vestígios de sangue com a frequência necessária, a quimiluminescência dos tecidos com uma reação falso-positiva diminui de aplicação para aplicação e desaparece completamente no final (KLEIN et al., 2007).
A quimiluminescência do sangue se acumula lentamente, mas brilha por um período de vários minutos (KLEIN et al., 2007). A quimioluminescência tem muitos recursos vantajosos como uma ferramenta de detecção em análise instrumental, incluindo sensibilidade, seletividade e simplicidade (KLEIN et al., 2007).
O luminol reage com muitas substâncias (BARNI et al., 2007). Creamer et al. (2003), analisaram 250 substâncias (frutas, vegetais, cigarros, tintas, produtos de limpeza, higiene pessoal, superfícies automotivas, etc) e observaram que a grande maioria não produz quimiluminescência suficientemente intensa com o luminol. Das substâncias analisadas, algumas como o nabo, hipoclorito, cobre, lustra-móveis e tintas esmaltadas produzem uma quimiluminescência parecida com o luminol quando na presença da hemoglobina (CREAMER et al., 2003), entretanto, tem rápido aparecimento, brilho e duração (CASTELLÓ; FRANCÉS; VERDÚ, 2009).
No presente trabalho avaliou-se a eficiência de detergente enzimático em diferentes superfícies, além de diferentes tempos de aplicação (tabela 1), deve-se considerar a natureza do substrato onde a mancha de sangue se encontra. Os substratos podem ser divididos em dois grupos: materiais absorventes e não absorventes (MIRANDA et al., 2016).
Os materiais absorventes englobam substratos com superfícies porosas, como madeira, paredes e telhas que, devido a sulcos ou fissuras na superfície, são capazes de manter o sangue durante muito tempo, mesmo após lavagens (LAUX, 2005). Podem ser incluídos também substratos com maior capacidade de absorção tais como carpetes, roupas em couro, roupas em tecido e cobertores. Dentre os substratos não absorventes tem-se vinil, azulejo, vidro e metal, os quais apresentam dificuldades tanto na aplicação dos reagentes quanto na qualidade da quimiluminescência (LAUX, 2005; MIRANDA et al., 2016).
Apenas para o piso o detergente enzimático teve ação, isso se dá pelas características desta superfície. Superfícies lisas e não porosas são mais fáceis de limpar completamente, o que dificultaria essa limpeza é a presença de frestas, reboco ou rejunte que absorvem o sangue LAUX, 2005; MIRANDA et al., 2016). Mesmo após o longo intervalo de tempo testado de três meses, o detergente seguiu tendo ação.
Os detergentes enzimáticos contêm enzimas surfactantes e solubilizantes que, juntos, removem a matéria orgânica em curto período de tempo através da ação de decomposição do sangue e fluídos corpóreos aderidos. É muito utilizado na pré-limpeza e limpeza, como desincrustação e remoção de resíduos orgânicos em equipamentos, artigos e instrumentos médicos hospitalares, odontológicos e laboratoriais, no entanto, dependendo da rugosidade dessas superfícies onde é aplicado sua ação pode ser inviável ou incompleta (SCHMIDT; YONEKURA; GIL, 2008).
Outro ponto importante que determina a ação dos detergentes enzimáticos é o número de enzimas presentes ali. Existem milhares de enzimas diferentes e cada uma catalisa uma reação química específica (KNEEDLER; DARLING, 1990; SCHMIDT; YONEKURA; GIL, 2008). As enzimas, componentes dos detergentes enzimáticos, são classificadas dentro de quatro grupos maiores, como a amilase, lipase, protease e carboidrase, obtidas por meio de fontes, como plantas, animais e microorganismos e acrescidas de tenso ativo não iônico que potencializam a degradação e a remoção dos resíduos orgânicos de difícil remoção, como sangue, tecido, pus, fezes e muco (KNEEDLER; DARLING, 1990; TLUSTY, 1996; SCHMIDT; YONEKURA; GIL, 2008).
Ainda, alguns autores colocam que diferente dos detergentes comuns, as formulações enzimáticas apresentam a capacidade de catalisar reações por meio da ação das enzimas. Essas atuam de maneira seletiva sobre a matéria orgânica, degradam substratos específicos, aceleram e otimizam o processo (GRAZIANO, 2002, BRASIL, 2012).
O detergente não apresentou ação frente aos tecidos, nos diferentes tempos de aplicações testados. Isso pode ser explicado porque o sangue é inicialmente líquido quando entra em contato com os tecidos e seus componentes são estáveis. A superfície do tecido desencadeia a cascata de coagulação. O processo de coagulação fora do corpo humano geralmente leva de 3 a 7 minutos. Os componentes da proteína se interligam e se unem às fibras têxteis (KULSTEIN; WIEGAND, 2018). 
A eficiência do processo está relacionada também ao tempo adequado de contato da solução enzimática em determinadas superfícies (SCHMIDT; YONEKURA; GIL, 2008). Explorando ainda mais esta questão, este estudo confirma que a eficácia do detergente enzimático na remoção de manchas de sangue depende da temperatura do ciclo de aplicação, do tipo de detergente enzimático usado, tempo de secagem do sangue e exposição das manchas de sangue às condições ambientais (OLDFIELD et al., 2018), no presente estudo o tempo não foi uma variável que fez diferença na ação do detergente.
Observa-se que para as superfícies telha e madeira, assim como tecido que já foi citado anteriormente, a aplicação desse reagente pode ser feita em qualquer superfície, no entanto sua ação pode diferir. As superfícies horizontais e porosas permitem uma melhor análise do padrão das machas de sangue por manter as marcas definidas, o que não acontece nas superfícies verticais ou não porosas (JAMES; KISH; SUTTON, 2005).
Quando o sangue é limpo em um local de crime o tipo de superfície influência na análise, pois uma superfície porosa ou rugosa dificulta a limpeza, deixando sempre algum vestígio mesmo que não seja visível (JAMES; KISH; SUTTON, 2005; NILSSON, 2006). Como a limpeza costuma ser realizada rapidamente ficam pequenos indícios de sangue, possibilitando a identificação pelo Luminol. 
Por exemplo, um estudo foi realizado limpando um local com sangue utilizando hipoclorito de sódio e medindo a intensidade da quimiluminescência a cada etapa. O resultado mostrou que com as lavagens a intensidade decai, pois diminuiu a concentração de sangue chegando um momento em que estava tão baixa que não influenciava no resultado. Porém a quantidade de hipoclorito no local aumenta e como esse produto também gera a oxidação do Luminol, a intensidade da quimiluminescência tem um pequeno aumento (CHEYNE, 2011; CREAMER et al., 2005). 
Vale ressaltar que a reação do sangue com o Luminol gera uma quimiluminescência homogênea, com duração aproximada de 30 segundos, enquanto que a produzida com o hipoclorito é muito rápida (tipo um flash) e decai em poucos segundos. Esse interferente pode ser resolvido de duas formas:esperando o hipoclorito evaporar por aproximadamente 2 dias ou adicionando glicina em pH 12. Isso faz com que a intensidade da quimiluminescência decaia significantemente, pois a reação da glicina com o hipoclorito é rápida, inibindo dessa forma a reação com o Luminol (CHEYNE, 2011; KING; MISKELLY, 2005).
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Manchas de sangue nas cenas do crime estão entre os tipos de evidências mais importantes para os investigadores forenses, e o uso do luminol já é difundido na área forense, no entanto, muitos interferentes podem diminuir a eficiência do luminol. No nosso estudo vimos que a ação do detergente enzimático pode ser efetiva, no entanto, depende do tipo do material onde será aplicado, para piso foi efetivo, devido o tipo de material que era. Nas demais superfícies em estudo o detergente enzimático não teve ação.
 
REFERÊNCIA
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