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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Lipase de Yarrowia lipolytica: caracterização da seletividade na hidrólise e produção de lipídios estruturados de interesse nutricional Emília Akil 2016 ii Lipase de Yarrowia lipolytica: caracterização da seletividade na hidrólise e produção de lipídios estruturados de interesse nutricional Emília Akil Orientadores: Alexandre Guedes Torres Priscilla Filomena Fonseca Amaral Rio de Janeiro Fevereiro, 2016 Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos. iii Akil, Emília. Lipase de Yarrowia lipolytica: caracterização da seletividade na hidrólise e produção de lipídios estruturados de interesse nutricional/ Emília Akil. Rio de Janeiro: UFRJ/IQ, 2016. 136 f.:il. Orientadores: Alexandre Guedes Torres, Priscilla Filomena Fonseca Amaral. Tese (Doutorado em Ciências) – Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, 2016. 1. Lipases. 2. Lipase de Yarrowia lipolytica. 3. Regiosseletividade. 4. Tiposseletividade. 4. Lipídios estruturados. I. Torres, Alexandre Guedes. (Orient). II. Amaral, Priscilla Filomena. (Orient). III. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos. V. Título CDD: 668.001 iv Lipase de Yarrowia lipolytica: caracterização da seletividade na hidrólise e produção de lipídios estruturados de interesse nutricional Emília Akil Orientadores: Alexandre Guedes Torres Priscilla Filomena Fonseca Amaral Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos. Aprovada por: _______________________________________ Prof. Alexandre Guedes Torres Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ _______________________________________ Profa. Maria Alice Zarur Coelho Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ _______________________________________ Profa. Priscilla Vanessa Finotelli Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ _______________________________________ Profa. Maria Aparecida Bismara Reginato d’Arce Universidade de São Paulo – USP _______________________________________ Profa. Vanessa Naciuk Castelo Branco Universidade Federal Fluminense – UFF Fevereiro, 2016. v Dedicatória: A minha mãe, meu exemplo de caráter, de amor incondicional. vi AGRADECIMENTOS Não poderia deixar de relatar meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a elaboração desta tese. É impossível começar os agradecimentos sem, primeiramente, referir-se a Deus, pois para mim é a base de tudo nesta vida. A razão de existir simplesmente não há sentindo sem a presença e a crença de sua força. Uns dizem que ciência e força universal são antônimas, mas a meu ver um depende do outro, vivendo em uma simbiose constante. Graças na fé desta força espiritual que eu consigo crer na ciência. Gostaria de agradecer ao meu orientador professor Alexandre Torres, que por muitas vezes teve mais atitudes de amigo que orientador. Sem a sua confiança depositada a mim, eu não teria conseguido conquistar todos os meus objetivos. Obrigada por todos os ensinamentos, pela paciência, e por todas as conversas e conselhos. Credito este trabalho especialmente a minha querida co-orientadora Priscilla Amaral. Obrigada por proporcionar minha introdução a este mundo mágico das lipases. Impossível não deixar de agradecer pela sua paciência e companheirismo, por me ajudar em todas as vezes que me deparei com todas as dúvidas que tive sobre o mundo destes “bichinhos” chamados leveduras. Agradeço ao pesquisador Pierre Villeneuve, por me aceitar em sua equipe na França e permitir que eu vivenciasse momentos muito prazerosos, tanto no âmbito profissional como pessoal, em um lugar tão incrível. Seus ensinamentos foram de fundamental importância para meu amadurecimento em seguir com este trabalho. Agradeço também a Jérôme Lecomte, pela sua dedicação e gentileza em me ajudar na execução do meu trabalho na bancada e também pela grande paciência em responder todas as minhas dúvidas sem perder a simpatia em sua pessoa. Por fim, agradeço aos técnicos Bruno Bárea e Nathalie Barouh por todas as ajudas naqueles momentos em que tive dificuldade em executar as análises, assim como estarem sempre com muita simpatia em me receber. vii Esta pesquisa também não poderia chegar até aqui sem a presença dos meus amigos do LBNA, da família LBNA, melhor dizendo. Impossível evoluir sem suas risadas, piadas e momentos de descontração. E claro, naqueles momentos de aperto onde o trabalho de um torna-se trabalho de muitos e acontece uma ajuda mútua! Obrigada Aline, André, Ellen, Fabrício, Genilton, Kim, Laís, Nathália, Nívea, Suellen, Vanessa Di Sarli e Tamirys. E também, aos mais novos que chegaram ao LBNA, Camila, Isabele e Yuri. Claro que não podia faltar a Júlia, minha secretária favorita. Aos professores Daniel Perrone, Vanessa Naciuk, Juliana Nunes e Mariana Monteiro pela troca de experiência e sugestões, especialmente durante as apresentações dos seminários do LBNA. Não posso deixar de agradecer as amigas Rosely Lopes e, principalmente, a Tamires Carvalho. Obrigada por toda ajuda e paciência na produção da lipase, assim como na medição da atividade e todas outras tarefas que vocês me ajudaram a executar. Com certeza sem a ajuda de vocês meu caminho seria bem mais árduo! Gostaria de agradecer as professoras que aceitaram em fazer parte da banca examinadora. Seus conhecimentos e experiências são cruciais para o melhor fechamento deste trabalho. A minha família, especialmente minha mãe e meu pai, pelo amor e educação que me fornecem desde 1983. O meu caráter é fruto do exemplo de vocês. Meu carinho, meu amor por vocês são, simplesmente, incondicionais. Obrigada pelos seus incentivos contínuos à minha carreira, pelo orgulho declarado e pelo exemplo de busca ao crescimento profissional e pessoal. Aos meus amigos que estiveram presentes comigo ao longo desta trajetória, nos momentos felizes e de descontração, como também naqueles conturbados, e pela compreensão nas minhas ausências. Obrigada Angélica, Caio, Débora, Denis, Fabio Oliveira, Fábio Rosa, Rafael, Rodrigo, Samyr, prima Aurélia, enfim, a todos os amigos e amigas que não ousarei em citar os nomes. Agradeço em especial a grande amiga Thaís. Sem os seus conselhos, companheirismo, amizade, honestidade e paciência eu jamais estaria aqui agora. Ao Wolverine, meu gatinho viii peludinho que chegou à minha vida há pouco tempo, com o seu ronronar que me conforta a cada dia, fazendo companhia nas longas horas que despendi na escrita desta tese. E claro, não poderia faltar minha enorme gratidão a “ela”, a protagonista deste trabalho, a Yarrowia lipolytica. Obrigada por ser a causadora da existência deste estudo, por me fornecer tantos resultados positivos em absolutamente tudo que fiz. Por ultimo e não menos importantes, as agências financiadoras FAPERJ, CAPES e CNPq.ix “Lute com determinação, abrace a vida com paixão, perca com classe e vença com ousadia, porque o mundo pertence a quem se atreve e a vida é muito bela para ser insignificante.” Charles Chaplin “Nada na natureza se cria, nada se perde, tudo se transforma.” Antoine Lavoisier x RESUMO Akil, Emília. LIPASE DE Yarrowia lipolytica: CARACTERIZAÇÃO DA SELETIVIDADE NA HIDRÓLISE E PRODUÇÃO DE LIPÍDIOS ESTRUTURADOS DE INTERESSE NUTRICIONAL. Rio de janeiro, 2016. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro. As lipases microbianas apresentam potente habilidade na modificação lipídica e atraem grande interesse em pesquisas e aplicações biotecnológicas. As aplicações de lipases estão intimamente relacionadas com a sua seletividade frente ao substrato: a regiosseletividade e a tiposseletividade. Uma interessante aplicação das lipases é na síntese de lipídios estruturados, que são triacilgliceróis (TAGs) modificados por meio de reações de síntese reversa, pela incorporação ou mudanças na posição no glicerol (sn-1/2/3) de ácidos graxos (AGs) de interesse nutricional. No presente trabalho foi investigada a regio- e tipo-seletividade da lipase de Y. lipolytica na forma livre e imobilizada em nanopartículas magnéticas em hidrólise e a produção de lipídios estruturados com AGs bioativos por reação de acidólise e, consequentemente, a caracterização de sua regiosseletividade nesta reação. Para análise da regiosseletividade, foram escolhidos TAG homogêneo (trioleína) e TAGs heterogêneos de óleos vegetais. A tiposseletividade das lipases de Y. lipolytica foi determinada em relação ao tamanho de cadeia e número de insaturações de ésteres etílicos de ácidos graxos (EEAGs) em reações de hidrólise. Os substratos para a produção dos lipídios estruturados foram a trioleína e TAGs do azeite de oliva e ácidos graxos livres de cadeia média (AGCM) cáprico (C10:0) e láurico (C12:0) em acidólise. Após reação de hidrólise, por 5, 10, 15 e 30 minutos, ambas as lipases (livre e imobilizada) apresentaram elevadas atividades hidrolíticas em trioleína e triacilgliceróis de óleos vegetais nos primeiros minutos de reação. Utilizando a lipase livre como biocatalisador, mais de 55% dos (TAGs) da trioleína e do azeite de oliva foram hidrolisados em apenas 5 minutos. As hidrólises catalisadas pela lipase imobilizada foram mais lentas, apresentando, aproximadamente, 60% de hidrólise dos TAGs somente em 30 minutos de reação. Foi observado forte 1,3- regiosseletividade para a lipase livre, a partir da razão entre os diacilgliceróis (DAG), 1,2(2,3)-DAG e 1,3-DAG, analisados por Thin layer chromatography (TLC). Durante toda a reação de hidrólise, a razão 1,2(2,3)-DAG/1,3-DAG foi de 49 (98/2) utilizando a lipase livre, e de 99 em 5 minutos (99/1) e 49 em 30 minutos (98/2) para a imobilizada. Isto significa que ambas lipases tiveram preferência por hidrolisar os ácidos graxos esterificados nas posições sn-1 ou sn-3 comparados àqueles da posição sn-2 do TAG. A lipase livre de Y. lipolytica também mostrou-se estritamente sn-1,3 regiosseletiva em misturas heterogêneas de triacilgliceróis em matrizes complexas. Para a lipase imobilizada, no entanto, os resultados indicaram não-seletividade para os óleos mais complexos e baixa sn-1,3-regiosseletividade para o azeite de oliva. Nenhuma das lipases mostrou tiposseletividade para AGs saturados (AGSs), no entanto ambas lipases apresentaram tiposseletividade para AGs insaturados de cadeia longa (AGCL), especialmente para C18:2. Porém, a tiposseletividade da lipase imobilizada pareceu ter um perfil mais fraco em comparação com a lipase livre. A produção de triacilgliceróis estruturados (TAG-ES) foi bem sucedida, apresentando em torno de 31% de C10:0 e C12:0 na posição sn-1,3 do TAG proveniente do azeite de oliva em apenas 15 minutos de reação utilizando a lipase livre de Y. lipolytica. Isto mostra que a lipase também apresentou sn-1,3 regiosseletividade em reações de acidólise, além de ter produzido TAG-ES enriquecidos com AGCM nas posições externas e ácido oleico na posição central do TAG. O comportamento foi similar utilizando o TAG modelo (trioleína). Conclui-se que esses resultados indicam que as lipases de Y. lipolytica apresentam-se como potenciais biocatalisadores de interesse tecnológico destinados à customização de lipídios com interesse nutricional. xi ABSTRACT Akil, Emília. Yarrowia lipolytica LIPASE: SELECTIVITY CHARACTERIZATION IN HYDROLYSIS AND STRUCTURED LIPIDS PRODUCTION OF NUTRITIONAL INTEREST. Rio de Janeiro, 2016. Thesis (Doctor of Science, D.Sc.). Chemistry Institute, Federal University of Rio de Janeiro. Janeiro. The microbial lipases feature potent lipid modification skills and attract great interest in research and biotechnological applications. The applications of lipases are closely related to its selectivity towards the substrate: the regioselectivity and the typoselectivity. An interesting application of lipase is in the synthesis of structured lipids, which are triacylglycerols (TAGs) modified by reverse synthesis reactions, by incorporation or changes in position on the glycerol (sn-1/2/3) in fatty acids (AGs) of nutritional interest. In this study was investigated the regio-and type-selectivity of lipase from Y. lipolytica in free and immobilized form on magnetic nanoparticles in hydrolysis and the production of structured lipids with bioactive AGs for acidolysis reaction and, consequently, the characterization of their regioselectivity in this reaction. For analysis of regioselectivity, were chosen TAG model (triolein) and TAGs heterogeneous from vegetable oils. The typoselectivity of free and immobilized lipase from Y. lipolytica was determined in relation to the chain length and number of unsaturation of ethyl esters of fatty acids (EEAGs) acidolysis reactions at 15, 30, 60 and 180 minutes. The substrates for the production of structured lipids were the triolein and TAGs of the olive oil and medium-chain free fatty acids (MCFA) capric (C10:0) and lauric (C12:0). After hydrolysis reaction, during 5, 10, 15 and 30 minutes, in both lipases (free and immobilized) as biocatalysts, showed high hydrolytic activity on triolein and triacylglycerols of vegetable oils in the first few minutes of reaction. Using the free lipase as biocatalyst, more than the 55% of (TAGs) of triolein and olive oil were hydrolyzed in just 5 minutes. The hidrolysis catalyzed by immobilized lipase were slower, showing approximately 60% of hydrolysis of the TAGs only in 30 minutes of reaction. It was observed strong 1.3-regioselectivity for lipase free, since the ratio between the classes diacylglycerol (DAG) – 1,2(2,3)-DAG and 1,3-DAG – analized by TLC. Throughout the hydrolysis reaction, the ratio of 1,2(2,3)-DAG/1,3-DAG was 49 (98/2) using free lipase, and of 99 in 5 minutes (99/1) and 49 in 30 minutes (98/2) to the immobilized. This means that both lipases had preference for hydrolyze the esterified fatty acids in position sn-1 or sn-3 compared to those of the sn-2 position of the TAG. The free Y. lipolytica lipase is strictly sn- 1,3 regioselective in heterogeneous mixtures of triacylglycerols in complex matrices. For the lipase immobilized the results indicate non-selectivity for the most complex oils and low sn-1,3-regioselectivity for olive oil. None of the lipase showed typoselectivity to AGs saturated (AGSs), however both lipases presented typoselectivity to long chain unsaturated AGs (AGCL), especially to C18:2. However, the typoselectivity immobilized lipase appeared to be weaker in comparison to the free lipase. The production of structured triacylglycerols (TAG-ES) was successful, showing around 31% of C10:0 and C12:0 in position sn-1,3 of the TAG from the oliveoil in just 15 minutes of reaction using free lipase of Y. lipolytica. This shows that the lipase also presented sn-1,3 regioselectivity in acidolysis reactions, in addition to having produced TAG-ES enriched with MCFA in external positions and oleic acid in the central position of the TAG. The behavior was similar using the model TAG. As a homogeneous TAGs, it was possible to calculate the efficiency of incorporation on triolein (in mol% relative to the number of moles of sn-1,3 in glycerol), which was 24 and 34% in 15 min, with molar ratio of 1:2 of TAG:AG. It was concluded that these results indicate that the Y. lipolytica lipases presents as biocatalyst of potential technological interest of lipids intended for customization of interest nutrition. xii ÍNDICE DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Figura 1 Representação esquemática da reação de hidrólise e de síntese reversa catalisada pela lipase. 24 Figura 2 Representação esquemática das reações de hidrólise, acidólise e transesterificação e catalisada por lipases. 26 Figura 3 Representação esquemática das reações de hidrólise catalisadas por lipases do tipo não-seletiva e 1,3-regiosseletiva. 28 Figura 4 Ilustração apresentando a 1,3-regiosseletividade da lipase em reação de hidrólise e acidólise. 29 Figura 5 Observação em microscópio de células de Y. lipolytica. 34 Figura 6 Biorreator de capacidade de 2 L utilizado na produção de lipase de Y. lipolytica por fermentação submersa. 36 Figura 7 Biorreator de capacidade de 3 L utilizado na produção de lipase de Y. lipolytica por fermentação submersa. 36 Figura 8 Apresentação resumida de oito etapas que compõe o processo de digestão e absorção de lipídios provenientes da alimentação. 42 Figura 9 Ilustração de reação de acidólise catalisada por uma lipase 1,3- regiosseletiva utilizando trioleína e ácidos graxos de cadeia média como substratos. 51 CAPÍTULO 2 Figura 1 Extrato bruto rico em lipases de Y. lipolytica produzido por fermentação submersa e este extrato bruto de enzimas liofilizado até tornar-se um pó amarelo. 60 Figura 2 Extrato bruto rico em lipases de Y. lipolytica imobilizado com nanopartículas magnéticas de Fe3O4 . 60 Figura 3 Sequência de equipamentos utilizados para análise em cromatografia em camada delgada, iniciando pelo ATS4 e terminando com o scanner 3 TLC. 64 Figura 4 Formação dos produtos gerados pelas hidrólises da trioleína e dos óleos vegetais (azeite de oliva e óleos de soja, girassol e canola) catalisadas pela lipase livre de Y. lipolytica. Triacilgliceróis ( ), diacilgliceróis ( ), 69 xiii ácidos graxos livres ( ) e monoacilgliceróis ( ). Figura 5 Formação dos produtos gerados pelas hidrólises da trioleína e dos óleos vegetais (azeite de oliva e óleos de soja, girassol e canola) catalisadas pela lipase imobilizada de Y. lipolytica. Triacilgliceróis ( ), diacilgliceróis ( ), ácidos graxos livres ( ) e monoacilgliceróis ( ). 71 Figura 6 Formação dos produtos gerados pelas hidrólises do óleo de amendoim bruto e puro, catalisada pela lipase livre (A e B) imobilizada (C e D) de Y. lipolytica. Triacilgliceróis ( ), diacilgliceróis ( ), ácidos graxos livres ( ) e monoacilgliceróis ( ). 73 Figura 7 Formação dos ácidos graxos liberados das hidrólises dos ésteres etílicos catalisados pela lipase livre (A e C) e imobilizada (B e D) de Y. lipolytica. Ácidos graxos saturados (A e B); ácidos graxos insaturados (C e D). 79 Figura 8 Formação dos ácidos graxos liberados das hidrólises dos ésteres etílicos catalisados pela lipase livre (A) e imobilizada (B) de Y. lipolytica. 80 CAPÍTULO 3 Figura 1 Sequência de eventos da aplicação das amostras de óleo, hidrolisadas pela lipase pancreática, para separação das classes lipídicas (TAG, DAG, MAG e AGL) por cromatografia em camada delgada. 93 Figura 2 Incorporação dos ácidos graxos cáprico (C10:0; A) e láurico (C12:0; B) na trioleína (razão molar de 2:1, ácido graxo livre:trioleína) e eficiência da incorporação em mol % (relativo ao número de moles de sn-1,3 no glicerol) dos ácidos graxos cáprico (C) e láurico (D) na trioleína em reações de acidólise catalisadas pela lipase livre de Y. lipolytica. 97 Figura 3 Incorporação dos ácidos graxo láurico (C12:0; A) na trioleína (razão molar 4:1, ácido graxo livre:trioleína) e eficiência da incorporação em mol % (relativo ao número de moles de sn-1,3 no glicerol) do ácido graxo láurico na trioleína (B) em reações de acidólise catalisadas pela lipase livre de Y. lipolytica. 99 xiv ÍNDICE DE TABELAS CAPÍTULO 1 Tabela 1 Caracterização de algumas lipases frente ao substrato em hidrólise e reações de síntese reversa. 30 Tabela 2 Algumas lipases microbianas comercialmente disponíveis. 32 Tabela 3 Composição média dos ácidos graxos encontrados em alguns dos óleos vegetais com alta produção. 40 Tabela 4 Nomenclatura comum e IUPAC dos ácidos graxos de cadeia média. 46 CAPÍTULO 2 Tabela 1 Composição de ácidos graxos (g/100 g de total de ácidos graxos) em amostras de óleos vegetais. 68 Tabela 2 Razão da regio-distribuição de diacilgliceróis (%) após hidrólises parciais biocatalisadas com as lipases livre e imobilizada de Y. lipolytica e, para comparação, lipase comercial livre de C. rugosa em triacilglicerol modelo, após 0 (controle), 5, 10, 15 e 30 minutos. 74 Tabela 3 Razão da regio-distribuição de diacilgliceróis (%) após hidrólises parciais catalisadas com as lipases livre e imobilizadas de Y. lipolytica e lipase comercial de C. rugosa (para comparação) em amostras de óleos vegetais, após 0 (controle), 5, 10, 15 e 30 minutos. 76 Tabela 4 Razão da regio-distribuição de diacilgliceróis (%) após hidrólises parciais catalisadas com as lipases livre e imobilizadas de Y. lipolytica e lipase comercial de C. rugosa (para comparação) em amostras de óleo de amendoim bruto e puro, após 0 (controle), 5, 10, 15 e 30 minutos 78 Tabela 5 Conteúdo relativo (%) de ácidos graxos livres e ésteres etílicos de ácidos graxos* após hidrólises parciais biocatalisadas pelas lipases livre e imobilizada de Y. lipolytica. 81 CAPÍTULO 3 Tabela 1 Distribuição de ácidos graxos em sn-2 e sn-1/3 nos triacilgliceróis estruturados (trioleína + C10:0 e trioleína + C12:0). 100 Tabela 2 Ácidos graxos no azeite de oliva: composição nos lipídios totais, nas posições sn-2 (2-MAG) e sn-1/3 nos triacilgliceróis. 101 Tabela 3 Distribuição de ácidos graxos em sn-2 e sn-1/3 nos triacilgliceróis estruturados (azeite de oliva + C10:0 e azeite de oliva + C12:0). 102 xv LISTA DE ABREVIAÇÕES 2-MAG, 2-monoacilglicerol AG, ácido graxo AGCC, ácido graxo de cadeia curta AGCL, ácido graxo de cadeia longa AGCM, ácido graxo de cadeia média AGE, ácido graxo essencial AGI, ácido graxo insaturado AGL, ácido graxo livre AGPI, ácido graxo poli-insaturado AGS, ácido graxo saturado CDD, cromatografia em camada delgada CLAE, cromatografia líquida de alta eficiência CG, cromatografia em fase gasosa DAG, diacilglicerol DHA, ácido docosahexaenóico DMSO, dimetilsulfóxido EEAG, éster etílico de ácido graxo ELSD, detector de espalhamento de luz evaporativo EMAG, éster etílico de ácido graxo EPA, ácido eicosapentaenóico FES, fermentação em estado sólido FID, detector de ionização em chamas FSm, fermentação submersa HPLC, high performance liquid chromatography HPTLC, high performance thin layer chromatography GRAS, Generally Recognize as Safe MAG, monoacilglicerol p-NFL, paranitrofenol laurato PVA, álcool polivinílico TAG, triacilglicerol TAG-ES, triacilglicerol estruturado TLC, thin layer chromatography YPD, Yeast Extract, Peptone,Dextrose xvi SUMÁRIO INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 18 1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 19 2. ESTRUTURA DA TESE ............................................................................................ 21 3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 22 3.1 Objetivos Gerais .................................................................................................. 22 3.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 22 CAPÍTULO 1 ............................................................................................................................ 23 1. LIPASE ....................................................................................................................... 24 1.1 Lipases microbianas ............................................................................................. 31 2. LIPASE DE Yarrowia lipolytica ................................................................................. 34 3. APLICAÇÕES DE LIPASES EM MODIFICAÇÕES LIPÍDICAS ........................... 39 4. LIPÍDIOS NA NUTRIÇÃO HUMANA ..................................................................... 41 4.1 Ácidos graxos insaturados ................................................................................... 44 4.2 Ácido graxo de cadeia média ............................................................................... 46 5. LIPÍDOS ESTRUTURADOS ..................................................................................... 49 5.1 Formas de obtenção dos lipídios estruturados ..................................................... 50 5.2 Lipídios estruturados como alimentos funcionais ............................................... 51 CAPÍTULO 2 ............................................................................................................................ 54 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 56 2. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 59 2.1 Micro-organismos e materiais ............................................................................. 59 2.2 Produção do extrato bruto rico em lipase ............................................................ 59 2.3 Imobilização da lipase ......................................................................................... 60 2.4 Determinação da atividade da lipase.................................................................... 61 2.5 Análise de ácidos graxos por Cromatografia em Fase Gasosa ............................ 62 2.6 Hidrólise parcial dos lipídios e dos ésteres de ácidos graxos pela lipase ............ 63 2.7 Análise das classes lipídicas por Cromatografia em Camada Delgada ............... 63 2.8 Determinação da regiosseletividade da lipase ..................................................... 65 2.9 Determinação da tiposseletividade da lipase ....................................................... 65 2.10 Análises estatísticas ............................................................................................. 66 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 67 3.1 Atividade da lipase de Y. lipolytica ..................................................................... 67 xvii 3.2 Reações de hidrólise dos triacilgliceróis modelo e heterogêneos dos óleos vegetais ........................................................................................................................... 67 3.3 Regiosseletividade da lipase de Y. lipolytica em triacilgliceróis modelo e heterogêneos em reações de hidrólise ............................................................................. 74 3.4 Tiposseletividade da lipase de Y. lipolytica em reações de hidrólise .................. 79 4. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 85 CAPÍTULO 3 ............................................................................................................................ 86 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 88 2. MATERIÁIS E MÉTODOS ....................................................................................... 91 2.1 Micro-organismos e materiais ............................................................................. 91 2.2 Produção do extrato bruto rico em lipases ........................................................... 91 2.3 Determinação da atividade da lipase.................................................................... 91 2.4 Reação de acidólise para produção de lipídios estruturados ................................ 92 2.5 Determinação das classes lipídicas dos lipídios estruturados .............................. 93 2.6 Separação das classes lipídicas após reação parcial de hidrólise por Cromatografia em Camada Delgada ............................................................................... 94 2.7 Análise de ácidos graxos por cromatografia em fase gasosa ............................... 95 2.8 Determinação da regiosseletividade da lipase de Y. lipolytica em reações de síntese reversa ................................................................................................................. 95 2.9 Análise estatística ................................................................................................ 96 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 97 3.1 Atividade da lipase de Y. lipolytica ..................................................................... 97 3.2 Produção de lipídios estruturados a partir da acidólise da trioleína com ácido graxo de cadeia média ..................................................................................................... 97 3.3 Produção de lipídios estruturados a partir da acidólise do azeite de oliva e ácidos graxos de cadeia média ................................................................................................. 102 4. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 105 CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................................... 106 TRABALHOS FUTUROS ......................................................................................................... 108 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 110 ANEXOS ................................................................................................................................ 121 18 INTRODUÇÃO 19 1. INTRODUÇÃO GERAL As lipases são reconhecidas por seu elevado potencial na tecnologia lipídica. Destacam-se as de origem microbiana por seu maior interesse industrial, em especial devido aos seguintes fatores: seletividade frente ao substrato, grandes variedades de micro- organismos produtores (variedade genética e funcional), não são sujeitas a sazonalidade na produção, apresentam fácil manipulação genética visando melhoramento tecnológico, curto tempo de geração, entre outros fatores (Amaral, 2007; Treichel et al, 2010). Lipases são triacilglicerol éster-acilhidrolases (E.C.3.1.1.3.) capazes de catalisar a hidrólisede ligações éster com ácidos graxos de cadeia longa em triacilgliceróis, diacilgliceróis e monoacilgliceróis formando ácidos graxos livres e glicerol. Quando submetidas a meios reacionais não aquosos ou micro-aquosos, as lipases também são capazes de catalisar reações de síntese reversa, tais como a interesterificação e a transesterificação (De Araújo et al, 2011; De Lima, 2013). Essas características atraem grande interesse em pesquisas e aplicações biotecnológicas (Brígida et al, 2014b). As aplicações de lipases estão intimamente relacionadas com a sua seletividade frente ao substrato. A seletividade da lipase pode ser dividida em diferentes grupos: a regiosseletividade que é a capacidade que a enzima possui em distinguir as duas posições externas da molécula de triacilglicerol (ésteres primários) da posição interna (éster secundário) e liberar os ácidos graxos esterificados nestas posições (De Araújo et al, 2011), assim como também pode catalisar a incorporação (troca de radicais acila entre um éster e um ácido) dos ácidos graxos nestas posições em reações de síntese reversa; a tiposseletividade que está relacionada à seletividade da lipase em agir sobre ácidos graxos particulares ou sobre grupos de ácidos graxos com características estruturais semelhantes e, finalmente, as lipases não seletivas são aquelas que catalisam a hidrólise de triacilglicerol para ácido graxo livre e glicerol e/ou a incorporação de ácidos graxos na molécula de triacilglicerol de forma aleatória. Este grupo de lipases não apresenta seletividade posicional ou em relação ao grupo acila (Cambon et al, 2008). O conhecimento da seletividade das lipases frente ao substrato permite uma ampliação de seu uso industrial, em especial quanto à sua aplicação na síntese de lipídios estruturados, que são triacilgliceróis modificados. Por exemplo, têm-se as reações de acidólise em que o triacilglicerol reage com ácidos graxos livres, resultando em um novo triacilglicerol, resultante da incorporação de ácidos graxos livres do meio reacional. A finalidade principal da síntese de lipídios estruturados é de alterar a composição em ácido 20 graxo do triacilglicerol e/ou sua distribuição nas posições sn-1,2,3 do glicerol (Akoh, 1995; Lee & Akoh, 1998). O aumento do conhecimento a respeito dos efeitos de ácidos graxos específicos no metabolismo humano, especialmente os insaturados, tais como: os ácidos oleico, linoleico e linolênico, e os de cadeia média, tais como os ácidos cáprico e láurico, tem estimulado a síntese de lipídeos estruturados com vistas ao tratamento e à prevenção de diversas doenças crônicas, assim como no tratamento de pacientes com síndromes de má absorção e dislipidemias (Yankah & Akoh, 2000). Devido à essas variada funcionalidade, os lipídios estruturados podem ser considerados alimentos funcionais, fornecendo ácidos graxos específicos esterificados em posições específicas do glicerol para fins nutritivos e terapêuticos, permitindo efeito benéfico à saúde ou visando o tratamento de doenças específicas ou condições metabólicas anormais (Yankah, 2000). Além disso, podem ser sintetizados para melhorar ou modificar características físicas e/ou químicas dos óleos, tais como ponto de fusão, viscosidade, entre outros (Gunstone, 1998; Auerbach, 2001). Na modificação de lipídios para fins nutricionais e na indústria de alimentos, destacam-se as lipases microbianas produzidas por micro-organismos seguros (GRAS Status; Generally Recognized as Safe). Yarrowia lipolytica é um micro-organismo aeróbico, não patogênico, que apresenta GRAS Status concedido pela American Food and Drug Administration. Um de seus principais produtos de interesse tecnológico são lipases, que podem ser extracelulares, intracelulares ou ligadas à membrana citoplasmática. A YILip2 é uma potente lipase microbiana, produzida e secretada pela Y. lipolytica na fermentação submersa ou em estado sólido (Amaral, 2007). A depender das condições de cultivo microbiano, essa pode ser a principal lipase produzida por Y. lipolytica. No entanto, a seletividade desta lipase, Y. lipolytica IMUFRJ 50682, frente ao substrato (régio- e tipo-seletividade) em reações de hidrólise não foi determinada de maneira completa, além disso, não foram investigados sua seletividade em reações de acidólise ou seu uso na produção de lipídios estruturados. Adicionalmente, o conhecimento do comportamento da lipase de Y. lipolytica em ambos os mecanismos de reação dará subsídios à futuras investigações acerca da produção de novos lipídios contendo ácidos graxos de interesse nutricional. Dessa forma, o presente trabalho pode vir contribuir para a expansão das aplicações tecnológicas da lipase de Y. lipolytica, possivelmente na customização de óleos e na modificação lipídica. 21 2. ESTRUTURA DA TESE O desenvolvimento da tese foi dividido em um capítulo de revisão da literatura e dois capítulos no formato de artigos científicos, nos quais apresenta-se parte experimental da tese. No primeiro capítulo, uma breve revisão da literatura é apresentada, onde as recentes descobertas sobre as lipases microbianas são descritas, especialmente sobre as lipases de Yarrowia lipolytica, além de suas aplicações em modificações lipídicas, com ênfase na produção de lipídios estruturados. No segundo capítulo apresenta-se a caracterização da regio- e tipo-seletividade da lipase de Yarrowia lipolytica em reações de hidrólise; foi investigada a enzima na forma livre (estrato bruto) e imobilizada sobre nanopartículas magnéticas. Para caracterização da regiosseletividade da lipase, foram avaliados substratos modelo (padrão de trioleína como triacilgliceróis homogêneos) e triacilgliceróis heterogêneos em óleos vegetais naturais, selecionados de acordo com a sua produção e consumo mundial. Por outro lado, para a investigação da tiposseletividade, foram utilizados padrões de ésteres etílicos de ácidos graxos saturados com diferentes comprimentos de cadeia e insaturados de mesmo comprimento de cadeia, porém com variado número de insaturações. A motivação principal para esse trabalho foi a potente ação catalítica combinada à escassez de dados publicados acerca da lipase de Yarrowia lipolytica, especialmente quanto a sua regiosseletividade frente ao substrato em reações de hidrólise. Essa parte do trabalho foi aceita para publicação como artigo completo no periódico Biochemical Engineering Journal (artigo completo em Anexo 3). O terceiro capítulo apresenta a produção de um lipídio estruturado, enriquecido de ácidos graxos de interesse nutricional, esterificados ao triacilglicerol em posição nutricionalmente favorável. Adicionalmente à produção do novo óleo funcional, foi caracterizada a ação da lipase de Yarrowia lipolytica na sua forma livre quanto a regiosseletividade em reações de síntese reversa (acidólise), assim como a sua eficiência na produção desses lipídios estruturados, em função do tempo de reação e da razão molar entre os substratos (ácido graxo livre e triacilglicerol). Esse trabalho apresentou como principal motivação a inexistência de dados publicados quanto a ação desta lipase em reações de acidólise, somado a importância da avaliação de seu uso na customização de lipídios com propriedades funcionais. O manuscrito, em fase intermediária de redação, será submetido para apreciação pelo periódico Food Chemistry, com vistas à publicação como artigo completo. 22 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivos Gerais Caracterizar o perfil da regio- e tipo-seletividade da lipase livre e imobilizada de Y. lipolytica IMUFRJ 50682 em reações de hidrólise e investigar a produção de lipídios estruturados, utilizando ácidos graxos de interesse nutricional, pela ação da lipase livre de Y. lipolytica em reações de acidólise. 3.2 Objetivos Específicos a) Determinar a atividadehidrolítica da lipase de Y. lipolytica sobre triacilgliceróis homogêneo (trioleína) e heterogêneos em óleos vegetais; investigar a lipase nas formas livre e imobilizada sobre nanopartículas magnéticas, em diferentes tempos de reação; b) Investigar, em reações de hidrólise, a regiosseletividade e a tiposseletividade da lipase de Y. lipolytica nas formas livre e imobilizada sobre nanopartículas magnéticas; c) Produzir lipídios estruturados enriquecidos com ácidos graxos poli-insaturados na posição sn-2 e ácidos graxos de cadeia média nas posições sn-1/3 do triacilglicerol pela ação da lipase livre de Y. lipolytica em reações de acidólise, sobre triacilglicerol homogêneo (trioleína) e heterogêneos de azeite de oliva; d) Determinar a regiosseletividade da lipase livre de Y. lipolytica em reações de acidólise, na a produção de lipídios estruturados. 23 CAPÍTULO 1 Revisão de Literatura 24 1. LIPASE A utilização de lipases vem se intensificando nos últimos anos, devido à versatilidade dessas enzimas. Na indústria de alimentos, por exemplo, a lipase é utilizada principalmente para a produção de ácidos graxos (AGs), responsáveis pelo desenvolvimento do aroma e sabor, principalmente em queijos e na modificação de lipídios, aumentando seu valor comercial e nutritivo (Akin et al, 2003). As lipases são enzimas, que por sua vez são classificadas e codificadas pela NC- IUBMB (Nomemclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) de acordo com a sua reação catalítica. As enzimas recebem uma classificação numérica da Enzyme Comission, cuja abreviação é E.C., seguida de até quatro dígitos referentes a classes e subclasses à que pertencem. Lipases são pertencentes a classe das hidrolases (E.C.3.1) e que atuam sobre as ligações éster (E.C.3.1.1), ou seja, constituem um grupo de enzimas que são esterases e catalisam a hidrólise de ligações éster de triacilgliceróis (TAGs), formando diacilglicerol (DAG), monoacilglicerol (MAG), ácidos graxos livres (AGL) e glicerol. Assim, foram definidas como glicerol éster hidrolases (E.C.3.1.1.3). Essas enzimas ainda podem realizar reações de síntese reversa à hidrólise, como é possível observar na Figura 1, quando são submetidas a meios reacionais não aquosos ou micro-aquosos, catalisando a síntese de vários ésteres (Jaeger et al, 1999; Cambon et al, 2008; Brígida et al, 2014b). Figura 1: Representação esquemática da reação de hidrólise e de síntese reversa catalisada pela lipase (Amaral, 2007, com adaptações). As lipases podem ser encontradas em animais (pâncreas, plasma sanguíneo, saliva, suco pancreático), em vegetais (soja, amendoim, etc.), bactérias e fungos (Whitaker, 1972). 25 Em eucariotos, as lipases estão envolvidas em vários estágios do metabolismo lipídico, incluindo a digestão de gorduras, o metabolismo de lipoproteínas, absorção e reconstituição. Nas plantas, as lipases são encontradas nos tecidos de reserva de gordura (Shamar et al, 2001). As lipases são esterases que atuam em substratos insolúveis em água, agindo na interface água/óleo de soluções emulsionadas, catalisando, preferencialmente, a hidrólise de ésteres de ácidos graxos de cadeia mais longa. A principal diferença entre lipases com o restante das esterases é que as lipases apresentam maiores atividades com substratos insolúveis, como os TAGs compostos por AGs de cadeia mais longa. Porém, as esterases preferem catalisar reações com AGs com menores números de átomos de carbono, geralmente até 6 carbonos (Lopes, 2011). Os AGs que compõem os TAGs apresentam números de átomos de carbono de 4 a 18 e podem apresentar insaturações. A diversidade de AGs e, consequentemente, de TAGs presentes na natureza, propiciou a existência de vários tipos de lipases, apresentando características distintas (Amaral, 2007). O sítio ativo das lipases é composto por uma tríade catalítica, que consiste em uma sequência de três resíduos de aminoácidos fundamentais para a atividade catalítica, sendo Serina-Asparagina-Histidina e Serina-Glutamina-Histidina as mais frequentes. O sítio ativo das lipases é protegido por uma cadeia peptídica denominada de “tampa”, formada por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, que são deslocados ao entrar em contato com o substrato apolar, expondo o sítio ativo. O movimento da estrutura que compõe a tampa confere às lipases pelo menos duas conformações distintas, sendo a primeira denominada “fechada” ou inativa pelo não deslocamento da “tampa” e a segunda denominada “aberta” ou ativa, pelo deslocamento da “tampa” na presença de uma interface lipídeo-água. O sítio ativo fica acessível ao substrato e, adicionalmente, a lipase expõe uma larga superfície hidrofóbica (Amaral, 2007). Existe uma forte tendência no crescimento do uso das lipases por conta do seu vasto campo de aplicação. Isso porque, atualmente, além de se buscar processos industriais mais eficientes, também se procura processos mais conscientes, que não geram resíduos e onde os catalisadores podem ser reutilizados. Com isso, o interesse das indústrias pela substituição de produtos químicos pelo uso de enzimas vem aumentando, tornando a tecnologia da catálise enzimática de grande interesse biotecnológico no cenário mundial (De Araújo et al, 2011; De Lima, 2013). Há uma série de vantagens no uso de lipases em relação aos métodos convencionais de síntese orgânica. Primeiro, as reações podem ocorrer em temperaturas moderadas e, dessa 26 forma, há uma menor degradação tanto de substratos como dos produtos formados. Segundo, algumas lipases podem promover reações de síntese reversa, além das reações de hidrólise, em ambientes micro-aquosos. As reações de síntese reversa, dependendo dos reagentes de partida empregados, podem resultar em reações de interesterificação, como por exemplo, a troca de radicais acil entre um éster e um ácido (acidólise) ou ainda de um éster e outro éster, reação intitulada de transesterificação. Isto pode resultar em um novo óleo com rearranjo de AGs formando um novo TAG, com propriedades químicas, físicas e nutricionais específicas (Brandoo, 2002; Kumar, 2005). As reações de hidrólise e de síntese reversa (acidólise e transesterificação), catalisadas por lipases, estão demonstradas esquematicamente na Figura 2. Figura 2: Representação esquemática das reações de hidrólise, acidólise e transesterificação e catalisada por lipases (Carvalho et al, 2003, com adaptações). 27 Entretanto, o uso de lipases proporciona reações que possibilitam na formação de produtos mais específicos, pelo fato de seu poder catalítico apresentar seletividade frente aos substratos (Feltes, 2013). Com isso, os produtos produzidos a partir de óleos ou gorduras por meio de processos utilizando lipases, são gerados com maior rapidez e maior seletividade, que faz com que despertem maiores interesses em aplicações industriais (Saxena, 2003). Esta potente habilidade na modificação lipídica atrai grandes interesses em pesquisas e aplicações biotecnológicas (Brígida, 2014a). As aplicações de lipases estão intimamente relacionadas com a sua seletividade frente ao substrato, que podem expandir suas aplicações. A seletividade das lipases pelos AGs é relacionada pelo comprimento de cadeia carbônica, bem como o número e posição das insaturações. O elevado grau de especificidade que as lipase podem apresentar, tanto para as reações de hidrólise como também para as reações de síntese reversa, as tornam um excelente biocatalisador (Long, 2010; De Araújo et al, 2011). A seletividade das lipases pode ser classificada de três formas: a regiosseletividade, a tiposseletividade e a estereoseletividade. A regiosseletividade é a característica da lipase em possuir a habilidade de distinguiras duas posições externas da molécula do triacilglicerol (ésteres primários) da posição central (éster secundário). Esta seletividade é dividida em três grupos que são descritos a seguir (Saxena, 2003; Long, 2010; De Araújo et al, 2011): 1,3-regiosseletiva: é a habilidade que a lipase tem em distinguir entre as duas posições externas da molécula do TAG (ésteres primários) da posição central da molécula (éster secundário). Em reações de hidrólise, a lipase apresenta preferência em catalisar a hidrólise daqueles AGs que estão esterificados nas posições externas da molécula. Em reações de síntese reversa, a lipase apresenta preferência em catalisar a esterificação dos AGs nos ésteres primários na molécula do TAG; 2-regiosseletiva: esta habilidade é contrária a 1,3-regiosseletiva, em que a lipase possui a capacidade de distinguir a posição central (éster secundário) das duas posições externas da molécula do TAG (ésteres primários). Logo, em reações de hidrólise, a lipase apresenta preferência em catalisar a hidrólise daqueles AGs que estão esterificados na posição central da molécula. Em reações de síntese reversa, a lipase apresenta preferência em catalisar a esterificação dos AGs no éster secundário na molécula do TAG; Não-seletiva: por fim, esta característica indica que a lipase não apresenta preferência posicional frente ao substrato. Essas lipases catalisam a hidrólise dos TAGs e/ou a incorporação dos AGs na molécula de uma forma aleatória. 28 A Figura 3 apresenta de uma forma geral, a representação do comportamento das lipases 1,3-regiosseletivas e não seletivas, em reações de hidrólise. Figura 3: Representação esquemática das reações de hidrólise catalisadas por lipases do tipo não- seletivs e 1,3-regioseletiva (Long, 2010, com adaptações). Como pode ser observado na Figura 3, a reação de hidrólise biocatalisada por lipases não-seletivas tende a resultar na produção de DAGs que não contenham seus AGs nas posições sn-1 ou sn-2 na molécula de glicerol. Entretanto, conforme avança a reação de hidrólise, ocorre a formação de 2-monoacilglicerol (2-MAG), pois começa a ocorrer a hidrólise dos AGs em ambas as posições externas da molécula de TAGs. Porém há lipases que apresentam um forte comportamento de 1,3-regiosseletividade, como por exemplo, a lipase pancreática, que em poucos minutos de reação de hidrólise já é observado a presença da classe de 2-MAG no meio reacional (De Araújo et al, 2011). A Figura 4 apresenta uma ilustração com dois exemplos da ação de uma lipase 1,3- regiosseletiva em TAGs: uma em reação de hidrólise e outra em reação de síntese reversa, como por exemplo, a reação de acidólise. Na reação de hidrólise, a lipase prefere hidrolisar os AGs nas posições externas da molécula do TAG. Na reação de acidólise, a lipase prefere esterificar os AGs nas posições externas. 29 Figura 4: Ilustração apresentando a 1,3-regiosseletividade da lipase em reação de hidrólise e acidólise. A tiposseletividade é a característica da lipase em catalisar preferencialmente a hidrólise ou esterificação de um grupo específico de AGs da molécula de TAG ou AGs com características estruturais semelhantes. Por fim, a estereosseletividade, é a capacidade da lipase de catalisar a hidrólise e/ou esterificação do AG que está em um éster primário em comparação com o outro (sn-1 vs. sn-3) (Ren, 2011; Brígida, 2014a). Já foi determinada a regiosseletividade e a tiposseletividade frente ao substrato em diversas lipases. Geralmente as lipases apresentam o mesmo perfil seletivo em ambas as reações, porém as lipases podem apresentar comportamentos distintos dependendo da reação que é aplicada (Ren, 2011). A Tabela 1 foi elaborada para apresentar a seletividade do grupo das principais lipases que são utilizadas, que apresentam o mesmo perfil seletivo tanto em reação de hidrólise como também em reações de síntese reversa. A maioria das lipases exibem 1,3-regiosseletividade ou são não-seletivas, porém é possível que uma lipase apresente comportamento de 1,3-regiosseletividade mais expressivo em comparação com outra lipase. Entretanto, poucas lipases apresentam a preferência na atividade catalítica na posição central (sn-2). 30 Tabela 1: Caracterização de algumas lipases frente ao substrato em hidrólise e reações de síntese reversa. Fonte (animal, vegetal e microbiológica) Regiosseletividade Tiposseletividade Fonte Lipase pancreática (animal) 1,3-regiosseletiva AGs insaturados e saturados Christie, 2010 Latex de Babaco (vegetal) 1,3-regiosseletiva AGs insaturados Cambon et al, 2008 Carica papaya (vegetal) 1,3-regiosseletiva AGs insaturados Cambon et al, 2008 Candida rugosa (microbiológica) Não-seletiva Não-seletiva Vaysse, 2002 Thermomyces lanuginose (microbiológica) 1,3-regiosseletiva Seletiva para AGs insaturados Yang, 2003 Rhizomucor miehei (microbiológica) 1,3-regiosseletiva Seletiva para AGs saturados individuais e AGs insaturados Araújo, 2011 Candida antarctica (microbiológica) Não-seletiva e 2- regiosseletiva Não-seletiva Chnadhapura, 2001 As lipases comerciais Novozyme-435, oriunda da lipase de Candida antarctica, e a Lipozyme-IM de Mucor mieihei, são geralmente as lipases mais utilizadas em pesquisas. Estas lipases são 1,3-regiosseletividas, principalmente para AGCL, principalmente o ácido linoleico (18:2n-6) e linolênico (18:3n-3), como também demonstraram tiposseletividade para estes AGs, em ambas as reações de hidrólise e de síntese reversa. Porém, a Novozyme- 435 e Lipozyme-IM também apresentam forte preferência em incorporar o AG docosa- hexaenóico (DHA; 22:6n-3) e AG eicosapentaenoico (EPA; 20:5n-3) em trioleína, AGs insaturados com 22 e 20 átomos de carbono, respectivamente, presente em óleo de peixe, que possui elevada propriedade na prevenção de diversas doenças, como as cardiovasculares (Haman, 2008). As lipases vegetais também podem apresentar características em relação a posição do AG na molécula do TAG e a preferência de hidrolisar ou esterificar um tipo e/ou um grupo específico de AG. As lipases obtidas do látex da planta do mamão (Carica papaya) e do látex da planta do Babaco foram estudadas minuciosamente e, por ambos os vegetais apresentarem similaridade no látex, também apresentaram que suas lipases também são semelhantes em relação a caracterização frente ao substrato (Cambon et al, 2008). Esse estudo afirma que ambas as lipases apresentam forte comportamento 1,3-regiosseletivo, principalmente para AGs insaturados em apenas 15 minutos de reação de hidrólise. Em 31 relação a tiposseletividade, a preferência foi em incorporar o grupo de AGs de cadeia curta (AGCC), porém esta tiposseletividade só foi detectada após 1 hora de reação de acidólise. Considerando todas essas vantagens descritas, a caracterização dessa seletividade das lipases frente ao substrato expande potencialmente suas aplicações biotecnológicas, principalmente permitindo que possam ser utilizadas na customização de óleos e gorduras objetivando na síntese de novos lipídios. No âmbito nutricional, esta aplicabilidade das lipases possui elevado interesse, uma vez que interferem no melhoramento da saúde dos indivíduos (Liese, 2000; Jaeger, 2002; Long, 2010; Kanjilal et al, 2013; Feltes, 2013). 1.1 Lipases microbianas As lipases microbianas são glicoproteínas de peso molecular variando entre 19 e 60 kDa, apresentando em torno de 258 e 544 aminoácidos, dos quais um grande número são hidrofóbicos e responsáveis pela interação entre a enzima e substratos insolúveis em água (Jaeger, 1998; Amaral, 2007). As lipases microbianas apresentam estruturas tridimensionais (3D), na qual as lipases de Rhizomucor miehei e do pâncreas humano foram as primeiras a terem suas estruturasdeterminadas em 1990 (Brady et al, 1990). As lipases microbianas são aquelas que mais se destacam, por apresentarem maior interesse industrial por diversos motivos, entre eles, a grande variedade de micro- organismos produtores. Inclusive, existem diversas lipases microbianas que estão disponíveis comercialmente (Jaeger, 1998; Treichel, 2010), como pode ser visto na Tabela 2. 32 Tabela 2: Algumas lipases microbianas comercialmente disponíveis. Fonte Aplicação Companhia produtora Fungos Candida rugosa Síntese orgânica Amano, Biocatalyst, Boehinger, Sigma, Mannheim Candida antarctica Síntese orgânica Boehinger, Mannheim, Novo Nordisk Thermomyces lanuginosus Aditivos em detergente Boehinger, Mannheim, Novo Nordisk Rhizomucor miehei Processamento de alimentos Novo Nordisk, Amano, Biocatalyst Bactérias Burkholderia cepacia Síntese orgânica Amano, Fluka, Boehriner, Boehringer Pseudomonas alcaligenes Aditivos em detergente Genecor Pseudomonas mendocina Síntese orgânica Genecor Chromobacterium viscosum Síntese orgânica Asahi, Biocatalyst Fonte: Jaeger, 1998 e Reetz, 2006 As lipases microbianas ainda se destacam por não serem sujeitas a efeitos sazonais, os micro-organismos produtores serem de fácil manipulação genética e possuírem pequeno tempo de geração, poder apresentar seletividade frente ao substrato e, na maioria dos casos, são produzidas extracelularmente, o que facilita sua obtenção (Treichel, 2010). Entre os micro-organismos produtores de lipases, estão as bactérias (Jaeger, 1999), as leveduras (Muralidhar, 2001), os fungos filamentosos (Elibol, 2002) e os actinomicetos (Sztajer, 1988). As leveduras apresentam uma série de vantagens frente às outras fontes microbianas, como por exemplo, menor tempo de geração e melhor adaptação a longos tempos de processos. Além disso, são geneticamente mais estáveis do que as bactérias e não são patogênicas (apresentam GRAS Status; Generally Recognized as Safe), o que permite que os produtos obtidos por estes micro-organismos sejam mais aceitos nos setores alimentícios (Pereira-Meireles, 1997). As lipases microbianas são enzimas que apresentam elevado potencial biotecnológico, pois catalisam a hidrólise de uma ampla variedade de lipídios (TAGs) para formar outras classes lipídicas, como os DAGs, MAGs, AGLs e glicerol, que nesta reação ocorre na interface lipídio/água. As lipases microbianas, no geral, possuem a característica de promover as reações de síntese reversa, além das reações de hidrólise, em ambientes 33 micro-aquosos. Diante desses aspectos, as lipases são consideradas excelentes biocatalisadores em modificações lipídicas (Bornscheuer, 2002). Além do âmbito nutricional e alimentício, as lipases microbianas também têm aplicações promissoras na indústria de detergentes, removendo resíduos gordurosos, como também sua aplicação na indústria farmacêutica, que foi um dos setores que mais beneficiou o avanço dos estudos da utilização de lipases (Hemachander, 2000). Além disso, uma promissora aplicação das lipases reside na produção de Biodiesel, que são ésteres metílicos de ácidos graxos, que consiste em um combustível biodegradável, não tóxico, de combustão limpa, produzido de fontes renováveis (Marchetti et al, 2007). 34 2. LIPASE DE Yarrowia lipolytica Yarrowia lipolytica é um micro-organismo estritamente aeróbico, eucariótico, do reino Fungi, pertence à classe dos Ascomicetos e subclasse Hemiascomicetos. Foi originalmente classificada como Candida lipolytica e depois reclassificada como Endomycopsis lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica e, finalmente, Yarrowia lipolytica (Barth, 1997). É geralmente isolada, principalmente, de meios contendo fonte de carbono lipídica, tais como ambientes poluídos, como a Baía de Guanabara (Haegler, 2001). Y. lipolytica apresenta naturalmente diformismo, apresentando a habilidade de alternar, reversivelmente, entre duas formas morfológicas (células ovoides e hifas bastante alongadas), como é possível observar na Figura 5 (Szabo, 2002). Figura 5: Observação em microscópio de células de Y. lipolytica (Szabo, 2002). Y. lipolytica pertence ao grupo das leveduras “não convencionais” e é a espécie mais estudada deste grupo. Por pertencer a este grupo, é bastante diferente dos modelos celulares das leveduras “convencionais”, que são as espécies mais estudadas, como a Saccharomyces cerevisiae. A principal diferença entre os grupos é em relação a morfologia, para o primeiro grupo, a presença de oxigênio que é essencial, fazendo com que a Y. lipolytica seja classificada como aeróbio restrito (Barth, 1997; Flores et al, 2000). Essa levedura apresenta GRAS Status, logo não é patogênica, que proporciona sua aplicação na indústria alimentícia, como por exemplo, no desenvolvimento de flavour de pêssego e ácido cítrico (Tsugawa et al, 1986). Porém sua principal aplicação é na produção de diversas enzimas, como proteasas, esterases, fosfatases e, principalmente, lipases, todas de elevado interesse biotecnológico (Nicaud et al, 2002; Brígida et al, 2014b). A levedura Y. lipolytica IMUFRJ 50682 é isolada do lixo proveniente da Baía de Guanabara. Esta levedura já vem sendo estudada no grupo BIOSE (Biological System 35 Engineering Group) da Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ. Caracterização dos produtos secretados desta levedura, produção de biodiesel, melhores condições para obtenção dos seus produtos secretados e estudo de imobilização de lipases fazem parte do grupo das principais pesquisas desse grupo com essa levedura. As enzimas secretadas por Y. lipolytica se encontram tanto intra quanto extracelular, como também ligada à membrana. Porém, como geralmente ocorre com as lipases microbianas, a Y. lipolytica é capaz de produzir mais lipases extracelulares. A YlLip2 é uma lipase extracelular codificada pelo gene LIP2 e é a lipase majoritariamente produzida. Porém, outras 25 lipases também são secretadas e já foram purificadas e caracterizadas, como por exemplo, a YlLip8 que é uma lipase ligada a membrana e YlLip 1, YlLip 3 e YlLip 6 que são enzimas intracelulares (Brígida et al, 2014b). A lipase secretada a partir do gene LIP2, a YlLip2, apresenta 301 aminoácidos e, recentemente, a configuração 3D da YlLip2 foi revelada e apresentou elevada similaridade com as lipases de outros fungos, como de Rhizomucor miehei e Thermomyces lanuginose (Bordes et al, 2010; Bordes, 2011). A forma de condução do processo de produção de lipases de Y. lipolytica são caracterizados por dois tipos de sistemas: fermentação em meio sólido (FES) e fermentação submersa (FSm). A FES é bastante interessante do ponto de vista econômico, pois tem a possibilidade de aproveitar resíduos agroindustriais. No entanto, apresenta dificuldades em monitorar o processo, além de baixa oxigenação. Kamini et al (1998) estudaram a produção de lipases por Apergillus niger utilizando torta de óleo de gergelim. No estudo de Gombert et al (1999) avaliaram a produção de lipases por Penicillium restrictum utilizando resíduos industriais de óleo de babaçu. A produção de enzimas microbianas em escala industrial se faz majoritariamente por FSm. A fermentação ocorre em um meio fermentativo líquido, em que as fontes de nutrientes utilizadas são solúveis. As técnicas de cultivo submerso têm se beneficiado dos avanços da instrumentação e controle de processos, uma vez que são utilizados biorreatores, proporcionando maior controle no processo e maior produção de lipases. Os biorreatores proporcionam condições controladas, como o controle na agitação, temperatura e vazão de oxigênio. Apesar de o custo ser maior em comparação com a FES devido a utilização desses biorreatores, a relação custo/benefício no final fica menor, uma vez que há biorretores de diversostamanhos proporcionando a produção de lipases em escala industrial (Feitosa, 2009). As Figuras 6 e 7 apresentam biorreatores de nível de bancada, com capacidade de 2 L e 3 L, respectivamente, produzindo extrato enzimático rico em lipases, pela FSm, pela Y. lipolytica. 36 Figura 6: Biorreator de capacidade de 2 L utilizado na produção de lipase de Y. lipolytica por fermentação submersa. Figura 7: Biorreator de capacidade de 3 L utilizado na produção de lipase de Y. lipolytica por fermentação submersa. 37 As lipases podem ser utilizadas na sua forma livre e imobilizada, na qual a forma imobilizada apresenta um grande interesse industrial devido suas vantagens. A imobilização da lipase pode conferir maior termoestabilidade a lipase, maior separação com os produtos formados, permite o reaproveitamente da lipase, entre outros fatores. Os métodos de imobilização de enzimas podem ser por encapsulamento ou por ligação. O método por encapsulamento pode ser em matriz ou em membranas, que é divida em microencapsulamento e entre membranas macroscópicas. O método por ligação pode ser por adsorção ou por ligação covalente, que é dividida em ligação no suporte ou ligação cruzada entre as enzimas (IUPAC, 1995). O grupo BIOSE já investigou a imobilização da lipase de Y. lipolytica, como no caso do estido de Brígida (2010) que investigou a imobilização por adsorção e ligação covalente pelo reaproveitamento da fibra da casca de coco verde como suporte. Já em outro estudo do mesmo grupo (Rios, 2014), investigaram a imobilização da lipase de Y. lipolytica por adsorção em hidróxido duplo lamelar. Atualmente, em parceria com a professora Finotelli, P. da Faculdade de Farmácia da UFRJ, o grupo está investigando a imobilização por adsorção da lipase em nanopartículas magnéticas de Fe2O3, assim como a caracterização desta enzima imobilizada em relação a sua estabilidade em diferentes temperaturas e pH, eficiência da imobilização e atividade hidrolítica. Embora a lipase de Y. lipolytica seja uma potente lipase microbiana, estudos sobre a sua caracterização em relação a seletividade frente ao substrato é escassa. Recentes trabalhos abordaram quanto à regiosseletividade desta lipase em reações de hidrólise, porém nenhum deles apresentou esta caracterização com detalhes. Casas-Godoy et al (2014) avaliaram a regiosseletividade da lipase extracelular de Y. lipolytica (YlLip2) em reações de hidrólise e apresentou considerável tiposseletividade para o DHA em óleos de atum, em comparação com as lipases comerciais de Candida rugosa e Thermomyces lanuginosus, mostrando ser eficaz no processo de purificação deste ácido graxo. Kumari (2012) e Kamoun et al (2015) abordaram a atividade lipolítica da YlLip8, lipase ligada à membrana, em padrões de TAGs com AGCC, ácidos graxos de cadeia média (AGCM) e AGCL. A lipase não apresentou regiosseletividade em reações de hidrólise desses TAGs. Adicionalmente, não há nenhum estudo que avalie o comportamento da lipase de Y. lipolytica em reações de síntese reversa, tanto para a sua caracterização da regiosseletividade como também na preferência em esterificar um tipo específico de ácido graxo. Entretanto, é muito provável que a lipase extracelular (YlLip2) de Y. lipolyica apresente a caracterização frente ao substrato bastante semelhante a lipase de Rhizomucor miehei (Lipozyme-IM), fortemente 1,3-regiosseletiva e tiposseletiva, preferencialmente, 38 para alguns AGS isolados e AGs insaturados (AGIs), em reações de hidrólise e síntese reversa. Isso devido a configuração 3D da YlLip2 apresentar expressiva similaridade com essa lipase (Bordes et al, 2010; Bordes, 2011). Por esta lipase apresentar ser uma potente lipase microbiana, torna-se interessante um estudo mais aprofundado quanto a esta seletividade tanto em hidrólise, como também em reações se síntese reversa. 39 3. APLICAÇÕES DE LIPASES EM MODIFICAÇÕES LIPÍDICAS O grande interesse na produção de lipases microbianas tem crescido nas últimas décadas devido ao seu largo potencial em aplicações industriais. Pesquisadores e indústrias estão cada vez mais interessados nos processos enzimáticos, visando diminuição de custos de processo, diminuição de resíduos e subprodutos oriundos de rotas químicas e, principalmente, obtenção de novos e mais saudáveis produtos que atendam as necessidades do mercado consumidor (Akanbi, 2015). As enzimas relacionadas a alimentos constituem o maior segmento de enzimas industriais (World Enzymes, 2011). Uma das principais atividades das lipases utilizadas em indústrias de alimentos é na produção de AGs, responsáveis pelo desenvolvimento do aroma e sabor, principalmente de queijos (Akin et al, 2003). Esta característica é muito bem explorada pela indústria de laticínios pela atuação das lipases na hidrólise da gordura do leite, gerando AGLs que são marcantes para a produção das características específicas do flavour do queijo em questão (Hasan, 2006). Entretanto, desde algumas décadas até hoje, o mercado promissor das lipases está focado na modificação de lipídeos, aumentando o valor comercial e nutritivo desses alimentos (Undurraga et al, 2001; Bednarski, 2003; Kanjilal et al, 2013). As lipases microbianas são utilizadas na purificação de óleos, como por exemplo, na obtenção de ácidos graxos poli-insaturados (AGPIs) a partir de óleos vegetais, que apresentam propriedades físico-químicas benéficas à saúde. Estes AGs podem ser utilizados como aditivos alimentares, bem como na produção de leites e derivados, biscoitos, pães e óleos enriquecidos (Belarbi, 2000). Estudos já isolaram AGs de interesse nutricional, como o ácido α-linolênico e o DHA, para serem implementados em outros óleos que não contenham estes ácidos graxos em sua composição (Casas-Godoy et al, 2014). No entanto, é sabido que as propriedades funcionais dos óleos estão diretamente relacionadas com o seu perfil de TAGs e também de antioxidantes. As características físicas e propriedades nutricionais dos óleos dependem da composição dos seus AGs, além de suas localizações nas posições sn-1, 2 ou 3 na molécula de glicerol (Lísa, 2008). Com isso, o mercado de lipases para a modificação de óleos e gorduras para síntese de novos lipídios com propriedades desejáveis é de extremo interesse, pois além de essas enzimas promoverem reações que são consideradas renováveis, elas são altamente seletivas e específicas na produção destes compostos (De Lima, 2013). As lipases podem proporcionar, com sucesso, a produção de lipídios estruturados, ou TAGs estruturados (TAGs-ES), que 40 são novos TAGs com composição de AGs e/ou localização dos AGs diferenciada em comparação com os TAGs de origem. Estes novos óleos são ditos como a nova geração de lipídios, sendo considerados como alimentos funcionais (Akoh, 2002; Bednarski, 2003; Combon, 2008). Devido a todas essas características apresentadas sobre as lipases, principalmente as microbianas, torna-se cada vez mais interessante a utilização dessas enzimas como biocatalisadores na produção de novos lipídios, em função de sua alta seletividade catalítica e potencial adequação do processo como tecnologia renovável (De Lima, 2013). Portanto, a caracterização da seletividade das lipases frente ao substrato que, anteriormente ainda não foi realizada, pode expandir as aplicações biotecnológicas da enzima, podendo ser efetivamente utilizada na customização de óleos e, consequentemente, agregando maior valor às lipases microbianas. 41 4. LIPÍDIOS NA NUTRIÇÃO HUMANA Lipídios são biomoléculas derivadas química ou bioquicamente de AGs que, por sua vez, são ácidos monocarboxílicos de cadeia aberta, em geral linear e de cadeia par, que podem ser saturados ou apresentar uma ou mais ligações duplas. As classes químicasde lipídios são variadas e incluem AGs e seis ésteres, esteroides, terpenos, isoprenoides, entre outros compostos que tendem a apresentar elevada solubilidade em solventes orgânicos, tais como éter, clorofórmio e acetona, e baixa solubilidade em água (Christie, 2010). Os óleos vegetais, juntamente com a gordura animal, consistem em uma das principais fontes de lipídios na alimentação humana, são basicamente constituídos por TAGs. Os TAGs são mais comumente formados por AGs com 12, 14, 16 e/ou 18 átomos de carbono (C), embora AGs com menor ou maior número de C sejam encontrados em óleos vegetais. Devido à enorme variedade de AGs, fica evidente que os óleos são compostos de muitos tipos de TAGs, variando na composição em AGs (Tabela 3, Lísa, 2008) e nas posições às quais estão esterificados ao glicerol. Tabela 3: Composição média dos ácidos graxos majoritários em alguns dos óleos vegetais com alta produção mundial. Ácidos graxos Conteúdo (g/ 100g) nos óleos Oliva Soja Girassol Canola Amendoim 16:0 7,50 – 20,0 8,00 – 13,5 3,60 – 6,00 1,50 – 6,00 8,00 – 14,0 18:0 0,50 – 5,00 2,00 – 5,40 0,90 – 4,00 0,50 – 3,10 1,00 – 4,50 18:1n-9 55,0 – 83,0 17,0 – 30,0 14,0 – 39,4 50,0 – 60,0 35,0 – 69,0 18:2n-6 3,50 – 21,0 48,0 – 59,0 48,3 – 74,0 11,0 – 23,0 12,0 – 43,0 18:3n-3 0,10 – 0,50 4,50 – 11,0 ND – 0,30 5,00 – 13,0 ND – 0,3 Fonte: Codex Alimentarius, 1981; Codex ALimentarius, 1999. Os TAGs da dieta têm importante papel como fonte de energia (9 Kcal/g), são fonte de AGs essenciais (linoleico e linolênico), consistem na principal fonte de AGIs para o organismo que terão importante papel estrutural nos lipídios de membranas celulares, são veículos para absorção de vitaminas lipossolúveis e outros compostos não polares, entre outros. No organismo humano, a maior reserva de energia se localiza no tecido adiposo subcutâneo na forma de TAGs (Gusntone, 2006; McClements, 2010). Além dessas funções, as funcionalidade das gorduras e dos óleos vegetais está relacionada com a composição dos TAGs, no que diz respeito aos AGs em cada molécula 42 desses lipídios somado à sua distribuição posicional no glicerol, que são representadas pelo sistema de numeração estereoespecífica (stereospecific numbering, sn) sn-1, 2 e 3 (Senanayake, 2005; Lísa, 2008). As posições sn-1 e sn-3 designam as mais externas (ésteres primários) no TAG e sn-2 a posição central (éster secundário). A posição de esterificação do AG no glicerol influencia diretamente na sua absorção no trato gastrointestinal, no metabolismo dos enterócitos e quilimícrons e, consequentemente, na sua distribuição nos tecidos (Senanayake, 2005; Gunstone, 2006). Os TAGs ingeridos pela dieta são emulsinonados pela ação dos sais biliares, fosfolipídios da dieta e AGLs e MAGs formados pela hidrólise de TAGs no duodeno. A formação desse sistema disperso, emulsionado, provoca a ativação da lipase pancreática, que é a principal enzima responsável pela hidrólise de TAGs da dieta. Esta lipase atua na interface óleo/água, hidrolisando TAGs em AGLs e MAGs. Eventualmente, são formados micelas mistas, ricas em compostos anfipáticos e pobres em TAGs e outros lipídios neutros, que se desprendem das gotas de lipídios maiores e são suficientemente pequenas e polares para aproximar da membrana dos enterócitos, permitindo a absorção de compostos lipofílicos. Os AGs em sn-1 e 3 dos TAGs são hidrolisados preferencialmente pela lipase pancreática (regiosseletiva), formando AGLs e 2-MAGs, prontamente absorvíveis pelos enterócitos. Portanto, os AGs em sn-2 nos TAG originais, que em geral são insaturados, são absorvidos como MAGs e tenden a ser dirigidos nos enterócitos para a síntese de fosfolipídios, que são, por sua vez, preferencialmente captados pelo fígado no período pós- prandial (Hunter, 2001). Dessa forma, os AGs em sn-2 nos TAGs da dieta têm um papel importante em direcionar AGs insaturados para lipídios estruturais no organismo. Portanto, AGCLs esterificados na posição sn-2 do TAG são melhor absorvidos e direcionados metabolicamente. Além disso, AGCL na forma livre interagem mais facilmente com cátios divalentes, como o cálcio, tornando-se insolúveis no meio alcalino do intestino e, portanto, menos biodisponíveis (Hunter, 2001; Gunstone, 2006). O tipo de AG nas posições sn-1 e sn-3 do TAG irá influenciar sua dispersabilidade nas micelas mistas e, portanto, pode interferir na facilidade de absorção dos lipídios. Por exemplo, TAG composto por AGCM nas posições externas (sn-1 e sn-3) do TAG são facilmente absorvíveis no trato gastroentérico, por diversos fatores. Os AGCM nessas moléculas de TAG podem ser hidrolisados pela lipase gástrica, além da pancreática, acelerando a absorção. Além disso, TAG com AGCM em sn-1 e sn-3 podem ser absorvidos diretamente, sem hidrólise prévia e transferidos para a corrente sanguínea, onde se ligam à albumina, e são transportados até o fígado através da veia porta. Portanto, TAGs contendo 43 AGCM nas posições externas podem ser usados como fonte rápida de energia em algumas síndromes absortivas, como por exemplo, na deficiência de enzima pancreática (Berry, 2007). Na Figura 8, é possível observar uma apresentação resumida de oito etapas que compõe o processo digestivo e absortivo de lipídios provenientes da alimentação. Figura 8: Apresentação resumida de oito etapas que compõe o processo de digestão e absorção de lipídios provenientes da alimentação (Nelson, 2002). No enterócito jejunal, AGLs e 2-MAGs são convertidos a TAGs e fosfolipídios, que juntamente a outros compostos, tais como colesterol, vitaminas lipossolúveis, entre outros, formam lipoproteínas denominadas de quilimícrons. Os quilomícrons não entram no sangue portal, pois são demasiadamente grandes para penetrar nos capilares intestinais e, portanto, são transportados em princípio pela circulação linfática. Os TAGs nos quilomicrons circulantes são hidrolisados pela lipase lipoproteínas na parede do endotélio vascular, no tecido adiposo subcutâneo. A hidrólise dos TAGs e captação dos AGs produzidos aumentam a densidade dessas lipoproteínas que eventualmente, como quilimícrons remanescentes, são captados pelo fígado (Berry, 2007). O conhecimento desses processos de absorção e metabolismo pós-prandial de lipídios dietéticos tem estimulado a investigação da distribuição de AGs na molécula de 44 TAG, assim como sua alteração por vias tecnológicas para a produção de lipídios estruturados. Grande parte dessa motivação dirige para os lipídios que apresentam funcionalidade nutricional agregada, pois podem atuar na prevenção e/ou tratamento de diversas enfermidades (Berry, 2007). 4.1 Ácidos graxos insaturados Os óleos vegetais, que são utilizados como alimentos, são amplamente consumidos no mundo, pois são as principais fontes lipídicas da dieta (USDA, 2015). A atração da população pelo consumo dos óleos vegetais está relacionada, principalmente, ao baixo custo, com os ácidos graxos insaturados (AGIs) e com os compostos polares bioativos, como os compostos fenólicos, por exemplo. Os óleos vegetais são basicamente constituídos por TAGs, que apresentam 3 moléculas de AGs esterificados na molécula de glicerol. A presença de insaturações na molécula dos AGs permite classificar os AGs em monoinsaturados (AGMI) e poli-insaturados (AGPI; mais de uma dupla ligação). Aquele AG que não apresenta nenhuma insaturação é denominado de saturado (AGS). Entretanto, os óleos vegetais apresentam, predominantemente, TAGs com AGIs, logo os óleos são ditos como fonte de AGCL com insaturações em sua molécula. Alguns óleos, como o azeite de oliva e o óleo de amendoim, apresentam com destaque os AGMI (ácido oleico, 18:1n-9, principalmente), porém em outros óleos, como a soja e o girassol, destacam-se os AGPIs (ácidos linoleico, 18:2n-6, e linolênico,