2-Tese-Carlos-Eduardo-de-Souza

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
CARLOS EDUARDO CONCEIÇÃO DE SOUZA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SÍNTESE DE ÉSTERES DE IMPORTÂNCIA NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS 
UTILIZANDO O PREPARADO ENZIMÁTICO SÓLIDO DE Yarrowia lipolytica EM FARELO 
DE SOJA (Glycine max (L.) Merrill) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RIO DE JANEIRO 
2018
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
CARLOS EDUARDO CONCEIÇÃO DE SOUZA 
 
 
 
 
 
SÍNTESE DE ÉSTERES DE IMPORTÂNCIA NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS 
UTILIZANDO O PREPARADO ENZIMÁTICO SÓLIDO DE Yarrowia lipolytica EM 
FARELO DE SOJA (Glycine max (L.) Merrill) 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2018
 
 
 
Carlos Eduardo Conceição de Souza 
 
 
 
 
 
SÍNTESE DE ÉSTERES DE IMPORTÂNCIA NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS 
UTILIZANDO O PREPARADO ENZIMÁTICO SÓLIDO DE Yarrowia lipolytica EM 
FARELO DE SOJA (Glycine max (L.) Merrill) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2018 
 -
 de Alimentos (PPGCAL), Instituto 
de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, 
como parte dos requisitos 
 . 
 
Orientadora: Profª DSc Maria Alice Zarur Coelho 
Coorientador: Profº DSc Bernardo Dias Ribeiro 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Carlos Eduardo Conceição de Souza 
 
SÍNTESE DE ÉSTERES DE IMPORTÂNCIA NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS 
UTILIZANDO O PREPARADO ENZIMÁTICO SÓLIDO DE Yarrowia lipolytica EM 
FARELO DE SOJA (Glycine max (L.) Merrill) 
 
 
Tese de Doutorado apresentada - 
 - 
 . 
 
Aprovada em 25 de junho de 2018. 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2018 
 
 
 
DEDICATÓRIA 
 
Dedico esse trabalho aos meus pais pelo seu incansável apoio. Sou muito grato a vocês. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Em primeiro lugar gostaria de agradecer a Deus, por sempre nos dar a força necessária que 
precisamos para sempre seguir em frente e superar cada obstáculo encontrado ao longo dessa 
nossa grande trajetória. 
 
Agradeço aos meus pais Arinda e Ricardo, por sua presença diária na minha formação como 
pessoa. A cada dia que passa vemos que estamos aqui para evoluir e sem essa base que vocês 
proporcionam eu jamais conseguiria. 
 
Ao meu irmão Paulo, pelos momentos de amizade e companheirismo. Crescemos juntos e 
ainda temos muita coisa pela frente. Nessa jornada você foi o meu primeiro amigo. 
 
Aos meus avós por terem me mostrado o verdadeiro sentido de batalha e perseverança nessa 
vida. O sentido de família, humildade e carinho. Minha formação também se deve a cada 
momento que compartilhamos e que ainda compartilho com vocês. Em especial meu avô 
Norival que já não está mais entre nós. 
 
Aos meus tios e tias, primos e primas, por fazerem parte da minha vida, pelos momentos 
juntos e pela família que nós formamos. 
 
À minha namorada Gabriela, pois se tem alguém que presenciou essa fase de perto, com 
certeza foi você. Muito obrigado por me escutar, por compartilhar ideias e sentimentos. 
Obrigado por me fazer ouvir, por seus conselhos, ensinamentos e por seu imenso apoio ao 
longo de todos esses anos. Sua amizade é imensurável para mim. Só tenho a te agradecer por 
fazer parte da minha vida. 
 
À minha orientadora, Professora Maria Alice, que foi a primeira pessoa que tive contato ao 
ingressar na minha vida de pós-graduação. Sou muito grato por ter me acolhido no laboratório 
e ter me dado a oportunidade de fazer parte de um grupo de pesquisa tão bonito que hoje é o 
BIOSE. Obrigado pelos seus ensinamentos como professora, orientadora e por seu exemplo. 
 
Ao meu orientador, Professor Bernardo, que anteriormente já era um amigo BIOSE e se 
disponibilizou também a me orientar e topou esse grande desafio ao longo desses 4 anos de 
 
 
 
doutorado. Te agradeço muito não só pelas conversas descontraídas, como também por me 
dar um norte nos momentos de dificuldade e pelo seu exemplo como professor e pesquisador. 
 
Agradeço muito aos amigos do BIOSE! Felipe, Júlio, Marselle, Verônica, Nanda, Ari, Lili, 
Lu, Larissa, Mari, Rose, Pietro, Gabi, Etel, Nanci e muitos outros que ainda fazem ou já 
fizeram parte desse grupo. Tenho certeza que sem o ambiente fantástico criado no laboratório 
por vocês tudo seria mais difícil. Fico honrado de poder ter feito parte de um grupo composto 
por pessoas tão maravilhosas. 
 
Agradeço também aos amigos BIOSE do laboratório 123! Professora Priscila Amaral, que 
além de sua amizade, me deu a oportunidade de fazer parte de suas aulas práticas, a Rober por 
sua amizade e pelo seu grande senso de humor. Ao Deja, Jully, Fabi, Vanessa, Alanna, 
Professora Tatiana que ao longo desses anos também fizeram dessa trajetória e a todos os 
outros integrantes desse grande grupo que também estavam presentes. 
 
À Marcelle Alves Farias, minha orientadora da época do mestrado que me inseriu e me 
ensinou os primeiros passos na fermentação no estado sólido. 
 
Gostaria de agradecer a Jéssica, pelas primeiras conversas sobre as reações de esterificação. 
 
Ao Gabriel Loureiro, técnico da Shimadzu, por seu profissionalismo e atenção ao me 
esclarecer diversas dúvidas operacionais sobre cromatografia gasosa e espectrometria de 
massas. Agradeço também a Marselle, Nanda e Etel por terem me auxiliado na operação do 
cromatógrafo gasoso e espectrômetro de massas. 
 
Ao Laboratório de Microscopia Eletrônica de Varredura e Transmissão do Instituto Militar de 
Engenharia, em especial ao Flávio, por ter me auxiliado nas análises de microscopia 
eletrônica de varredura que foram realizadas para este trabalho. 
 
A todos os meus amigos, que fazem parte da minha vida. Uma das coisas mais preciosas é a 
amizade, e tenho certeza que nem o tempo e distância podem mudar isso. Os anos passam 
mas a amizade continua. Sou grato por ter vocês comigo. 
 
 
 
 
Agradeço também aos meus amigos de 4 patas. Acredito que todas as pessoas deveriam sentir 
o amor incondicional que esses seres possuem por nós. Toby, que esteve comigo ao longo de 
15 anos, e se foi no meio dessa minha trajetória. E aos novos integrantes da família, Malu e 
Bolt, que continuam a trazer alegria para casa. 
 
À cada pessoa que contribuiu de alguma maneira e não tenha sido citada. Uma grande jornada 
é composta por muitas pessoas e sou grato a todos vocês. 
 
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio 
financeiro ao longo desse período. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Somos apenas uma raça avançada de macacos num planeta pequeno de uma estrela comum. 
Mas nós conseguimos entender o Universo. Isso faz de nós algo muito especial”. 
 
Stephen Hawking 
 
 
 
RESUMO 
 
Souza, Carlos Eduardo Conceição de. Síntese de ésteres de importância na indústria de 
alimentos utilizando o preparado enzimático sólido de Yarrowia lipolytica em farelo de soja 
(Glycine max (L.) Merrill). Rio de Janeiro, 2018. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos) 
- Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018. 
 
O presente trabalho teve como objetivo desenvolver a produção de ésteres de interesse 
na indústria de alimentos por meio da sínteseenzimática desses compostos, 
consequentemente caracterizando-se como pouco danosa ao meio ambiente. Para esta 
proposta, um biocatalisador sólido denominado preparado enzimático sólido (PES) foi 
produzido por meio da fermentação no estado sólido (FES) pela levedura Yarrowia lipolytica 
utilizando o farelo de soja, um co-produto da indústria de óleo de soja. Além disso, o PES 
também foi submetido a uma caracterização bioquímica com o intuito de estudar a atividade 
da lipase e suas características em diferentes condições. O efeito de diferentes condições 
sobre a atividade de hidrólise deste biocatalisador foi avaliado na presença de íons metálicos, 
inibidores, solventes, detergentes, vários parâmetros como pH e temperatura e diferentes 
substratos. A estabilidade do armazenamento em diferentes temperaturas também foi 
estudada. O PES produzido em farelo de soja foi utilizado em reações de síntese visando a 
produção de ésteres de cadeia curta, média e longa. Os resultados mostraram que a melhor 
condição de fermentação para produzir o biocatalisador para a síntese de ésteres foi utilizando 
óleo de soja como indutor (3 % m/m), inóculo inicial de 2,1 mgbiomassaseca g
-1
farelodesojaseco, 
umidade de 55 % (v/m) e temperatura de 28 °C durante 14 h de fermentação. Elevadas 
conversões de aproximadamente 90 % do octanoato de etila, estearato de hexadecila e 
palmitato de octadecila foram obtidas na presença de solventes apolares em um curto período 
de tempo, que variou entre 4 e 6 h de reação, utilizando uma relação molar de substrato 1:1, a 
38 °C, empregando 10-15 % (m/v) de biocatalisador. Este estudo mostrou o alto potencial da 
lipase de Y. lipolytica para ser aplicada em diferentes reações de síntese de ésteres. Além 
disso, o processo desenvolvido poderia ser considerado uma alternativa atrativa e econômica 
de baixo custo para a obtenção de produtos de alto valor agregado. 
 
Palavras-chave: 1. Yarrowia lipolytica. 2. Lipase. 3. Fermentação no estado sólido. 4. Síntese 
enzimática. 5. Ésteres. 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Souza, Carlos Eduardo Conceição de. Synthesis of esters used in the food industry using a 
solid biocatalyst produced by Yarrowia lipolytica in soybean meal (Glycine max (L.) Merrill). 
Rio de Janeiro, 2018. Thesis (PhD in Food Science) – Institute of Chemistry, Federal 
University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018. 
 
The present work aimed an environmentally friendly production process of several 
esters utilized in the food industry by enzymatic synthesis. To reach this purpose a solid 
biocatalyst rich in lipase and produced by solid state-fermentation using Yarrowia lipolytica 
in soybean meal, a co-product from soybean oil industry, was obtained and used in all 
synthesis reactions. Furthermore, the solid biocatalyst was also submitted to a biochemical 
characterization aiming to study the lipase activity and other characteristics in different 
conditions. Effect of different conditions on hydrolysis activity of this biocatalyst was 
evaluated in the presence of metal ions, inhibitors, solvents, detergents, several pH and 
temperature parameters and different substrates. Storage stability in different temperatures 
was also studied. The solid biocatalyst produced in soybean meal was used in synthesis 
reactions aiming to produce short, medium and long chain esters. Results showed that the best 
fermentation condition to produce the biocatalyst applied in ester synthesis was using soybean 
oil (3 % w/w), inoculum of 2.1 mgdrybiomass g
-1
drysoybeanmeal and moisture content of 55 % (v/w) 
at 28 °C for 14 h. High conversions (nearly 90 %) of ethyl octanoate, cetyl stearate and stearyl 
palmitate were achieved in the presence of apolar solvents in a short period of time using 
substrate molar ratio of 1:1 at 38 °C with 10-15 % (w/v) of biocatalyst. This work showed the 
high potential of Y. lipolytica lipase to be used in different syntheses of esters, moreover it 
could be considered an attractive and economical alternative of a low-cost process to obtain 
high added value products. 
 
Key words: 1. Yarrowia lipolytica. 2. Lipase. 3. Solid state-fermentation. 4. Enzymatic 
synthesis. 5. Esters. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
DIAGRAMA CONCEITUAL DO TRABALHO 25 
ORGANOGRAMA DO DOCUMENTO DE TESE 26 
1 INTRODUÇÃO 27 
1.1 OBJETIVOS 29 
1.1.1 Geral 29 
1.1.2 Específicos 29 
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 30 
2.1 Ésteres de importância na indústria de alimentos 30 
2.1.1 Ésteres flavorizantes 30 
2.1.2 Ésteres cerosos 33 
2.1.3 Síntese de ésteres flavorizantes e cerosos por lipases 35 
2.2 Yarrowia lipolytica 37 
2.3 Lipases 42 
2.3.1 Estrutura das lipases 46 
2.3.2 Reações catalisadas por lipases 50 
2.3.3 Produção de lipases por Yarrowia lipolytica 55 
2.4 Fermentação no estado sólido 57 
2.5 Soja 65 
3 MATERIAIS E MÉTODOS 69 
3.1 Materiais 69 
 
 
 
3.2 Equipamentos 71 
3.3 Produção de lipases por Y. lipolytica em FES 72 
3.3.1 Micro-organismo 72 
3.3.2 Meio de manutenção 72 
3.3.3 Cultivo celular 72 
3.3.4 Fermentação no estado sólido 73 
3.3.5 Obtenção do preparado enzimático sólido (PES) 74 
3.3.6. Obtenção do extrato bruto de lipase 74 
3.3.7 Quantificação da atividade lipolítica 74 
3.4 Caracterização bioquímica do PES 75 
3.4.1 Efeito de íons metálicos e inibidores sobre a atividade lipolítica do 
PES 
75 
3.4.2 Efeito de diferentes solventes sobre a atividade lipolítica do PES 76 
3.4.3 Efeito de detergentes sobre a atividade lipolítica do PES 76 
3.4.4 Quantificação da atividade lipolítica do PES utilizando diferentes 
óleos vegetais, gordura animal e vegetal 
76 
3.4.5 Quantificação da atividade lipolítica do PES e do extrato bruto de 
lipase utilizando diferentes substratos sintéticos 
77 
3.4.6 Estabilidade térmica do PES em tampão fosfato de potássio e etanol 
em diferentes temperaturas 
77 
3.4.7 Estabilidade a estocagem do PES e do extrato bruto de lipase 77 
3.4.8 Efeito do pH e da temperatura sobre a atividade lipolítica do PES 78 
 
 
 
 
3.4.9 Verificação da atividade lipolítica remanescente do PES após 
obtenção do extrato bruto de lipase 
78 
3.4.10 Eletroforese nativa (Native-PAGE) e Zimograma 78 
3.4.11 Quantificação de proteínas totais do extrato bruto de lipase 79 
3.4.12 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) 79 
3.4.13 Otimização da produção do PES para obtenção de melhor 
atividade catalítica 
80 
3.5 Síntese de ésteres flavorizantes e cerosos 83 
3.5.1 Análise da conversão da reação de esterificação por volumetria de 
neutralização 
84 
3.5.2 Análise da conversão da reação de esterificação por cromatografia 
gasosa e identificação dos produtos da reação por espectrometria 
de massas 
84 
3.5.3 Reuso do biocatalisador em diferentes reações de síntese 87 
3.5.4 Reações de esterificação na ausência de solventes orgânicos 87 
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 88 
4.1 Caracterização bioquímica do PES de Y. lipolytica produzido por 
FES 
88 
4.1.1 Efeito de íons metálicos e inibidores sobre a atividade lipolítica do 
PES 
89 
4.1.2 Efeito de diferentes solventes sobre a atividade lipolítica do PES 93 
4.1.3 Efeito de detergentes sobre a atividade lipolítica do PES 98 
4.1.4 Atividade lipolítica do PES utilizando diferentes substratos de 
origem vegetal, animal e sintéticos 
102 
 
 
 
 
4.1.5 Estabilidade térmica do PES em tampão fosfato de potássio e etanol 
em diferentes temperaturas 
108 
4.1.6 Estabilidade a estocagem do PES e do extrato bruto de lipase 112 
4.1.7 Efeito do pH e da temperatura sobre a atividade lipolítica do PES 114 
4.1.8 Atividade remanescente do PES após o processo de obtenção do 
extrato bruto de lipases 
118 
4.2 Síntese de ésteres flavorizantes e cerosos 119 
4.2.1 Etapa preliminar de desenvolvimento das reações de esterificação 119 
4.2.1.1 Ésteres cerosos 119 
4.2.1.2 Ésteres flavorizantes 122 
4.2.2 Avaliação dos diferentes tipos de PES produzidos paraotimizar a 
síntese de ésteres 
125 
4.2.3 Avaliação da produção do octanoato de etila utilizando o PES 
produzido nas novas condições de fermentação 
130 
4.2.4 Identificação e confirmação da produção dos ésteres por 
espectrometria de massas 
133 
4.2.5 Perfil de lipases produzidas por FES utilizando o farelo de soja 134 
4.2.6 Microscopia eletrônica de varredura do PES e da soja não 
fermentada 
136 
4.2.7 Reuso do biocatalisador em diferentes reações de síntese 137 
4.2.8 Reações de esterificação na ausência de solventes orgânicos 140 
5 CONCLUSÃO 143 
6 PERSPECTIVAS 145 
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 148 
 
 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1 Estruturas dos ésteres: A. Palmitato de octadecila. B. Estearato de 
hexadecila 
34 
Figura 2 Dimorfismo celular da levedura Yarrowia lipolytica IMUFRJ 
50682. A. Células leveduriformes crescidas em meio líquido (YPD) 
(imagem obtida com lente objetiva em ampliação de 400x). 
B. Células alongadas e em forma de hifas após crescimento em meio 
sólido (YPD) (imagem obtida com lente objetiva de imersão em 
óleo em ampliação de 1000x). Fonte: Acervo BIOSE 
38 
Figura 3 Ilustração da reação de hidrólise de triglicerídeos pela lipase 43 
Figura 4 Estrutura convencional das α/β hidrolases (Fonte: KAVITHA, 2016) 46 
Figura 5 Esquema representativo da Lip2 de Y. lipolytica em imagem 
tridimensional. A e B apresentam em representações distintas o sítio 
catalítico na cor amarela e a “ ” na cor vermelha. C demonstra 
uma visão mais detalhada da área do sítio ativo e “ ” da lipase 
(Fonte: JIANG et al., 2014) 
48 
Figura 6 Esquema geral de reações catalisadas por lipases (Adaptado de 
SHARMA e KANWAR, 2014) 
51 
Figura 7 Mecanismo de ação Ping Pong Bi Bi (A) e complexo ternário 
randômico (B) e ordenado (C) em reações catalisadas por lipase. 
E= enzima, E´= enzima covalentemente modificada, dA= doador 
acila, aA= aceptor acila, P1= produto 1 (água), P2= produto 2 (éster) 
53 
Figura 8 Modelo ilustrativo da FES realizada por fungo (A) e a descrição 
detalhada de suas características e eventos (B e C) (Adaptado de 
MITCHELL, KRIGER e BEROVIC, 2006 e BARRIOS-
GONZÁLEZ, 2012) 
62 
 
 
 
 
 
Figura 9 
 
Produção de soja no Brasil com destaque dos principais municípios 
produtores. (Fonte: IBGE, Diretoria de Pesquisas, Coordenação de 
Agropecuária, Produção Agrícola Municipal 2015. Retirado de: 
www.agenciadenoticias.ibge.gov.br) 
 
67 
 
Figura 10 Destinos e usos da soja brasileira. (Adaptado de Aprosoja Brasil. 
Retirado de: www.aprosojabrasil.com.br) 
68 
Figura 11 Curva-padrão para determinação da concentração de proteínas pelo 
método de Bradford 
79 
Figura 12 Esquema de produção do PES no ensaio 1 81 
Figura 13 Esquema de produção do PES no ensaio 4 82 
Figura 14 Esquema de produção do PES nos ensaios 6 e 7 83 
Figura 15 Curva analítica para determinação das concentrações do ácido 
octanóico por análise cromatográfica 
85 
Figura 16 Curva analítica para determinação das concentrações do álcool 
cetílico (A) e álcool estearílico (B) por análise cromatográfica 
86 
Figura 17 Farelo de soja antes da FES (A) e o PES produzido pela Y. lipolytica 
obtido após o processo fermentativo (B), e suas respectivas imagens 
ampliadas (aumento de 45x) 
89 
Figura 18 Atividade lipolítica do PES de Y. lipolytica em farelo de soja na 
presença de diferentes sais metálicos em diferentes concentrações. A 
atividade relativa de 100 % do PES equivale a 49,8 ± 3,6 U/g 
90 
Figura 19 Atividade lipolítica do PES de Y. lipolytica em farelo de soja na 
presença de diferentes inibidores enzimáticos em diferentes 
concentrações. A atividade relativa de 100 % do PES equivale a 
49,8 ± 3,6 U/g 
91 
 
 
 
Figura 20 Atividade lipolítica do PES de Y. lipolytica em farelo de soja na 
presença de diferentes solventes (9 % - v/v). A atividade relativa de 
100 % do PES equivale a 49,8 ± 3,6 U/g 
94 
Figura 21 Atividade lipolítica do PES de Y. lipolytica em farelo de soja na 
presença de diferentes solventes (30 % - v/v). A atividade relativa de 
100 % do PES equivale a 49,8 ± 3,6 U/g 
98 
Figura 22 Atividade lipolítica do PES de Y. lipolytica em farelo de soja em 
meio reacional com diferentes detergentes em diferentes 
concentrações (v/v). A atividade relativa de 100 % do PES equivale 
a 49,8 ± 3,6 U/g 
99 
Figura 23 Atividade lipolítica relativa (%) do extrato líquido bruto de lipase 
(A) e do PES (B) utilizando diferentes tipos de triglicerídeos 
sintéticos: Tributirina (C4:0), tricaproína (C6:0) tricaprilina (C8:0), 
tricaprina (C10:0), tripalmitina (C16:0) e triestearina (C18:0) 
trioleína (18:1). Óleo de oliva foi utilizado como controle. A 
atividade relativa de 100 % para o extrato bruto de lipase equivale a 
111,5 ± 5,8 U/g e para o PES equivale a 50,2 ± 1,1 U/g 
103 
Figura 24 Atividade lipolítica relativa (%) do PES de Y. lipolytica em farelo de 
soja utilizando diferentes tipos de óleos vegetais e gordura animal e 
vegetal. O óleo de oliva foi utilizado como controle. A atividade 
relativa de 100 % do PES equivale a 50,2 ± 1,1 U/g 
107 
Figura 25 Estabilidade térmica do PES de Y. lipolytica em farelo de soja em 
diferentes temperaturas (A. 37 ºC, B. 50 ºC e C. 70 ºC). A atividade 
relativa de 100 % para o PES tratado com tampão fosfato (100 mM) 
no tempo 0 h equivale a 58,1 ± 1,1 U/g e para o PES tratado com 
etanol nesse mesmo ponto equivale a 39,5 ± 0,4 U/g 
109 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 26 Perfil da atividade lipolítica do extrato bruto de lipase (A) e PES (B) 
produzido por Y. lipolytica ao longo de 300 dias de estocagem em 
diferentes temperaturas. A atividade relativa de 100 % para o extrato 
bruto de lipase equivale a 106,2 ± 3,1 U/g e para o PES equivale a a 
55,5 ± 3,7 U/g 
113 
 
 
 
Figura 27 Atividade lipolítica do PES livre de tampão (A) e do preparado com 
tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,5 (B) em diferentes 
condições de pH e temperatura 
115 
Figura 28 Verificação da atividade lipolítica remanescente no PES obtido após 
processo de obtenção do extrato bruto de lipase utilizando tampão 
fosfato de potássio 50 mM 
118 
Figura 29 Cursos temporais de síntese dos ésteres cerosos palmitato de 
octadecila (cinza escuro) e estearato de hexadecila (cinza claro) em 
diferentes tipos de solventes utilizando o PES de Y. lipolytica em 
farelo de soja. Hexano (A), heptano (B) e terc-butanol (C). As 
reações foram realizadas utilizando razão molar de substratos 1:1, 
10 % (m/v) de PES e temperatura de 38 ºC 
120 
Figura 30 Síntese de diferentes ésteres flavorizantes em 8 h de reação 
utilizando o PES de Y. lipolytica em farelo de soja. As reações 
foram realizadas utilizando razão molar de substratos 1:1, 15 % 
(m/v) de PES e temperatura de 38 ºC por um período de 8 h 
123 
Figura 31 Curso temporal de síntese do octanoato de etila e decanoato de etila 
durante 24 h de reação. As reações foram realizadas utilizando razão 
molar de substratos 1:1, 15 % (m/v) de PES e temperatura de 38 ºC 
124 
Figura 32 Atividade lipolítica relativa (%) dos diferentes tipos de PES obtidos 
utilizando o farelo de soja em diferentes condições de fermentação e 
preparo 
126 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 33 Curso temporal da síntese do octanoato de etila com diferentes 
concentrações de substratos (A. 500 mM, razão molar 1:1 e B. 1000 
mM, razão molar 1:1). As reações foram realizadas utilizando razão 
molar de substratos 1:1, 15 % (m/v) de PES e temperatura de 38 ºC. 
O PES utilizado foi obtido nas seguintes condições: 14 h de 
fermentação, 3 % (m/m) de óleo de soja, concentração de inóculo de 
2,1 mgbiomassaseca g
-1
fareldesoja e 55 % (v/m) de umidade a 28 °C 
130 
Figura 34 Espectros de massas dos produtos das reações de esterificação 
utilizando ácido octanóico e etanol: octanoato de etila (A1), ácido 
palmítico e álcool estearílico: palmitato de octadecila (B1) eácido 
esteárico e álcool cetílico: estearato de hexadecila (C1). Espectros 
de massas referência obtidos na base de dados do NIST dos ésteres 
octanoato de etila (A2), palmitato de octadecila (B2) e estearato de 
hexadecila (C2). m/z= relação massa/carga 
133 
Figura 35 Pico cromatográfico do octanoato de etila (A), palmitato de 
octadecila (B) e estearato de hexadecila (C) 
134 
Figura 36 Gel de zimograma (cinza) utilizando acetato de α-naftila como 
substrato para esterases e lipases produzidas pela Y. lipolytica em 
FES utilizando o farelo de soja. O gel (azul) sofreu coloração por 
comassie blue após análise do zimograma. Faixa 1: extrato bruto de 
lipases produzidos conforme as condições controle de fermentação. 
Faixa 2: marcadores de massa molecular (kDa). Faixa 3: Extrato 
bruto obtido da soja não fermentada. Faixa 4: marcadores de 
tamanho molecular (kDa). Faixa 5: Extrato bruto de lipases 
produzidos de acordo com as condições de fermentação 
apresentadas no ensaio 2 (Tabela 10). Setas pretas indicam as 
bandas de hidrólise do substrato 
135 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 37 Microscopia eletrônica de varredura do farelo de soja fermentado 
por Y.lipolytica e do não fermentado. A. Detalhes do crescimento da 
levedura nas condições controle de fermentação (Tabela 10). 
B. Detalhe da superfície do farelo de soja não fermentado. 
C. Detalhes do crescimento da levedura nas condições de 
fermentação descritas para o ensaio 2 (Tabela 10). D. Detalhes dos 
filamentos de Y. lipolytica em enquadramento mais aproximado 
137 
Figura 38 Verificação da estabilidade do PES após sua reutilização em 
diferentes bateladas de reação para produção do octanoato de etila 
(quadrados) e do estearato de hexadecila (diamantes). Condições 
reacionais: Octanoato de etila (razão molar de substratos 1:1, 15 % 
de PES (m/v), 38 ºC, 4 h de reação). Estearato de hexadecila (razão 
molar de substratos 1:1, 10 % de PES (m/v), 38 ºC, 6 h de reação). 
O PES utilizado foi obtido nas seguintes condições: 14 h de 
fermentação, 3 % (m/m) de óleo de soja, concentração de inóculo de 
2,1 mgbiomassaseca g
-1
fareldesojaseco e 55 % (v/m) de umidade a 28 °C 
138 
Figura 39 Avaliação da síntese de ésteres em meio livre de solventes orgânicos 
(barras cinza claro) e na presença de hexano (barras cinza escuro). 
Condições reacionais em meio livre de solventes: Octanoato de etila 
(razão molar de substratos 1:1, 15 % de PES (m/v), 38 ºC, 4 h de 
reação). Estearato de hexadecila e palmitato de octadecila etila 
(razão molar de substratos 1:1, 10 % de PES (m/v), 55 ºC, 6 h de 
reação). Condições reacionais na presença de hexano: Octanoato de 
etila (razão molar de substratos 1:1, 15 % de PES (m/v), 38 ºC, 4 h 
de reação). Estearato de hexadecila e palmitato de octadecila etila 
(razão molar de substratos 1:1, 10 % de PES (m/v), 38 ºC, 6 h de 
reação). O PES utilizado foi obtido nas seguintes condições: 14 h de 
fermentação, 3 % (m/m) de óleo de soja, concentração de inóculo de 
2,1 mgbiomassaseca g
-1 
fareldesojaseco e 55 % (v/m) de umidade a 28 °C 
141 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE DE TABELAS 
 
Tabela 1 Ésteres flavorizantes e aromáticos obtidos por meio da síntese 
enzimática empregando lipase microbiana como biocatalisador. 
(Adaptado de VAN LAERE et al., 2008; SÁ et al., 2017; DIAS, DOS 
SANTOS e MARTÍNEZ, 2018) 
31 
Tabela 2 Algumas lipases comerciais, suas aplicações industriais e fabricantes 
(Adaptado de SINGH e MUKHOPADHYAY, 2012) 
44 
Tabela 3 Compostos, metabólitos e agentes de interesse obtidos por meio da 
fermentação no estado sólido (Adaptado de Lizardi-Jiménez e 
Hernández-Martínez, 2017) 
59 
Tabela 4 Micro-organismos produtores de lipase e seus respectivos meios de 
produção e pico de atividade em FES 
64 
Tabela 5 Perfil de ácidos graxos encontrados no óleo de soja (adaptado de: 
David Firestone, 2013) 
66 
Tabela 6 Reagentes e materiais utilizados para confecção dos meios de cultura 
para o crescimento da levedura Y. lipolytica 
70 
Tabela 7 Principais reagentes utilizados no desenvolvimento do trabalho e seus 
respectivos fabricantes 
70 
Tabela 8 Lista de equipamentos utilizados no desenvolmento do trabalho 71 
Tabela 9 Composição química do farelo de soja realizada pelo laboratório de 
controle bromatológico - LABCBROM/UFRJ 
73 
Tabela 10 Condições de fermentação de cada ensaio e outras características de 
produção do preparado enzimático sólido 
80 
Tabela 11 Coeficiente de partição (Log P) para os solventes utilizados na 
avaliação da atividade lipolítica do PES (Adaptado de LAANE et al., 
1987) 
95 
 
 
 
Tabela 12 Concentração dos detergentes avaliados e seus respectivos valores de 
CMC 
100 
Tabela 13 
 
Reações de esterificação para síntese do estearato de hexadecila 
utilizando o preparado enzimático sólido produzido em diferentes 
condições de fermentação e preparo 
127 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIAÇÕES 
 
% - Porcentagem 
µL - Microlitro 
µmol - Micromol 
A.C. - Antes de Cristo 
AMPc - Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico 
AMPK - Proteína quinase dependente de AMP 
atm - Atmosfera 
Aw - Atividade de água 
BIOSE - Biological System Engineering Group 
BSA- Bovine Serum Albumine 
Canola - Canadian Oil Low Acid 
CFR - Code of Federal regulations 
CMC - Concentração Micelar Crítica 
Conab - Companhia Nacional de Abastecimento 
DMF - Dimetilformamida 
DTT - Ditiotreitol 
EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid 
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária 
FAO - Food and Agriculture Organization 
FDA - Fibra em Detergente Ácido 
FDA - Food and Drug Administration 
FDN - Fibra em Detergente Neutro 
FES - Fermentação no Estado Sólido 
FS - Fermentação Submersa 
GRAS - Generally Regarded As Safe 
 
 
 
IMUFRJ – Instituto de Microbiologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro 
kDa - Quilodalton 
L - Litro 
m - Massa 
min - Minuto 
NIST - National Institute of Standards and Technology 
PDB - Protein data bank 
PES - Preparado enzimático sólido 
PFC - Perfluorocarboneto 
pH – Potencial hidrogeniônico 
PMSF - Phenylmethylsulfonyl fluoride 
RPM - Rotações por minuto/ rotations per minute 
T - Temperature 
U - Unidade de atividade enzimática 
UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro 
USDA - United State Department of Agriculture 
v - Volume 
YPD - Extrato de levedura, peptona e dextrose (Yeast, Peptone, Dextrose) 
β-met - β-mercaptoethanol 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DIAGRAMA CONCEITUAL DO TRABALHO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SÍNTESE DE ÉSTERES DE IMPORTÂNCIA NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS 
UTILIZANDO O PREPARADO ENZIMÁTICO SÓLIDO DE Yarrowia lipolytica EM 
FARELO DE SOJA (Glycine max (L.) Merrill) 
 
Por quê? 
 Importância da obtenção de ésteres de alto valor agregado utilizados na indústria de 
alimentos a partir de um biocatalisador produzido por um processo pouco oneroso 
empregando Y. lipolytica. 
 Desenvolver um processo de síntese de ésteres que gere menos impacto ao meio 
ambiente por fazer uso de um biocatalisador orgânico, sendo, portanto, uma alternativa a 
métodos convencionais que empregam catalisadores químicos nocivos. 
 
 
Quem já fez? 
 Muitos estudos reportam a síntese de ésteres flavorizantes e cerosos utilizando lipases 
comerciais e imobilizadas. A aplicação de um biocatalisador sólido produzido por FES já 
foi reportada na literatura para a síntese de biodiesel, mas o presente trabalho é o 
primeiro a empregar um biocatalisador desse tipo para a síntese de ésteres de importância 
na indústria de alimentos utilizando Y. lipolytica. 
Hipótese? 
 Uma vez que a levedura Y. lipolytica é uma grande produtora de lipases, seria este micro-
organismocapaz de produzir por FES um biocatalisador que pode ser empregado tanto 
em reações de hidrólise como em reações de síntese de diferentes tipos de ésteres de 
interesse industrial? 
 
Como fazer? 
 Desenvolver o processo de produção de um biocatalisador rico em lipases de Y. 
lipolytica a partir do farelo de soja por FES. 
 Realizar a caracterização bioquímica do biocatalisador com o objetivo de conhecer suas 
limitações operacionais e propriedades catalíticas. 
 Avaliar o uso de solventes orgânicos que favoreçam o processo reacional para obtenção 
dos ésteres estudados. 
 Avaliar a influência dos substratos precursores (ácidos e álcoois) dos ésteres de interesse 
e da concentração utilizada sobre a atividade do biocatalisador. 
 Realizar a produção de diferentes tipos de biocatalisador a partir da FES utilizando Y. 
lipolytica com o objetivo reduzir os tempos de reação mantendo altos níveis de 
conversão. 
 Estudar a atividade do biocatalisador quando reutilizado nas reações de síntese e quando 
empregado em reações na ausência de solventes orgânicos. 
 
 
 
 
ORGANOGRAMA DO DOCUMENTO DE TESE 
 
 1. Introdução e 
Objetivos 
2. Revisão 
bibliográfica 
3. Materiais e 
métodos 
4. Resultados 
5. Conclusões 
6. Perspectivas 
7. Referências 
bibliográficas 
Organização dos resultados 
Caracterização bioquímica do biocatalisador 
- Na presença de sais metálicos e inibidores 
enzimáticos, solventes orgânicos, detergentes, 
diferentes tipos de substratos sintéticos e óleos 
vegetais e em diferentes condições de pH e 
temperatura 
- Avaliação da estabilidade térmica e da estabilidade a 
estocagem 
- Verificação da atividade remanescente após o 
processo de obtenção do extrato bruto de lipases 
 
 
 
 
Síntese de ésteres 
- Síntese dos ésteres cerosos palmitato de 
octadecila e estearato de hexadecila e escolha 
do melhor solvente orgânico para as reações 
de síntese 
- Avaliação da produção de diferentes ésteres 
flavorizantes 
 
 
 
Otimização da produção do PES para 
obtenção de um biocatalisador com maior 
atividade hidrolítica e sintética 
Caracterização bioquímica do biocatalisador 
- Avaliação do perfil de lipases produzidas por FES 
por meio do zimograma 
- Avaliação do crescimento da Y. lipolytica no farelo 
de soja empregando a microscopia eletrônica de 
varredura 
 
Síntese de ésteres com o PES otimizado 
- Avaliação da produção do octanoato de etila, 
palmitato de octadecila e estearato de hexadecila 
- Reuso do biocatalisador em reações de esterificação 
- Avaliação das reações de esterificação na ausência 
de solventes orgânicos 
 
 
27 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Ésteres são moléculas de amplo uso na indústria, podendo abranger a área de 
combustíveis (biodiesel), emulsificantes, aditivos, alimentos e bebidas, lubrificantes e 
plastificantes, por exemplo. Estes compostos podem ser obtidos por meio da síntese química, 
enzimática ou pela extração direta de matrizes vegetais. No entanto, a obtenção pela via 
química é menos seletiva, despende maior quantidade de energia e é mais poluidora devido 
aos catalisadores utilizados. Consequentemente não possuem rótulo eco-friendly, status cada 
vez mais necessário para um produto ser competitivo no mercado. A reação mais simples para 
obtenção dessas moléculas ocorre na presença de um álcool e um ácido (doador de grupo 
acila) por meio de um catalisador reacional com consequente liberação de água, na presença 
ou ausência de solventes, e além da reação de esterificação clássica, também pode ser obtido 
por meio de reações de transesterificação (KHAN e RATHOD, 2015; SÁ et al., 2017; DIAS, 
DOS SANTOS e MARTÍNEZ, 2018). 
Na indústria de alimentos, os ésteres flavorizantes são amplamente utilizados na 
formulação de diversos produtos. Geralmente caracterizam-se por serem formados por álcoois 
ou ácidos de cadeia curta ou média. Para um flavour ser considerado natural, o composto 
precisa atender a requisitos pré-estabelecidos pelas legislações Norte Americana (FDA - Food 
and Drug Administration) e Européia, e essa substância deve ser obtida somente por 
processos físicos, como por exemplo, a extração a partir de fontes naturais ou ser obtida por 
meio do uso de micro-organismos ou enzimas que catalisem a reação de síntese utilizando 
precursores isolados da natureza (LOZANO, BERNAL e NAVARRO, 2012). Uma outra 
classe de ésteres são os cerosos, compostos definidos como lipídios neutros, formados por 
álcoois e ácidos com doze ou mais átomos na cadeia de carbono. Levando em conta os ésteres 
cerosos que podem ser utilizados na indústria de alimentos, existe também uma série de 
restrições de acordo com FDA. A agência americana pontua no código de regulações federais, 
capítulo 21 (21 CFR 178.3450) que os ésteres estearato de hexadecila, palmitato de octadecila 
e suas misturas são considerados seguros para serem empregados em materiais de embalagem 
de alimentos quando utilizados como plastificantes ou adjuvantes de lubrificantes (FDA, 
www.ecfr.gov). Logo, a produção de um biocatalisador enzimático capaz de realizar essas 
reações de síntese torna-se de grande interesse, uma vez que este não dependeria de 
sazonalidade para ser produzido, não seria nocivo ao meio ambiente como os catalisadores 
químicos e o produto formado pela síntese poderia ser considerado como natural. 
 
28 
 
Lipases (triacilglicerol esteracilhidrolases E.C.3.1.1.3), principalmente as de origem 
microbiana, são biocatalisadores bastante estudados na biotecnologia e utilizados em diversas 
aplicações industriais. Essas enzimas catalisam a hidrólise de ligações éster de tri- di- e 
monoglicerídeos de ácidos graxos de cadeias longas, gerando ácidos graxos e glicerol. No 
entanto, quando presentes em um ambiente com baixa quantidade de água, como por 
exemplo, em solventes orgânicos, são capazes de realizar reações de síntese como a 
esterificação e transesterificação, uma vez que o equilíbrio termodinâmico é deslocado para 
esse tipo de catálise. Além disso, são biocatalisadores que podem gerar um alto rendimento da 
reação, operam em condições reacionais brandas, demandam pouca energia e possuem alta 
regio- e estereosseletivadade. A produção de diversos ésteres flavorizantes e cerosos por 
lipases em meios não-aquosos por esterificação ou transesterificação vem sendo reportada na 
literatura científica (ABBAS e COMEAU, 2003; DHAKE, THAKARE e BHANAGE, 2013; 
TODERO et al., 2015; TRIVED et al., 2015). 
O trabalho, portanto, propôs o uso de um sistema de produção de lipases a partir da 
fermentação no estado sólido (FES) utilizando o farelo de soja e a levedura Yarrowia 
lipolytica, que possui status GRAS (Generally recognized as safe). O biocatalisador 
enzimático rico em lipases produzido e denominado como preparado enzimático sólido (PES) 
foi caracterizado bioquimicamente e empregado na síntese de ésteres flavorizantes, assim 
como na produção de ésteres cerosos. Possibilitando, dessa maneira, realizar dois processos 
de baixo custo operacional e reduzido impacto ambiental para produzir diferentes produtos de 
alto valor agregado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
1.1 OBJETIVOS 
1.1.1 Geral 
Desenvolver um processo de síntese de ésteres de interesse na indústria de alimentos a 
partir da lipase de Y. lipolytica produzida por FES utilizando o farelo de soja como matéria-
prima. 
1.1.2 Específicos 
- Produzir lipases de Y. lipolytica (preparado enzimático sólido e extrato líquido bruto) por 
FES em farelo de soja suplementado com óleo de soja. 
- Caracterizar o biocatalisador rico em lipases produzido por Y. lipolytica na FES quanto a sua 
especificidade a diferentes tipos de substratos, a estabilidade térmica em diferentes 
temperaturas, ao efeito de diferentes aditivos na sua atividade hidrolítica, a estabilidade à 
estocagem, ao perfil de atividade lipolítica em diferentes condições de pH e temperatura eavaliar a massa molecular das lipases/esterases produzidas por meio do zimograma. 
- Avaliar a síntese de diferentes ésteres flavorizantes e cerosos de interesse da indústria de 
alimentos a partir de um biocatalisador rico em lipases de Y. lipolytica produzido por FES. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 
2.1 Ésteres de importância na indústria de alimentos 
 
2.1.1 Ésteres flavorizantes 
O avanço da tecnologia de alimentos tem como consequência uma ampla gama de 
novos produtos alimentícios sendo desenvolvidos e comercializados constantemente, uma vez 
que o consumidor tem cada vez mais optado por produtos de fácil consumo e com 
propriedades e sabores agradáveis. Em processos que tais características não podem ser 
obtidas de maneira direta, é possível alcançá-las induzindo ou suplementando produtos com 
compostos aromáticos e flavorizantes específicos. Essa alta demanda exige por parte desse 
setor uma atualização constante de seus processos e a busca por matérias-primas de qualidade 
com valor competitivo no mercado, e um dos compostos que se destacam e são amplamente 
utilizados por esse segmento industrial são os flavorizantes (ZHUANG et al., 2015). 
Moléculas flavorizantes podem ser provenientes de diferentes grupos químicos, como 
hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos, lactonas e ésteres. Ésteres flavorizantes e 
aromáticos estão amplamente distribuídos na natureza e são responsáveis por conferir 
propriedades organolépticas agradáveis, como odores e sabores, a diversos produtos presentes 
no nosso dia a dia. O olfato humano é capaz de perceber odores ao ser estimulado por 
moléculas pequenas apolares ou de média polaridade quando estas se associam a proteínas 
receptoras presentes no epitélio olfativo. Este processo então assinala a qualidade, a 
autenticidade e o frescor de um alimento, orientando a escolha do consumidor. O mesmo 
processo também é válido para a percepção do sabor, que é identificado por receptores 
encontrados nas papilas gustativas da língua (BERGER, 1997, 2015; SÁ et al., 2017). 
Visto isso, essas propriedades aromáticas e flavorizantes são amplamente empregadas 
em vários produtos fabricados pela indústria farmacêutica, de cosméticos e de alimentos, 
sendo que esta última utiliza esses compostos na fabricação de bebidas, doces, gomas, geléias, 
e laticínios. Devido a alta demanda por esses produtos, o mercado global de flavours e 
fragrâncias foi avaliado em 26 bilhões de dólares em 2015, com uma projeção de crescimento 
até 2021 que pode alcançar os 37 bilhões de dólares (LOZZANO et al., 2012; SÁ et al., 
2017). 
Considerando a estrutura molecular dos ésteres flavorizantes, estes são formados 
principalmente por ácidos carboxílicos ou graxos e álcoois de cadeia curta e média 
 
31 
 
(aproximadamente 8 átomos na cadeia de carbono), e os ésteres denominados aromáticos 
possuem as mesmas características, mas ao invés de apresentarem cadeias lineares ou 
ramificadas possuem um anel aromático em sua estrutura molecular (GÜVENÇ, KAPUCU e 
MEHME OĞ , 2002). Alguns ésteres alquílicos utilizados como compostos flavorizantes 
são: acetato de etila, que possui aroma frutado e pode ser utilizado como realçador de aroma 
em produtos de confeitaria e sorvetes ou como solvente na descafeinização do café; 
hexanoato de etila, que pode simular flavour de frutas como maçã, abacaxi e banana; butirato 
de butila, que também contribui significantemente para aromas de maçã, abacaxi e banana; 
octanoato de butila, que contribui para o flavour de maçã, pêssego e morango (DE BARROS 
et al., 2012). A Tabela 1 apresenta alguns ésteres flavorizantes e aromáticos e suas respectivas 
características. 
 
Tabela 1 Ésteres flavorizantes e aromáticos obtidos por meio da síntese enzimática 
empregando lipase microbiana como biocatalisador. (Adaptado de VAN LAERE et al., 2008; 
SÁ et al., 2017; DIAS, DOS SANTOS e MARTÍNEZ, 2018). 
Composto Característica do flavour Lipase (origem) 
Acetato de benzila Maçã verde, morango, banana Pseudomonas fluorescens 
Acetato de cinamila Balsâmico e odor floral Thermomyces 
lanuginosus 
Acetato de isoamila Banana Candida antarctica 
Benzoato de metila Abacaxi, cereja, morango, baunilha, 
menta, jasmim 
Candida rugosa 
Butirato de butila Abacaxi, pera e banana Candida antarctica 
Butirato de etila Abacaxi Mucor sp. 
Butirato de isoamila Damasco, Banana, abacaxi Candida antarctica 
Butirato de metila Maçã Mucor sp. 
Butirato de pentila Pera ou damasco Rhizopus arrhizus 
Hexanoato de etila Forte odor frutado com notas de banana e 
abacaxi 
Rhizopus chinesis 
CCTCC 
Octanoato de etila Odor floral e frutado de vinho e conhaque, 
flavour de maçã 
Candida antarctica 
Propanoato de isoamila Abacaxi e damasco Candida antarctica 
Propanoato de propila Odor frutado de maçã, banana e abacaxi Candida antarctica 
 
A obtenção de flavours pode ocorrer diretamente de suas fontes naturais, como as 
plantas e frutas. No entanto, essas matrizes apresentam misturas complexas dessas moléculas 
 
32 
 
que podem estar presentes em concentrações baixas ou traço. Além disso, a extração de 
determinadas moléculas fica vinculada a variações sazonais e climáticas da fonte de origem. 
Isso faz com que se precise de uma grande quantidade de matéria-prima e de processos de 
extração e purificação custosos para a obtenção de um composto alvo. Dessa maneira, cria-se 
uma relação de dependência direta da produção dessas moléculas com a disponibilidade de 
suas fontes de obtenção. 
Uma outra alternativa de produção desses compostos por meio de fontes naturais é 
empregando processos fermentativos, seja por FS (fermentação submersa) ou por FES. No 
entanto, a estes processos também pode ser atribuída a complexidade na extração dos 
compostos e em alguns casos apresentar custos relativamente elevados (MATTE et al., 2016). 
Yilmaztekin, Cabaroglu e Erten (2013), utilizando o fungo Williopsis saturnus, estudaram em 
FS os efeitos da temperatura e da aeração da fermentação a partir do melaço de beterraba para 
a produção do éster acetato de isoamila, demonstrando produção máxima de 118 mL/L nas 
melhores condições de fermentação encontradas. Outro estudo demonstrou, dessa vez por 
meio da FES, utilizando cascas de laranja, a produção de diversos compostos flavorizantes 
pela levedura comercial Vitilevure MT (Saccharomyces cerevisiae). Foi possível a obtenção 
de ésteres como acetato de isoamila, octanoato de etila, decanoato de etila e hexanoato de 
etila, obtendo-se para esse último composto uma produção de 154,2 mg/kg de casca de laranja 
fermentada após 48 horas (MANTZOURIDOU, PARASKEVOPOULOU e LALOU, 2015). 
A síntese química convencional tem sido amplamente utilizada e é a principal fonte de 
obtenção de ésteres flavorizantes. No entanto, este processo possui diversas desvantagens, 
uma vez que utiliza catalisadores químicos nocivos ao ambiente e à saúde humana que são 
empregados no processo de síntese e purificação de determinados compostos. Outro aspecto 
negativo deve-se ao fato da baixa especificidade do catalisador químico aos substratos, 
fazendo com que sejam gerados sub-produtos indesejados que posteriormente precisam ser 
removidos, fazendo com que o rendimento da reação seja afetado, assim como os custos de 
produção fiquem elevados. Outros fatores como a possibilidade de corrosão de equipamentos, 
o alto consumo de energia e a presença de impurezas tóxicas à saúde humana encontradas no 
produto final também são descritas como pontos negativos desse tipo de síntese 
(GARLAPATI e BANERJEE, 2013; GUMEL e ANNUAR, 2016; SÁ et al., 2017). 
 A obtenção desses ésteres por meio da síntese enzimática tem sido uma ótima 
alternativa para contornar as características negativas associadas a obtenção por fontes 
naturais e pela síntese química. Essas reações podem operar em condições brandas de 
 
33 
 
temperatura e pressão,possuem alta especificidade aos substratos, reduzindo 
consequentemente a formação de sub-produtos indesejados e gerando um composto de maior 
pureza que exige processos menos custosos de separação (GARLAPATI e BANERJEE, 2013; 
DHAKE, THAKARE e BHANAGE, 2013; DIAS, DOS SANTOS e MARTÍNEZ, 2018). 
Além de realizar um processo mais eficiente, os ésteres produzidos ainda podem ser 
classificados como “ â flavorizantes ” o que seria uma grande vantagem 
devido a maior exigência do consumidor por produtos provenientes de origem natural 
(SPINELLI et al., 2014; DIAS, DOS SANTOS e MARTÍNEZ, 2018). Por definição, de 
acordo com a legislação européia (EG 1334/2008) e dos Estados Unidos (CFR — Title 21 da 
Food and Drug Administration - FDA), flavorizantes naturais são aqueles obtidos por meio 
da extração direta da matriz vegetal produtora, por meio de transformações microbiológicas 
ou a partir de reações enzimáticas de síntese que empreguem substratos também de origem 
natural. Ao contrário, os ésteres obtidos por síntese química, além de serem mais prejudiciais 
ao meio ambiente, são apenas classificados como “ â f z ” (LORENZONI 
et al., 2012; LOZANO, BERNAL e NAVARRO, 2012; BRAULT et al., 2014). 
 
2.1.2. Ésteres cerosos 
Ésteres cerosos são lipídeos neutros altamente hidrofóbicos formados a partir de reações 
de síntese por combinações de ácidos e álcoois que apresentam pelo menos doze átomos em 
sua cadeia de carbono. Estes compostos são amplamente encontrados na natureza fazendo 
parte de matrizes vegetais e animais. A cera de abelha, por exemplo, é uma fonte conhecida 
de ésteres cerosos saturados. Uma fonte animal conhecida desses ésteres é a baleia cachalote, 
que possui grandes quantidades desses compostos armazenados no órgão do espermacete, e o 
principal composto encontrado é oleato de oleíla. Diversas plantas cerosas também são fontes 
dessas moléculas. No entanto, uma que se destaca é a jojoba (Simmondsia chinensis), devido 
ao seu óleo vegetal, que é composto por 95 % de ésteres lineares que possuem entre 38 e 44 
átomos em sua cadeia de carbono (BOUZIDI et al., 2012; IVEN et al., 2016). 
Uma ampla gama de aplicações podem ser realizadas por esses compostos devido às 
suas características de interação com a água e pelo fato de não serem oleosos quando em 
contato com a pele. Além disso, podem ser empregados como lubrificantes, aditivos em 
lubrificantes, plastificantes e materiais de revestimento. Isso faz com que indústrias, como a 
de cosméticos, os utilizem em condicionadores e hidratantes, por exemplo. Indústrias 
 
34 
 
farmacêuticas por sua vez os empregam como anti-espumantes na produção de penicilina. A 
indústria de alimentos utiliza estes ésteres cerosos como adjuvantes em lubrificantes e como 
plastificantes, e obedecem critérios rigorosos quanto ao seu uso para estas finalidades 
(GUNAWAN et al., 2005; KUO et al., 2012). Suas aplicações são controladas por normas 
estabelecidas pela Food and Drug Administration (FDA) e de acordo com o Código de 
Regulações Federais (Code of Federal Regulations - CRF), Título 21, Parte 178, §178.3450, 
apenas os ésteres palmitato de octadecila e estearato de hexadecila ou misturas dos mesmos 
podem ser aplicados como plastificantes ou adjuvantes de lubrificantes em materiais de 
embalagem de alimentos (FDA - Food and Drug Administration, CRF 21). A estrutura 
molecular desses dois ésteres encontra-se na Figura 1. 
 
 
Figura 1 Estruturas dos ésteres: A. Palmitato de octadecila. B. Estearato de hexadecila. 
 
Tendo em vista a gama de aplicabilidades desses compostos, estes acabam por possuir 
valor de mercado relevante, por isso a busca por fontes e processos que possam levar a sua 
produção tem ganhado destaque. A extração direta desses compostos de matrizes vegetais e 
animais ou a obtenção por síntese química vai de encontro com os mesmos problemas 
encontrados para a obtenção dos ésteres flavorizantes por meio dessas fontes. Pode-se citar 
alguns exemplos como a grande quantidade de matéria-prima necessária quando são 
utilizadas matrizes vegetais e os malefícios causados tanto à saúde humana como ao meio 
ambiente pelo emprego de catalisadores químicos quando sua obtenção é pela síntese química 
(ALVES, CREN e MENDES, 2016). Nesse contexto, a síntese enzimática utilizando lipases 
acaba ganhando relevância devido as suas vantagens, como a de obter um produto mais puro 
dada a maior especificidade da enzima pelos substratos, assim como ser um processo 
ambientalmente favorável, o que acaba valorizando o produto devido ao apelo por materiais 
provenientes de fontes naturais e de maior biodegradabilidade, quando comparado por 
exemplo, à lubrificantes derivados do petróleo (SYAMSUL et al., 2010). Nesse contexto, 
 
35 
 
ésteres cerosos podem também ser considerados biolubrificantes, uma vez que além da rápida 
capacidade de serem biodegradados no ambiente (aproximadamente 1 ano) pela atividade 
microbiana também são atóxicos a saúde humana e a outros organismos vivos, principalmente 
os de origem aquática. Os ésteres cerosos com propriedades superiores de lubrificação são 
aqueles que apresentam-se na forma líquida e possuem baixo ponto de fusão, alta estabilidade 
oxidativa e são compostos por cadeias de carbono monoinsaturadas médias ou longas, como o 
oleato de oleíla, oleato de octila e oleato de hexila (TRIVEDI et al., 2015; IVEN et al., 2016; 
SHARMA e BIRESAW, 2016). 
 
2.1.3. Síntese de ésteres flavorizantes e cerosos por lipases 
Reações de síntese para a produção de ésteres flavorizantes e cerosos muitas vezes são 
conduzidas por lipases imobilizadas e não por sua forma livre. A forma livre geralmente 
possui diversos limites operacionais associados a sua maior susceptibilidade a desnaturação. 
Por outro lado, a imobilização enzimática pode trazer diversos benefícios como maior 
estabilidade enzimática e a possibilidade de reutilização do biocatalisador. Geralmente, por 
meio da imobilização os biocatalisadores conseguem superar problemas inerentes às reações 
de síntese, os quais na sua forma nativa seriam mais vulneráveis, como temperatura, pH, força 
iônica e a contaminação por íons metálicos, que podem desestabilizar estas moléculas 
(PATEL et al., 2015). Sarno e colaboradores (2017) realizaram a síntese de acetato de 
isoamila, um composto muito utilizado como flavour de banana, empregando a lipase de 
Thermomyces lanuginosus imobilizada em nanopartículas de óxido de ferro (Fe3O4). Pires-
Cabral, Da Fonseca e Ferreira-Dias (2010) também realizaram um estudo com imobilização 
de lipase de Candida rugosa em espumas hidrofílicas de poliuretano (“HYPOL FHP 2002” e 
“HY O FHP 5000”) para síntese de butirato de etila na presença de n-hexano. Foi 
demonstrado alta estabilidade operacional de ambos biocatalisadores após 30 dias de 
operação quando baixas concentrações de substrato foram utilizadas. Papadaki e 
colaboradores (2017) foram capazes de realizar a síntese de ésteres cerosos utilizando a 
enzima Novozyme 435 (lipase B de Candida antarctica) imobilizada em resina acrílica 
macroporosa e Lipozyme
 
(lipase de Mucor miehei) imobilizada em resina de troca iônica 
macroporosa por meio de reações de transesterificação empregando óleo microbiano e como 
aceptor de acila o álcool beenílico, cetílico e oleílico. Foi obtido maior rendimento da reação 
utilizando o álcool beenílico alcançando 87,3 % de conversão. 
 
36 
 
Por outro lado, a síntese de ésteres flavorizantes e cerosos também já foi demonstrada 
utilizando a lipase em sua forma livre por Macedo, Pastore e Rodrigues (2004) utilizando 
lipases de Geotrichum sp. e Rhizopus sp na síntese do butirato de isoamila e por Trivedi e 
colaboradores (2015) que utilizaram a lipase Callera Trans L (Thermomyces lanuginosus, EP 
258068) na síntese de vários biolubrificantes, como o oleato de oleíla, oleato de octila e oleato 
de hexila naausência de solventes. 
Outros trabalhos demonstraram a síntese de ésteres utilizando a própria célula e enzimas 
aderidas a sua parede celular como um único biocatalisador. Esse processo é vantajoso, pois 
elimina etapas de “downstream” como a purificação e imobilização enzimática, reduzindo 
custos. Jin e colaboradores (2012) estudaram a síntese de diferentes ésteres flavorizantes 
utilizando células recombinantes de Pichia pastoris que expressavam lipase de Candida 
antarctica (CALB) que ficavam dispostas por ancoragem em sua parede celular, e as 
descreveram como um biocatalisador robusto para a síntese de ésteres em meios não aquosos. 
Xu e colaboradores (2002) também realizaram a síntese de vários ésteres flavorizantes 
empregando etanol como aceptor de acila e vários ácidos carboxílicos (C2-C6) utilizando 
células de Rhizopus chinensis CCTCC M201021 produtoras de lipases. Chen e Wang (1997) 
utilizaram células de Rhizopus niveus imobilizadas em biomassa celulósica para síntese de 
oleato de palmitila e oleato de laurila, atingindo em reação livre de solventes um rendimento 
de 76 e 87 % após 70 h, respectivamente. 
Embora a síntese enzimática de ésteres flavorizantes e cerosos seja amplamente 
estudada, o uso da lipase de Y. lipolytica com essa finalidade não tem sido reportada. Lipases 
produzidas por FES com esse mesmo objetivo têm sido reportadas por poucos estudos (SUN, 
XU e WANG, 2009; LOPES, DUARTE e MACEDO, 2011; AGUIEIRAS et al., 2014; 
OLIVEIRA et al., 2017), principalmente quanto a obtenção de flavours por reações de síntese. 
Além disso, a utilização de um biocatalisador sólido composto pela própria biomassa 
fermentada para síntese de ésteres flavorizantes ainda não foi reportada. Seu uso torna-se de 
grande interesse pois este passa a ser um biocatalisador produzido por um processo de baixo 
custo, capaz de ser empregado em reações que sintetizam compostos de alto valor agregado, 
aumentando portanto sua competitividade econômica frente a outros processos que utilizam 
enzimas imobilizadas ou catalisadores químicos, por exemplo. Por outro lado, o uso de 
preparados enzimáticos sólidos, tem sido registrado para a síntese de biodiesel por alguns 
autores, como reportado por Liu Y. e colaboradores (2013), que utilizaram o sólido 
fermentado de bagaço de cana-de-açúcar e sementes de girassol por Burkholderia 
 
37 
 
cenocepacia na etanólise de diferentes óleos vegetais. Aguieiras e colaboradores (2014) 
também fizeram uso de um biocatalisador de baixo custo produzido por FES utilizando torta 
de babaçu fermentada pelo fungo R. miehei para produção de biodiesel. O sólido fermentado 
foi empregado diretamente na reação de transesterificação utilizando ácidos graxos livres do 
óleo de macaúba e etanol, alcançando conversão de 91 % após 8 h de reação em um sistema 
livre de solventes, resultado similar foi encontrado para a lipase Novozym 435 e Lipozyme 
RM IM também testadas no estudo. 
 
2.2 Yarrowia lipolytica 
A levedura Yarrowia lipolytica anteriormente também identificada como Candida 
lipolytica e originalmente descrita como Endomycopsis lipolytica e Saccharomycopsis 
lipolytica pertence à família Dipodascaceae e classifica-se como um hemiascomiceto. Y. 
lipolytica é o único representante teleomorfo (capaz de se reproduzir sexuadamente) 
conhecido no gênero Yarrowia, já sua forma anamórfica fica classificada no gênero Candida. 
No entanto, a fase teleomórfica só veio a ser identificada em 1970 pelos pesquisadores 
Wickerham, Kurtzman e Herman, sendo então publicada como Endomycopsis lipolytica. 
Pouco tempo depois uma nova nomenclatura viria a ser dada para este micro-organismo, 
classificada então no ano de 1972 por Yarrow no gênero Saccharomycopsis, passando a se 
chamar Saccharomycopsis lipolytica. No ano de 1980 em outros estudos realizados por van 
der Walt e von Arx foi observado que S. lipolytica possuía características bem distintas de 
outras espécies do mesmo gênero, como a forma e o tamanho de seus ascósporos, a presença 
da co-enzima Q-9, enquanto as famílias Endomycetaceae e Saccharomycetaceae apresentam 
as coenzimas Q-6, Q-7 ou Q-8 e também a composição de carboidratos de sua parede celular. 
Essas divergências levaram à criação de um novo gênero chamado Yarrowia por van der Walt 
e von Arx para este micro-organismo, sendo então finalmente classificado em termos de 
espécie como Yarrowia lipolytica (BARTH e GAILLARDIN, 1997; GROENEWALD et al., 
2014). 
Este micro-organismo possui dimorfismo celular, podendo apresentar-se nas formas 
leveduriforme, de hifas ou pseudo-hifas, conforme mostra a Figura 2, de acordo com as 
condições do seu meio de crescimento. No entanto, pouco ainda se sabe sobre a regulação 
gênica que proporciona essa característica. 
 
 
38 
 
 
Figura 2 Dimorfismo celular da levedura Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682. A. Células 
leveduriformes crescidas em meio líquido (YPD) (imagem obtida com lente objetiva em 
ampliação de 400x). B. Células alongadas e em forma de hifas após crescimento em meio 
sólido (YPD) (imagem obtida com lente objetiva de imersão em óleo em ampliação de 
1000x). Fonte: Acervo BIOSE. 
 
Embora apresente dimorfismo, é considerado um micro-organismo saprófito, diferindo 
por exemplo, da Candida albicans que também apresenta essa habilidade. Dessa maneira, 
possui status GRAS (Generally recognized as safe) pela FDA, o que lhe confere grande 
relevância biotecnológica para aplicações em diversos campos industriais, principalmente em 
setores que produzem insumos que tem destino final o consumo humano, como o setor de 
produção de cosméticos, farmacêutico, bebidas e alimentos, por exemplo. Outras 
características relevantes da levedura Y. lipolytica é o fato de ser estritamente aeróbia, a 
maioria das cepas não crescer acima dos 32 °C, produzir diversos metabólitos de importância 
industrial e apresentar alta capacidade secretória, o que corrobora seu potencial 
biotecnológico (BARTH e GAILLARDIN, 1997; COELHO, AMARAL e BELO, 2010). 
O dimorfismo celular dessa levedura foi estudado por diversos autores que o 
correlacionaram com vários fatores. Foi descrito que a transição dimórfica em Y. lipolytica 
tem base nas vias de sinalização celular em que proteíno-quinases ativadas por mitógenos 
(MAP Quinase) e a proteína quinase A dependente de AMPc (adenosina 3',5'-monofosfato 
cíclico) atuam. Esses sinalizadores protéicos possuem funções opostas, na via de sinalização 
da MAP Quinase estimulam o crescimento em hifas enquanto a proteína quinase A é 
 
39 
 
necessitada para o crescimento ovóide. Portanto, consequentemente a presença de AMP 
cíclico nas células inibe a formação de hifas (TIMOUMI et al., 2017). 
Tendo em vista o metabolismo estritamente aeróbio de Y. lipolytica, a disponibilidade 
de oxigênio é relevante com relação a transição entre as morfologias que podem ser 
apresentadas. Bellou e colaboradores (2014) demonstraram uma maior formação de hifas em 
ambientes com menos oxigênio dissolvido quando comparados a outros com maior 
disponibilidade de oxigênio, que favoreceram a morfologia celular leveduriforme da Y. 
lipolytica ACA-DC 50109. Nunes e colaboradores (2013) utilizando a cepa de Y. lipolytica 
IMUFRJ 50682 observaram que a formação de hifas foi melhor induzida em baixa velocidade 
de agitação do meio de cultivo na presença de soro de bezerro, também indicando que baixos 
níveis de oxigênio dissolvido estimulariam essa transição dimórfica. Além disso, os autores 
observaram que o composto farnesol foi um inibidor da formação de hifas. 
Em outro estudo utilizando as linhagens W29 e PO1a, os autores correlacionaram o pH 
como o fator mais importante para a transição dimórfica, na qual o crescimento de hifas era 
favorecido em valor de pH próximo de 7 e era inibido em pH 3. A fonte de carbono e de 
nitrogênio como glicose, citrato e amônio também foram indutores da formação de hifas 
(RUIZ-HERRERAe SENTANDREU, 2002). Em um estudo conduzido utilizando uma 
variante denominada Y. lipolytica var. indica, os autores também observaram a formação de 
hifas quando fontes orgânicas de nitrogênio e a fonte de carbono N-acetil glicosamina foram 
fornecidas (PALANDE et al., 2014). Kawasse e colaboradores (2003), por outro lado, 
mostraram que tanto o estresse térmico como o oxidativo foram capazes de estimular o 
crescimento de hifas, relacionando essa característica como um mecanismo de defesa celular. 
Esses estudos demonstraram, portanto, a vasta gama de fatores que podem influenciar a 
morfologia da levedura Y. lipolytica, e que o melhor entendimento desses mecanismos pode 
ter relação direta com a expressão de diversos metabólitos de interesse. 
Por muito tempo, a maioria dos estudos foi conduzida utilizando modelos de micro-
organismos tradicionais como a Escherichia coli e leveduras ditas como convencionais, como 
Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe. No entanto, nas últimas três 
décadas houve uma grande migração de interesse para outras leveduras que também 
demonstraram possuir grande relevância na área de pesquisa básica e também na 
biotecnologia aplicada. Isso devido principalmente à área da engenharia metabólica destinada 
a produção de compostos derivados do acetil-CoA, ácidos graxos e lipídios. Estas leveduras 
foram denominadas não-convencionais, podendo-se citar por exemplo, Pichia pastoris, 
 
40 
 
Candida maltosa, Kluyveromyces lactis e Y. lipolytica, sendo esta última a mais 
extensivamente estuda (BARTH e GAILLARDIN, 1997; ZHU e JACKSON, 2015). 
Tendo em vista a sua intensa atividade secretória, esse micro-organismo distingui-se 
pela habilidade de secretar diversas proteínas no meio onde é cultivado, como proteases, 
fosfatases, RNases, esterases e seu principal metabólito que são as lipases. Devido a essa 
característica, essa levedura vem sendo bastante estudada ao longo dos anos como um modelo 
de produção de proteínas heterólogas substituindo inclusive modelos bem definidos como E. 
coli, e, por ser um organismo eucarioto, compartilha maior similaridade com células de 
“ ” realizando, por exemplo, processamento proteico pós tradução, 
diferentemente de células procarióticas que não possuem o maquinário celular para o fazer 
(MADZAK,GAILLARDIN e BECKERICH, 2004). Du e colaboradores (2016) demonstraram 
a produção de campesterol, um precursor de esteróides (progesterona, hidrocortisona) 
utilizado como droga hormonal empregando óleo de semente de girassol como fonte de 
carbono por Y. lipolytica. Gao e colaboradores (2017), por outro lado, demonstraram ser 
possível a síntese de β-caroteno por meio da expressão de uma betacaroteno sintase 
multifuncional heteróloga em Y. lipolytica. A biossíntese do homoeriodictiol a partir do 
eriodictiol pela proteína recombinante flavona 3’-O-metil transferase em Y .lipolytica foi 
estudada por Liu Q. e colaboradores (2013). O homoeriodictiol é um flavonóide com 
características anti-inflamatórias, anti-bacteriana e também possui efeitos contra o câncer. 
Pode ser também utilizado como um agente modificador de paladar empregado tanto na 
indústria alimentícia como na farmacêutica, em sua forma natural ou de seu sal sódico. 
A levedura Y. lipolytica vem recebendo grande atenção pois mostrou-se um excelente 
modelo de estudo de acumulação e degradação de lipídios, biogênese do peroxissomo e 
secreção de proteínas. Já foi reportado na literatura o seu isolamento a partir de produtos 
lácteos, ambientes contaminados com óleo, produtos cárneos, esgotos, estuários marinhos 
poluídos, dentre outros (SABIROVA et al., 2011; GONÇALVES, COLEN e TAKAHASHI, 
2014). É possível notar que este micro-organismo possui alta adaptação a ambientes ricos em 
proteínas e substratos hidrofóbicos como triglicerídeos e n-alcanos. Consequentemente, esta 
característica repercute diretamente na sua habilidade em metabolizar, armazenar e degradar 
substratos dessa natureza, conferindo-lhe inclusive o status de levedura oleaginosa. Não 
somente é capaz de utilizar substratos hidrofóbicos, mas também consegue metabolizar 
glicose, frutose e glicerol como fontes de carbono, e armazená-los na forma de lipídios 
 
41 
 
intracelulares chegando a ultrapassar 25 % do peso seco da célula, em um processo de síntese 
de triacilgliceróis denominado de novo (ZHU e JACKSON, 2015). 
A habilidade em degradar substratos de natureza hidrofóbica exige por parte das células 
primeiramente certos recursos para alcançar o substrato. Foram descritos por Fickers e 
colaboradores (2005a) dois mecanismos distintos de interação entre os substratos hidrofóbicos 
e a célula, em que o primeiro consiste na produção de um surfactante para solubilizá-lo 
facilitando seu consumo, e a outra hipótese seria a formação de protusões celulares para 
favorecer a adesão direta ao substrato, podendo ser inclusive observada uma modificação na 
polaridade da parede celular. Essas protrusões conferem uma característica apolar à parede 
celular, e formam espécies de canais que conectam essa estrutura ao meio intracelular, 
facilitando a absorção do substrato. Para realizar o consumo de substratos hidrofóbicos, a 
célula necessita de um maquinário enzimático eficiente para executá-lo. Por esse motivo, Y. 
lipolytica desenvolveu um ampla gama de lipases para atuar no metabolismo de lipídios. 
Várias lipases dessa levedura já foram identificadas, podendo estar localizadas no meio 
intracelular, na parede da célula ou serem secretadas, como ocorre com a sua lipase mais 
estudada, Lip2 (ALOULOU et al., 2007a). 
Tendo em vista a aplicação de Y. lipolytica na indústria de alimentos, é possível 
destacar o seu papel na produção de ácidos orgânicos como o cítrico, isocítrico e pirúvico, 
produção de surfactantes e emulsificantes, γ-decalactona, de produtos lácteos e cárneos e 
alimentos baseados no teor nutricional das células ricas em lipídios e proteínas. Seu uso 
também já foi proposto como agente de tratamento de esgoto para degradar poluentes como 
óleos e hidrocarbonetos gerados por esse setor (LEDESMA-AMARO e NICAUD, 2016). 
Os flavours associados a salsichas fermentadas têm relação direta com os ácidos 
liberados durante o período de maturação, e já é sabido que Y. lipolytica participa dentro de 
um consórcio de micro-organismos desse processo. A maturação de produtos lácteos como 
queijos já mostrou estar ligada a ação de leveduras, como descrito para o queijo tipo Tetilla 
por Y. lipolytica, que foi reportada por Centeno e colaboradores (2017), demonstrando a 
produção de um perfil de flavours satisfatório e uma característica sensorial próxima a de 
queijos desse tipo denominados de “ ” quando adicionada também a levedura 
Kocuria varians. Price e colaboradores (2014) também avaliaram a influência de Y. lipolytica 
no desenvolvimento do aroma em queijo “blue cheese”, chegando a conclusão que o controle 
da quantidade de inóculo utilizada para realizar o processo de maturação do produto pode 
levar a manipulação da composição de aromas alcançando um característica sensorial 
 
42 
 
desejada. De Wit (2005) estudou a influência de Y. lipolytica e Debaryomyces hansenii na 
maturação de queijo cheddar e foi notado que a atividade lipolítica das leveduras favoreceu a 
produção de ácido propanóico, n-butírico, mirístico, palmítico, palmitoléico, esteárico e 
oléico. A atividade proteolítica proporcionou uma alta quantidade de aminoácidos livres como 
glicina e treonina que podem contribuir para a formação do flavour do alimento. O uso 
simultâneo de ambos micro-organismos favoreceu o melhor desenvolvimento do flavour e a 
aceleração do processo de maturação. 
A produção de ácido cítrico a partir do soro de leite parcialmente desproteinizado por 
uma linhagem lactose positiva denominada Yarrowia lipolytica B9 foi demonstrada por 
Arslan, Aydogan e Taskin (2016).Da Silva e colaboradores (2013), por sua vez, estudaram a 
produção de ácido cítrico por Y. lipolytica IMUFRJ 50682 a partir do uso do glicerol como 
fonte de carbono. Fontes e colaboradores (2010) demonstraram a produção de um 
biossurfactante pela cepa de Y. lipolytica IMUFRJ 50682. Essas moléculas anfipáticas são 
responsáveis por reduzir a tensão interfacial entre a interface óleo e água atuando como um 
agente emulsificante, muito utilizados pela indústria de alimentos. Uma outra aplicação para 
esse micro-organismo apresenta-se no campo nutricional ao utilizar a biomassa celular como 
fonte de ácidos graxos poliinsaturados ou como fonte de proteínas, conforme já foi descrito 
em estudos anteriores (ZINJARDE, 2014). 
A produção de moléculas de aroma já foi reportada na literatura utilizando Yarrowia 
lipolytica. A γ-decalactona é a mais estudada devido ao seu característico aroma de pêssego, e 
a principal via de obtenção desse composto ocorre por meio da β-oxidação. Um dos métodos 
mais conhecidos de se obtê-la é a partir do ácido ricinoléico quando a síntese é realizada por 
essa levedura (BRAGA e BELO, 2016). 
Tendo em vista a produção de aromas como moléculas individuais, pode-se considerar 
que o potencial da levedura Y. lipolytica acaba sendo subestimado, uma vez que apenas a 
γ-decalactona se destaca nesse cenário. Além disso, não existe registro na literatura das 
lipases dessa levedura sendo aplicadas em reações de síntese para produção de ésteres de 
aroma ou outros ésteres de cadeia curta e longa. 
 
2.3 Lipases 
Lipases são serinohidrolases definidas como triacilglicerol acilhidrolases (E.C. 3.1.1.3) 
que possuem a habilidade de hidrolisar substratos hidrofóbicos na interface óleo/água, 
 
43 
 
atuando por exemplo, sobre as ligações éster de triglicerídeos, diglicerídeos e 
monoglicerídeos, liberando ácidos graxos e glicerol, conforme esquema apresentado na 
Figura 3. Também são capazes de realizar a reação reversa de síntese quando na presença de 
meios anidros, devido ao deslocamento do equilíbrio termodinâmico, contrário a reação de 
hidrólise. 
Na literatura científica vários autores discutem os aspectos que diferenciam lipases de 
esterases (EC 3.1.1.1) e foi visto que para uma enzima ser considerada uma lipase verdadeira 
é necessário que este biocatalisador consiga hidrolisar a ligação éster de substratos que 
possuam mais de 10 átomos em sua cadeia de carbono. No entanto, é importante ressaltar que 
lipases também podem atuar em substratos com menos de 10 átomos de carbono. Outro fator 
que diferencia as lipases das esterases é o fenômeno da ativação interfacial, ou seja, a 
capacidade de hidrolisar substratos apolares emulsionados em meios aquosos. Além disso, 
esterases costumam atuar melhor sobre glicerídeos que apresentam menos de 10 átomos em 
sua cadeia de carbono e substratos solúveis em água (FICKERS, MARTY e NICAUD, 2011; 
SELVIM et al., 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 Ilustração da reação de hidrólise de triglicerídeos pela lipase. 
 
Estas enzimas são catalisadores ubíquos na natureza, podendo ser obtidas de fontes 
animais, vegetais e por meio de micro-organismos. Uma das grandes vantagens da produção 
de lipases por via microbiológica é que esta não depende de variações sazonais ou climáticas 
que interfiram na sua produção e conseguem ser obtidas em um tempo relativamente curto, 
algo que não é possível para lipases obtidas de fontes vegetais, que por exemplo, ainda 
precisam ser cultivadas em grandes quantidades para se obter a enzima de interesse. Já lipases 
obtidas de tecidos animais muitas vezes precisam ser extraídas de órgãos internos, gerando 
maior complexidade, podem carregar vírus e apresentar traços de hormônios contaminantes e 
possuir odor desagradável que podem interferir negativamente no produto final sintetizado. O 
 
44 
 
advento das engenharias genética e metabólica favoreceu a produção desses biocatalisadores, 
pois micro-organismos, que são estruturas celulares menos complexas, podem ser 
“ h ” em prol de uma produção mais alta dessas proteínas, além do processo 
fermentativo poder ser controlado com relação aos seus parâmetros, aumentando sua 
eficiência (KUMARI e GUPTA, 2012). A Tabela 2 apresenta algumas fontes de lipases já 
utilizadas industrialmente e suas aplicações. 
 
Tabela 2 Algumas lipases comerciais, suas aplicações industriais e fabricantes (Adaptado de 
SINGH e MUKHOPADHYAY, 2012). 
Fonte Aplicação Nome comercial Fabricante 
Aspergillus niger Processamento de 
alimentos 
Lipase A “ ” 6 Amano 
Candida antartica B Síntese orgânica Lipase 435 Novozymes 
Candida rugosa Síntese orgânica Lipase AY “ ” 30 Amano 
Candida rugosa Síntese orgânica Resinase Novozymes 
Geotrichum candidum Oleoquímica Chirazyme L-8 Boehringer 
Mannheim 
Humicola lanuginosae Aditivo em 
detergente 
Lipolase ™ Novo 
Nordiskzymes 
Mucor javanicus Processamento de 
alimentos, 
oleoquímica 
Lipase M “ ” 10 Amano 
Pâncreas suíno Síntese orgânica PPL Merck 
Penicillium roquefortii Processamento de 
alimentos 
Lipomod 338P-L338P Biocatalysts 
Rhizomucor miehei Processamento de 
alimentos 
Palatase Novozymes 
Thermomyces 
lanuginosus 
Aditivo em 
detergente 
Lipolase, Lipolase Ultra, 
Lipo Prime,Lipex 
Novozymes 
 
Devido a ampla gama de aplicação, esses biocatalisadores já representam entre todas as 
enzimas o terceiro maior volume de vendas, ficando atrás das carboidrolases e das proteases, 
com uma fatia de 10 % do mercado global, e houve ainda uma perspectiva de crescimento 
anual, a partir de 2014 de 6,2 %, vindo a alcançar até 2017 o valor de 345 milhões de dólares. 
Proteases representam entre 25 e 30 % do mercado global, enquanto as carboidrolases ficam 
com a maior fatia, que representa mais de 50 %. Um dado interessante no mercado de 
enzimas é o alto crescimento de suas aplicações dentro da indústria de alimentos. A demanda 
 
45 
 
global por comida processada e o aumento do poder aquisitivo da população emergente está 
levando a maior procura por alimentos e bebidas, que representaram, em 2015, 35 % das 
aplicações do mercado de enzimas, seguidos por produtos de limpeza e alimentação animal. A 
líder de mercado dentro desse segmento é a empresa Novozymes, seguida pela Dow-Dupont 
que representam 48 e 18 % das vendas, respectivamente (DAIHA et al., 2015; GUERRAND, 
2017). 
Lipases podem ser aplicadas em diversas atividades industriais, como no 
desengorduramento do couro na indústria de curtume, na remoção de ceras na indústria de 
papel, na indústria de cosméticos agindo como emulsificadores, na farmacêutica para 
resolução de misturas racêmicas, na têxtil atuando sobre manchas de lubrificantes e 
fornecendo ao tecido melhor capacidade de absorção do tingimento e na produção de 
biodiesel. No entanto a maior aplicação desses biocatalisadores está na indústria de 
detergentes, que atuam como removedores de manchas e gorduras, seguido pela indústria de 
alimentos. 
 No setor alimentar essas enzimas podem ser utilizadas na síntese de ésteres 
flavorizantes, que são adicionados à alimentos e bebidas, conferindo-lhes sabores 
característicos. Além dessa aplicação, são também empregadas no desenvolvimento de 
flavours de produtos lácteos como queijos ou hidrolisando gordura do leite; na panificação 
atuam como emulsificantes hidrolisando lipídios presentes no trigo e aumentando o flavour do 
produto por meio da síntese de ésteres de cadeia curta. Outras aplicações encontram-se na 
produção de substitutos do leite humano, que é utilizada na hidrólise de determinados 
substratos liberando ácidos graxos que compõem esse nutriente e também na emulsificação da 
gema de ovo, utilizada amplamente em receitas de alimentos como a maionese. Na maturação 
de produtos cárneos atuam no desenvolvimento de flavour em salsichas, por exemplo. Outro 
uso bastante relevante das lipases encontra-se