Emilia-Akil-Tese

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
Lipase de Yarrowia lipolytica: caracterização da 
seletividade na hidrólise e produção de lipídios 
estruturados de interesse nutricional 
 
Emília Akil 
 
 
 
 
 
 
 
 
2016 
 
 
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Lipase de Yarrowia lipolytica: caracterização da 
seletividade na hidrólise e produção de lipídios 
estruturados de interesse nutricional 
Emília Akil 
 
 
 
 
 
 
Orientadores: Alexandre Guedes Torres 
Priscilla Filomena Fonseca Amaral 
 
 
 
Rio de Janeiro 
Fevereiro, 2016 
 
Tese de Doutorado apresentada ao Programa 
de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, 
Instituto de Química, da Universidade Federal 
do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do título de Doutor em 
Ciência de Alimentos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 Akil, Emília. 
 Lipase de Yarrowia lipolytica: caracterização da seletividade na 
hidrólise e produção de lipídios estruturados de interesse 
nutricional/ Emília Akil. Rio de Janeiro: UFRJ/IQ, 2016. 
 136 f.:il. 
 
 
 Orientadores: Alexandre Guedes Torres, Priscilla Filomena 
Fonseca Amaral. 
 
 
 Tese (Doutorado em Ciências) – Universidade Federal do Rio 
de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em 
Ciência de Alimentos, 2016. 
 
 
 1. Lipases. 2. Lipase de Yarrowia lipolytica. 3. 
Regiosseletividade. 4. Tiposseletividade. 4. Lipídios estruturados. I. 
Torres, Alexandre Guedes. (Orient). II. Amaral, Priscilla Filomena. 
(Orient). III. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de 
Química. Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos. V. 
Título 
CDD: 668.001 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
 
 
Lipase de Yarrowia lipolytica: caracterização da 
seletividade na hidrólise e produção de lipídios 
estruturados de interesse nutricional 
 
Emília Akil 
Orientadores: Alexandre Guedes Torres 
Priscilla Filomena Fonseca Amaral 
 
 
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, 
Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos. 
Aprovada por: 
 
 
_______________________________________ 
Prof. Alexandre Guedes Torres 
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ 
 
_______________________________________ 
Profa. Maria Alice Zarur Coelho 
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ 
 
_______________________________________ 
Profa. Priscilla Vanessa Finotelli 
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ 
 
_______________________________________ 
Profa. Maria Aparecida Bismara Reginato d’Arce 
Universidade de São Paulo – USP 
 
_______________________________________ 
Profa. Vanessa Naciuk Castelo Branco 
Universidade Federal Fluminense – UFF 
 
 
Fevereiro, 2016. 
 
 
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Dedicatória: 
A minha mãe, meu exemplo de caráter, de amor 
incondicional. 
 
 
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AGRADECIMENTOS 
 
Não poderia deixar de relatar meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que de alguma 
forma contribuíram para a elaboração desta tese. 
 
É impossível começar os agradecimentos sem, primeiramente, referir-se a Deus, pois para 
mim é a base de tudo nesta vida. A razão de existir simplesmente não há sentindo sem a 
presença e a crença de sua força. Uns dizem que ciência e força universal são antônimas, 
mas a meu ver um depende do outro, vivendo em uma simbiose constante. Graças na fé 
desta força espiritual que eu consigo crer na ciência. 
 
Gostaria de agradecer ao meu orientador professor Alexandre Torres, que por muitas vezes 
teve mais atitudes de amigo que orientador. Sem a sua confiança depositada a mim, eu não 
teria conseguido conquistar todos os meus objetivos. Obrigada por todos os ensinamentos, 
pela paciência, e por todas as conversas e conselhos. 
 
Credito este trabalho especialmente a minha querida co-orientadora Priscilla Amaral. 
Obrigada por proporcionar minha introdução a este mundo mágico das lipases. Impossível 
não deixar de agradecer pela sua paciência e companheirismo, por me ajudar em todas as 
vezes que me deparei com todas as dúvidas que tive sobre o mundo destes “bichinhos” 
chamados leveduras. 
 
Agradeço ao pesquisador Pierre Villeneuve, por me aceitar em sua equipe na França e 
permitir que eu vivenciasse momentos muito prazerosos, tanto no âmbito profissional como 
pessoal, em um lugar tão incrível. Seus ensinamentos foram de fundamental importância 
para meu amadurecimento em seguir com este trabalho. Agradeço também a Jérôme 
Lecomte, pela sua dedicação e gentileza em me ajudar na execução do meu trabalho na 
bancada e também pela grande paciência em responder todas as minhas dúvidas sem perder 
a simpatia em sua pessoa. Por fim, agradeço aos técnicos Bruno Bárea e Nathalie Barouh 
por todas as ajudas naqueles momentos em que tive dificuldade em executar as análises, 
assim como estarem sempre com muita simpatia em me receber. 
 
 
 
vii 
 
 
 
Esta pesquisa também não poderia chegar até aqui sem a presença dos meus amigos do 
LBNA, da família LBNA, melhor dizendo. Impossível evoluir sem suas risadas, piadas e 
momentos de descontração. E claro, naqueles momentos de aperto onde o trabalho de um 
torna-se trabalho de muitos e acontece uma ajuda mútua! Obrigada Aline, André, Ellen, 
Fabrício, Genilton, Kim, Laís, Nathália, Nívea, Suellen, Vanessa Di Sarli e Tamirys. E 
também, aos mais novos que chegaram ao LBNA, Camila, Isabele e Yuri. Claro que não 
podia faltar a Júlia, minha secretária favorita. 
 
Aos professores Daniel Perrone, Vanessa Naciuk, Juliana Nunes e Mariana Monteiro pela 
troca de experiência e sugestões, especialmente durante as apresentações dos seminários do 
LBNA. 
 
Não posso deixar de agradecer as amigas Rosely Lopes e, principalmente, a Tamires 
Carvalho. Obrigada por toda ajuda e paciência na produção da lipase, assim como na 
medição da atividade e todas outras tarefas que vocês me ajudaram a executar. Com certeza 
sem a ajuda de vocês meu caminho seria bem mais árduo! 
 
Gostaria de agradecer as professoras que aceitaram em fazer parte da banca examinadora. 
Seus conhecimentos e experiências são cruciais para o melhor fechamento deste trabalho. 
 
A minha família, especialmente minha mãe e meu pai, pelo amor e educação que me 
fornecem desde 1983. O meu caráter é fruto do exemplo de vocês. Meu carinho, meu amor 
por vocês são, simplesmente, incondicionais. Obrigada pelos seus incentivos contínuos à 
minha carreira, pelo orgulho declarado e pelo exemplo de busca ao crescimento profissional 
e pessoal. 
 
Aos meus amigos que estiveram presentes comigo ao longo desta trajetória, nos momentos 
felizes e de descontração, como também naqueles conturbados, e pela compreensão nas 
minhas ausências. Obrigada Angélica, Caio, Débora, Denis, Fabio Oliveira, Fábio Rosa, 
Rafael, Rodrigo, Samyr, prima Aurélia, enfim, a todos os amigos e amigas que não ousarei 
em citar os nomes. 
 
Agradeço em especial a grande amiga Thaís. Sem os seus conselhos, companheirismo, 
amizade, honestidade e paciência eu jamais estaria aqui agora. Ao Wolverine, meu gatinho 
 
 
viii 
 
 
 
peludinho que chegou à minha vida há pouco tempo, com o seu ronronar que me conforta a 
cada dia, fazendo companhia nas longas horas que despendi na escrita desta tese. 
 
E claro, não poderia faltar minha enorme gratidão a “ela”, a protagonista deste trabalho, a 
Yarrowia lipolytica. Obrigada por ser a causadora da existência deste estudo, por me 
fornecer tantos resultados positivos em absolutamente tudo que fiz. 
 
Por ultimo e não menos importantes, as agências financiadoras FAPERJ, CAPES e CNPq.ix 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Lute com determinação, abrace a 
vida com paixão, perca com classe 
e vença com ousadia, porque o 
mundo pertence a quem se atreve e 
a vida é muito bela para ser 
insignificante.” 
Charles Chaplin 
“Nada na natureza se cria, nada se 
perde, tudo se transforma.” 
 
Antoine Lavoisier 
 
 
 
x 
 
 
 
RESUMO 
Akil, Emília. LIPASE DE Yarrowia lipolytica: CARACTERIZAÇÃO DA SELETIVIDADE NA 
HIDRÓLISE E PRODUÇÃO DE LIPÍDIOS ESTRUTURADOS DE INTERESSE NUTRICIONAL. Rio de 
janeiro, 2016. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, 
Universidade Federal do Rio de Janeiro. 
 
As lipases microbianas apresentam potente habilidade na modificação lipídica e atraem grande 
interesse em pesquisas e aplicações biotecnológicas. As aplicações de lipases estão intimamente 
relacionadas com a sua seletividade frente ao substrato: a regiosseletividade e a tiposseletividade. 
Uma interessante aplicação das lipases é na síntese de lipídios estruturados, que são triacilgliceróis 
(TAGs) modificados por meio de reações de síntese reversa, pela incorporação ou mudanças na 
posição no glicerol (sn-1/2/3) de ácidos graxos (AGs) de interesse nutricional. No presente trabalho 
foi investigada a regio- e tipo-seletividade da lipase de Y. lipolytica na forma livre e imobilizada em 
nanopartículas magnéticas em hidrólise e a produção de lipídios estruturados com AGs bioativos por 
reação de acidólise e, consequentemente, a caracterização de sua regiosseletividade nesta reação. 
Para análise da regiosseletividade, foram escolhidos TAG homogêneo (trioleína) e TAGs 
heterogêneos de óleos vegetais. A tiposseletividade das lipases de Y. lipolytica foi determinada em 
relação ao tamanho de cadeia e número de insaturações de ésteres etílicos de ácidos graxos (EEAGs) 
em reações de hidrólise. Os substratos para a produção dos lipídios estruturados foram a trioleína e 
TAGs do azeite de oliva e ácidos graxos livres de cadeia média (AGCM) cáprico (C10:0) e láurico 
(C12:0) em acidólise. Após reação de hidrólise, por 5, 10, 15 e 30 minutos, ambas as lipases (livre e 
imobilizada) apresentaram elevadas atividades hidrolíticas em trioleína e triacilgliceróis de óleos 
vegetais nos primeiros minutos de reação. Utilizando a lipase livre como biocatalisador, mais de 
55% dos (TAGs) da trioleína e do azeite de oliva foram hidrolisados em apenas 5 minutos. As 
hidrólises catalisadas pela lipase imobilizada foram mais lentas, apresentando, aproximadamente, 
60% de hidrólise dos TAGs somente em 30 minutos de reação. Foi observado forte 1,3-
regiosseletividade para a lipase livre, a partir da razão entre os diacilgliceróis (DAG), 1,2(2,3)-DAG 
e 1,3-DAG, analisados por Thin layer chromatography (TLC). Durante toda a reação de hidrólise, a 
razão 1,2(2,3)-DAG/1,3-DAG foi de 49 (98/2) utilizando a lipase livre, e de 99 em 5 minutos (99/1) 
e 49 em 30 minutos (98/2) para a imobilizada. Isto significa que ambas lipases tiveram preferência 
por hidrolisar os ácidos graxos esterificados nas posições sn-1 ou sn-3 comparados àqueles da 
posição sn-2 do TAG. A lipase livre de Y. lipolytica também mostrou-se estritamente sn-1,3 
regiosseletiva em misturas heterogêneas de triacilgliceróis em matrizes complexas. Para a lipase 
imobilizada, no entanto, os resultados indicaram não-seletividade para os óleos mais complexos e 
baixa sn-1,3-regiosseletividade para o azeite de oliva. Nenhuma das lipases mostrou 
tiposseletividade para AGs saturados (AGSs), no entanto ambas lipases apresentaram 
tiposseletividade para AGs insaturados de cadeia longa (AGCL), especialmente para C18:2. Porém, a 
tiposseletividade da lipase imobilizada pareceu ter um perfil mais fraco em comparação com a lipase 
livre. A produção de triacilgliceróis estruturados (TAG-ES) foi bem sucedida, apresentando em torno 
de 31% de C10:0 e C12:0 na posição sn-1,3 do TAG proveniente do azeite de oliva em apenas 15 
minutos de reação utilizando a lipase livre de Y. lipolytica. Isto mostra que a lipase também 
apresentou sn-1,3 regiosseletividade em reações de acidólise, além de ter produzido TAG-ES 
enriquecidos com AGCM nas posições externas e ácido oleico na posição central do TAG. O 
comportamento foi similar utilizando o TAG modelo (trioleína). Conclui-se que esses resultados 
indicam que as lipases de Y. lipolytica apresentam-se como potenciais biocatalisadores de interesse 
tecnológico destinados à customização de lipídios com interesse nutricional. 
 
 
xi 
 
 
 
ABSTRACT 
Akil, Emília. Yarrowia lipolytica LIPASE: SELECTIVITY CHARACTERIZATION IN HYDROLYSIS 
AND STRUCTURED LIPIDS PRODUCTION OF NUTRITIONAL INTEREST. Rio de Janeiro, 2016. 
Thesis (Doctor of Science, D.Sc.). Chemistry Institute, Federal University of Rio de Janeiro. 
Janeiro. 
The microbial lipases feature potent lipid modification skills and attract great interest in research and 
biotechnological applications. The applications of lipases are closely related to its selectivity towards 
the substrate: the regioselectivity and the typoselectivity. An interesting application of lipase is in the 
synthesis of structured lipids, which are triacylglycerols (TAGs) modified by reverse synthesis 
reactions, by incorporation or changes in position on the glycerol (sn-1/2/3) in fatty acids (AGs) of 
nutritional interest. In this study was investigated the regio-and type-selectivity of lipase from Y. 
lipolytica in free and immobilized form on magnetic nanoparticles in hydrolysis and the production 
of structured lipids with bioactive AGs for acidolysis reaction and, consequently, the characterization 
of their regioselectivity in this reaction. For analysis of regioselectivity, were chosen TAG model 
(triolein) and TAGs heterogeneous from vegetable oils. The typoselectivity of free and immobilized 
lipase from Y. lipolytica was determined in relation to the chain length and number of unsaturation of 
ethyl esters of fatty acids (EEAGs) acidolysis reactions at 15, 30, 60 and 180 minutes. The substrates 
for the production of structured lipids were the triolein and TAGs of the olive oil and medium-chain 
free fatty acids (MCFA) capric (C10:0) and lauric (C12:0). After hydrolysis reaction, during 5, 10, 
15 and 30 minutes, in both lipases (free and immobilized) as biocatalysts, showed high hydrolytic 
activity on triolein and triacylglycerols of vegetable oils in the first few minutes of reaction. Using 
the free lipase as biocatalyst, more than the 55% of (TAGs) of triolein and olive oil were hydrolyzed 
in just 5 minutes. The hidrolysis catalyzed by immobilized lipase were slower, showing 
approximately 60% of hydrolysis of the TAGs only in 30 minutes of reaction. It was observed strong 
1.3-regioselectivity for lipase free, since the ratio between the classes diacylglycerol (DAG) – 
1,2(2,3)-DAG and 1,3-DAG – analized by TLC. Throughout the hydrolysis reaction, the ratio of 
1,2(2,3)-DAG/1,3-DAG was 49 (98/2) using free lipase, and of 99 in 5 minutes (99/1) and 49 in 30 
minutes (98/2) to the immobilized. This means that both lipases had preference for hydrolyze the 
esterified fatty acids in position sn-1 or sn-3 compared to those of the sn-2 position of the TAG. The 
free Y. lipolytica lipase is strictly sn- 1,3 regioselective in heterogeneous mixtures of triacylglycerols 
in complex matrices. For the lipase immobilized the results indicate non-selectivity for the most 
complex oils and low sn-1,3-regioselectivity for olive oil. None of the lipase showed typoselectivity 
to AGs saturated (AGSs), however both lipases presented typoselectivity to long chain unsaturated 
AGs (AGCL), especially to C18:2. However, the typoselectivity immobilized lipase appeared to be 
weaker in comparison to the free lipase. The production of structured triacylglycerols (TAG-ES) was 
successful, showing around 31% of C10:0 and C12:0 in position sn-1,3 of the TAG from the oliveoil 
in just 15 minutes of reaction using free lipase of Y. lipolytica. This shows that the lipase also 
presented sn-1,3 regioselectivity in acidolysis reactions, in addition to having produced TAG-ES 
enriched with MCFA in external positions and oleic acid in the central position of the TAG. The 
behavior was similar using the model TAG. As a homogeneous TAGs, it was possible to calculate 
the efficiency of incorporation on triolein (in mol% relative to the number of moles of sn-1,3 in 
glycerol), which was 24 and 34% in 15 min, with molar ratio of 1:2 of TAG:AG. It was concluded 
that these results indicate that the Y. lipolytica lipases presents as biocatalyst of potential 
technological interest of lipids intended for customization of interest nutrition. 
 
 
 
xii 
 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
CAPÍTULO 1 
Figura 1 Representação esquemática da reação de hidrólise e de síntese reversa 
catalisada pela lipase. 
 
24 
Figura 2 Representação esquemática das reações de hidrólise, acidólise e 
transesterificação e catalisada por lipases. 
 
26 
Figura 3 Representação esquemática das reações de hidrólise catalisadas por 
lipases do tipo não-seletiva e 1,3-regiosseletiva. 
 
28 
Figura 4 Ilustração apresentando a 1,3-regiosseletividade da lipase em reação de 
hidrólise e acidólise. 
 
29 
Figura 5 Observação em microscópio de células de Y. lipolytica. 
 
34 
Figura 6 Biorreator de capacidade de 2 L utilizado na produção de lipase de Y. 
lipolytica por fermentação submersa. 
 
36 
Figura 7 Biorreator de capacidade de 3 L utilizado na produção de lipase de Y. 
lipolytica por fermentação submersa. 
36 
Figura 8 Apresentação resumida de oito etapas que compõe o processo de 
digestão e absorção de lipídios provenientes da alimentação. 
42 
Figura 9 Ilustração de reação de acidólise catalisada por uma lipase 1,3-
regiosseletiva utilizando trioleína e ácidos graxos de cadeia média como 
substratos. 
 
 
51 
CAPÍTULO 2 
Figura 1 Extrato bruto rico em lipases de Y. lipolytica produzido por fermentação 
submersa e este extrato bruto de enzimas liofilizado até tornar-se um pó 
amarelo. 
 
60 
Figura 2 Extrato bruto rico em lipases de Y. lipolytica imobilizado com 
nanopartículas magnéticas de Fe3O4 . 
 
60 
Figura 3 Sequência de equipamentos utilizados para análise em cromatografia em 
camada delgada, iniciando pelo ATS4 e terminando com o scanner 3 
TLC. 
 
 
 
64 
Figura 4 Formação dos produtos gerados pelas hidrólises da trioleína e dos óleos 
vegetais (azeite de oliva e óleos de soja, girassol e canola) catalisadas 
pela lipase livre de Y. lipolytica. Triacilgliceróis ( ), diacilgliceróis ( ), 
69 
 
 
xiii 
 
 
 
ácidos graxos livres ( ) e monoacilgliceróis ( ). 
 
Figura 5 Formação dos produtos gerados pelas hidrólises da trioleína e dos óleos 
vegetais (azeite de oliva e óleos de soja, girassol e canola) catalisadas 
pela lipase imobilizada de Y. lipolytica. Triacilgliceróis ( ), 
diacilgliceróis ( ), ácidos graxos livres ( ) e monoacilgliceróis ( ). 
 
71 
Figura 6 Formação dos produtos gerados pelas hidrólises do óleo de amendoim 
bruto e puro, catalisada pela lipase livre (A e B) imobilizada (C e D) de 
Y. lipolytica. Triacilgliceróis ( ), diacilgliceróis ( ), ácidos graxos 
livres ( ) e monoacilgliceróis ( ). 
 
73 
Figura 7 Formação dos ácidos graxos liberados das hidrólises dos ésteres etílicos 
catalisados pela lipase livre (A e C) e imobilizada (B e D) de Y. 
lipolytica. Ácidos graxos saturados (A e B); ácidos graxos insaturados 
(C e D). 
 
79 
Figura 8 Formação dos ácidos graxos liberados das hidrólises dos ésteres etílicos 
catalisados pela lipase livre (A) e imobilizada (B) de Y. lipolytica. 
 
80 
CAPÍTULO 3 
Figura 1 Sequência de eventos da aplicação das amostras de óleo, hidrolisadas 
pela lipase pancreática, para separação das classes lipídicas (TAG, 
DAG, MAG e AGL) por cromatografia em camada delgada. 
 
93 
Figura 2 Incorporação dos ácidos graxos cáprico (C10:0; A) e láurico (C12:0; B) 
na trioleína (razão molar de 2:1, ácido graxo livre:trioleína) e eficiência 
da incorporação em mol % (relativo ao número de moles de sn-1,3 no 
glicerol) dos ácidos graxos cáprico (C) e láurico (D) na trioleína em 
reações de acidólise catalisadas pela lipase livre de Y. lipolytica. 
 
97 
Figura 3 Incorporação dos ácidos graxo láurico (C12:0; A) na trioleína (razão 
molar 4:1, ácido graxo livre:trioleína) e eficiência da incorporação em 
mol % (relativo ao número de moles de sn-1,3 no glicerol) do ácido 
graxo láurico na trioleína (B) em reações de acidólise catalisadas pela 
lipase livre de Y. lipolytica. 
99 
 
 
 
xiv 
 
 
 
ÍNDICE DE TABELAS 
 
CAPÍTULO 1 
Tabela 1 
 
Caracterização de algumas lipases frente ao substrato em hidrólise e 
reações de síntese reversa. 
 
30 
Tabela 2 Algumas lipases microbianas comercialmente disponíveis. 
 
32 
Tabela 3 Composição média dos ácidos graxos encontrados em alguns dos 
óleos vegetais com alta produção. 
 
40 
Tabela 4 Nomenclatura comum e IUPAC dos ácidos graxos de cadeia média. 
 
 
46 
CAPÍTULO 2 
Tabela 1 
 
Composição de ácidos graxos (g/100 g de total de ácidos graxos) em 
amostras de óleos vegetais. 
68 
Tabela 2 
 
Razão da regio-distribuição de diacilgliceróis (%) após hidrólises 
parciais biocatalisadas com as lipases livre e imobilizada de Y. 
lipolytica e, para comparação, lipase comercial livre de C. rugosa em 
triacilglicerol modelo, após 0 (controle), 5, 10, 15 e 30 minutos. 
 
74 
Tabela 3 
 
Razão da regio-distribuição de diacilgliceróis (%) após hidrólises 
parciais catalisadas com as lipases livre e imobilizadas de Y. 
lipolytica e lipase comercial de C. rugosa (para comparação) em 
amostras de óleos vegetais, após 0 (controle), 5, 10, 15 e 30 minutos. 
 
76 
Tabela 4 Razão da regio-distribuição de diacilgliceróis (%) após hidrólises 
parciais catalisadas com as lipases livre e imobilizadas de Y. 
lipolytica e lipase comercial de C. rugosa (para comparação) em 
amostras de óleo de amendoim bruto e puro, após 0 (controle), 5, 10, 
15 e 30 minutos 
 
78 
Tabela 5 Conteúdo relativo (%) de ácidos graxos livres e ésteres etílicos de 
ácidos graxos* após hidrólises parciais biocatalisadas pelas lipases 
livre e imobilizada de Y. lipolytica. 
 
 
81 
CAPÍTULO 3 
Tabela 1 Distribuição de ácidos graxos em sn-2 e sn-1/3 nos triacilgliceróis 
estruturados (trioleína + C10:0 e trioleína + C12:0). 
 
100 
Tabela 2 
 
Ácidos graxos no azeite de oliva: composição nos lipídios totais, nas 
posições sn-2 (2-MAG) e sn-1/3 nos triacilgliceróis. 
 
101 
Tabela 3 Distribuição de ácidos graxos em sn-2 e sn-1/3 nos triacilgliceróis 
estruturados (azeite de oliva + C10:0 e azeite de oliva + C12:0). 
 
102 
 
 
xv 
 
 
 
LISTA DE ABREVIAÇÕES 
 
2-MAG, 2-monoacilglicerol 
AG, ácido graxo 
AGCC, ácido graxo de cadeia curta 
AGCL, ácido graxo de cadeia longa 
AGCM, ácido graxo de cadeia média 
AGE, ácido graxo essencial 
AGI, ácido graxo insaturado 
AGL, ácido graxo livre 
AGPI, ácido graxo poli-insaturado 
AGS, ácido graxo saturado 
CDD, cromatografia em camada delgada 
CLAE, cromatografia líquida de alta eficiência 
CG, cromatografia em fase gasosa 
DAG, diacilglicerol 
DHA, ácido docosahexaenóico 
DMSO, dimetilsulfóxido 
EEAG, éster etílico de ácido graxo 
ELSD, detector de espalhamento de luz evaporativo 
EMAG, éster etílico de ácido graxo 
EPA, ácido eicosapentaenóico 
FES, fermentação em estado sólido 
FID, detector de ionização em chamas 
FSm, fermentação submersa 
HPLC, high performance liquid chromatography 
HPTLC, high performance thin layer chromatography 
GRAS, Generally Recognize as Safe 
MAG, monoacilglicerol 
p-NFL, paranitrofenol laurato 
PVA, álcool polivinílico 
TAG, triacilglicerol 
TAG-ES, triacilglicerol estruturado 
TLC, thin layer chromatography 
YPD, Yeast Extract, Peptone,Dextrose 
 
 
xvi 
 
 
 
SUMÁRIO 
INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 18 
1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 19 
2. ESTRUTURA DA TESE ............................................................................................ 21 
3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 22 
3.1 Objetivos Gerais .................................................................................................. 22 
3.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 22 
CAPÍTULO 1 ............................................................................................................................ 23 
1. LIPASE ....................................................................................................................... 24 
1.1 Lipases microbianas ............................................................................................. 31 
2. LIPASE DE Yarrowia lipolytica ................................................................................. 34 
3. APLICAÇÕES DE LIPASES EM MODIFICAÇÕES LIPÍDICAS ........................... 39 
4. LIPÍDIOS NA NUTRIÇÃO HUMANA ..................................................................... 41 
4.1 Ácidos graxos insaturados ................................................................................... 44 
4.2 Ácido graxo de cadeia média ............................................................................... 46 
5. LIPÍDOS ESTRUTURADOS ..................................................................................... 49 
5.1 Formas de obtenção dos lipídios estruturados ..................................................... 50 
5.2 Lipídios estruturados como alimentos funcionais ............................................... 51 
CAPÍTULO 2 ............................................................................................................................ 54 
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 56 
2. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 59 
2.1 Micro-organismos e materiais ............................................................................. 59 
2.2 Produção do extrato bruto rico em lipase ............................................................ 59 
2.3 Imobilização da lipase ......................................................................................... 60 
2.4 Determinação da atividade da lipase.................................................................... 61 
2.5 Análise de ácidos graxos por Cromatografia em Fase Gasosa ............................ 62 
2.6 Hidrólise parcial dos lipídios e dos ésteres de ácidos graxos pela lipase ............ 63 
2.7 Análise das classes lipídicas por Cromatografia em Camada Delgada ............... 63 
2.8 Determinação da regiosseletividade da lipase ..................................................... 65 
2.9 Determinação da tiposseletividade da lipase ....................................................... 65 
2.10 Análises estatísticas ............................................................................................. 66 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 67 
3.1 Atividade da lipase de Y. lipolytica ..................................................................... 67 
 
 
xvii 
 
 
 
3.2 Reações de hidrólise dos triacilgliceróis modelo e heterogêneos dos óleos 
vegetais ........................................................................................................................... 67 
3.3 Regiosseletividade da lipase de Y. lipolytica em triacilgliceróis modelo e 
heterogêneos em reações de hidrólise ............................................................................. 74 
3.4 Tiposseletividade da lipase de Y. lipolytica em reações de hidrólise .................. 79 
4. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 85 
CAPÍTULO 3 ............................................................................................................................ 86 
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 88 
2. MATERIÁIS E MÉTODOS ....................................................................................... 91 
2.1 Micro-organismos e materiais ............................................................................. 91 
2.2 Produção do extrato bruto rico em lipases ........................................................... 91 
2.3 Determinação da atividade da lipase.................................................................... 91 
2.4 Reação de acidólise para produção de lipídios estruturados ................................ 92 
2.5 Determinação das classes lipídicas dos lipídios estruturados .............................. 93 
2.6 Separação das classes lipídicas após reação parcial de hidrólise por 
Cromatografia em Camada Delgada ............................................................................... 94 
2.7 Análise de ácidos graxos por cromatografia em fase gasosa ............................... 95 
2.8 Determinação da regiosseletividade da lipase de Y. lipolytica em reações de 
síntese reversa ................................................................................................................. 95 
2.9 Análise estatística ................................................................................................ 96 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 97 
3.1 Atividade da lipase de Y. lipolytica ..................................................................... 97 
3.2 Produção de lipídios estruturados a partir da acidólise da trioleína com ácido 
graxo de cadeia média ..................................................................................................... 97 
3.3 Produção de lipídios estruturados a partir da acidólise do azeite de oliva e ácidos 
graxos de cadeia média ................................................................................................. 102 
4. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 105 
CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................................... 106 
TRABALHOS FUTUROS ......................................................................................................... 108 
REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 110 
ANEXOS ................................................................................................................................ 121 
 
 
 
 
 
18 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
 
 
19 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO GERAL 
 
As lipases são reconhecidas por seu elevado potencial na tecnologia lipídica. 
Destacam-se as de origem microbiana por seu maior interesse industrial, em especial devido 
aos seguintes fatores: seletividade frente ao substrato, grandes variedades de micro-
organismos produtores (variedade genética e funcional), não são sujeitas a sazonalidade na 
produção, apresentam fácil manipulação genética visando melhoramento tecnológico, curto 
tempo de geração, entre outros fatores (Amaral, 2007; Treichel et al, 2010). Lipases são 
triacilglicerol éster-acilhidrolases (E.C.3.1.1.3.) capazes de catalisar a hidrólisede ligações 
éster com ácidos graxos de cadeia longa em triacilgliceróis, diacilgliceróis e 
monoacilgliceróis formando ácidos graxos livres e glicerol. Quando submetidas a meios 
reacionais não aquosos ou micro-aquosos, as lipases também são capazes de catalisar 
reações de síntese reversa, tais como a interesterificação e a transesterificação (De Araújo et 
al, 2011; De Lima, 2013). 
Essas características atraem grande interesse em pesquisas e aplicações 
biotecnológicas (Brígida et al, 2014b). As aplicações de lipases estão intimamente 
relacionadas com a sua seletividade frente ao substrato. A seletividade da lipase pode ser 
dividida em diferentes grupos: a regiosseletividade que é a capacidade que a enzima possui 
em distinguir as duas posições externas da molécula de triacilglicerol (ésteres primários) da 
posição interna (éster secundário) e liberar os ácidos graxos esterificados nestas posições 
(De Araújo et al, 2011), assim como também pode catalisar a incorporação (troca de radicais 
acila entre um éster e um ácido) dos ácidos graxos nestas posições em reações de síntese 
reversa; a tiposseletividade que está relacionada à seletividade da lipase em agir sobre ácidos 
graxos particulares ou sobre grupos de ácidos graxos com características estruturais 
semelhantes e, finalmente, as lipases não seletivas são aquelas que catalisam a hidrólise de 
triacilglicerol para ácido graxo livre e glicerol e/ou a incorporação de ácidos graxos na 
molécula de triacilglicerol de forma aleatória. Este grupo de lipases não apresenta 
seletividade posicional ou em relação ao grupo acila (Cambon et al, 2008). 
O conhecimento da seletividade das lipases frente ao substrato permite uma 
ampliação de seu uso industrial, em especial quanto à sua aplicação na síntese de lipídios 
estruturados, que são triacilgliceróis modificados. Por exemplo, têm-se as reações de 
acidólise em que o triacilglicerol reage com ácidos graxos livres, resultando em um novo 
triacilglicerol, resultante da incorporação de ácidos graxos livres do meio reacional. A 
finalidade principal da síntese de lipídios estruturados é de alterar a composição em ácido 
 
 
20 
 
 
 
graxo do triacilglicerol e/ou sua distribuição nas posições sn-1,2,3 do glicerol (Akoh, 1995; 
Lee & Akoh, 1998). 
O aumento do conhecimento a respeito dos efeitos de ácidos graxos específicos no 
metabolismo humano, especialmente os insaturados, tais como: os ácidos oleico, linoleico e 
linolênico, e os de cadeia média, tais como os ácidos cáprico e láurico, tem estimulado a 
síntese de lipídeos estruturados com vistas ao tratamento e à prevenção de diversas doenças 
crônicas, assim como no tratamento de pacientes com síndromes de má absorção e 
dislipidemias (Yankah & Akoh, 2000). Devido à essas variada funcionalidade, os lipídios 
estruturados podem ser considerados alimentos funcionais, fornecendo ácidos graxos 
específicos esterificados em posições específicas do glicerol para fins nutritivos e 
terapêuticos, permitindo efeito benéfico à saúde ou visando o tratamento de doenças 
específicas ou condições metabólicas anormais (Yankah, 2000). Além disso, podem ser 
sintetizados para melhorar ou modificar características físicas e/ou químicas dos óleos, tais 
como ponto de fusão, viscosidade, entre outros (Gunstone, 1998; Auerbach, 2001). 
Na modificação de lipídios para fins nutricionais e na indústria de alimentos, 
destacam-se as lipases microbianas produzidas por micro-organismos seguros (GRAS Status; 
Generally Recognized as Safe). Yarrowia lipolytica é um micro-organismo aeróbico, não 
patogênico, que apresenta GRAS Status concedido pela American Food and Drug 
Administration. Um de seus principais produtos de interesse tecnológico são lipases, que 
podem ser extracelulares, intracelulares ou ligadas à membrana citoplasmática. A YILip2 é 
uma potente lipase microbiana, produzida e secretada pela Y. lipolytica na fermentação 
submersa ou em estado sólido (Amaral, 2007). A depender das condições de cultivo 
microbiano, essa pode ser a principal lipase produzida por Y. lipolytica. 
No entanto, a seletividade desta lipase, Y. lipolytica IMUFRJ 50682, frente ao 
substrato (régio- e tipo-seletividade) em reações de hidrólise não foi determinada de maneira 
completa, além disso, não foram investigados sua seletividade em reações de acidólise ou 
seu uso na produção de lipídios estruturados. Adicionalmente, o conhecimento do 
comportamento da lipase de Y. lipolytica em ambos os mecanismos de reação dará subsídios 
à futuras investigações acerca da produção de novos lipídios contendo ácidos graxos de 
interesse nutricional. Dessa forma, o presente trabalho pode vir contribuir para a expansão 
das aplicações tecnológicas da lipase de Y. lipolytica, possivelmente na customização de 
óleos e na modificação lipídica. 
 
 
 
21 
 
 
 
2. ESTRUTURA DA TESE 
 
O desenvolvimento da tese foi dividido em um capítulo de revisão da literatura e dois 
capítulos no formato de artigos científicos, nos quais apresenta-se parte experimental da 
tese. No primeiro capítulo, uma breve revisão da literatura é apresentada, onde as recentes 
descobertas sobre as lipases microbianas são descritas, especialmente sobre as lipases de 
Yarrowia lipolytica, além de suas aplicações em modificações lipídicas, com ênfase na 
produção de lipídios estruturados. 
No segundo capítulo apresenta-se a caracterização da regio- e tipo-seletividade da 
lipase de Yarrowia lipolytica em reações de hidrólise; foi investigada a enzima na forma 
livre (estrato bruto) e imobilizada sobre nanopartículas magnéticas. Para caracterização da 
regiosseletividade da lipase, foram avaliados substratos modelo (padrão de trioleína como 
triacilgliceróis homogêneos) e triacilgliceróis heterogêneos em óleos vegetais naturais, 
selecionados de acordo com a sua produção e consumo mundial. Por outro lado, para a 
investigação da tiposseletividade, foram utilizados padrões de ésteres etílicos de ácidos 
graxos saturados com diferentes comprimentos de cadeia e insaturados de mesmo 
comprimento de cadeia, porém com variado número de insaturações. A motivação principal 
para esse trabalho foi a potente ação catalítica combinada à escassez de dados publicados 
acerca da lipase de Yarrowia lipolytica, especialmente quanto a sua regiosseletividade frente 
ao substrato em reações de hidrólise. Essa parte do trabalho foi aceita para publicação como 
artigo completo no periódico Biochemical Engineering Journal (artigo completo em Anexo 
3). 
O terceiro capítulo apresenta a produção de um lipídio estruturado, enriquecido de 
ácidos graxos de interesse nutricional, esterificados ao triacilglicerol em posição 
nutricionalmente favorável. Adicionalmente à produção do novo óleo funcional, foi 
caracterizada a ação da lipase de Yarrowia lipolytica na sua forma livre quanto a 
regiosseletividade em reações de síntese reversa (acidólise), assim como a sua eficiência na 
produção desses lipídios estruturados, em função do tempo de reação e da razão molar entre 
os substratos (ácido graxo livre e triacilglicerol). Esse trabalho apresentou como principal 
motivação a inexistência de dados publicados quanto a ação desta lipase em reações de 
acidólise, somado a importância da avaliação de seu uso na customização de lipídios com 
propriedades funcionais. O manuscrito, em fase intermediária de redação, será submetido 
para apreciação pelo periódico Food Chemistry, com vistas à publicação como artigo 
completo. 
 
 
22 
 
 
 
3. OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivos Gerais 
 
Caracterizar o perfil da regio- e tipo-seletividade da lipase livre e imobilizada de Y. 
lipolytica IMUFRJ 50682 em reações de hidrólise e investigar a produção de lipídios 
estruturados, utilizando ácidos graxos de interesse nutricional, pela ação da lipase livre de Y. 
lipolytica em reações de acidólise. 
 
3.2 Objetivos Específicos 
 
a) Determinar a atividadehidrolítica da lipase de Y. lipolytica sobre triacilgliceróis 
homogêneo (trioleína) e heterogêneos em óleos vegetais; investigar a lipase nas formas livre 
e imobilizada sobre nanopartículas magnéticas, em diferentes tempos de reação; 
 
b) Investigar, em reações de hidrólise, a regiosseletividade e a tiposseletividade da lipase de 
Y. lipolytica nas formas livre e imobilizada sobre nanopartículas magnéticas; 
 
c) Produzir lipídios estruturados enriquecidos com ácidos graxos poli-insaturados na posição 
sn-2 e ácidos graxos de cadeia média nas posições sn-1/3 do triacilglicerol pela ação da 
lipase livre de Y. lipolytica em reações de acidólise, sobre triacilglicerol homogêneo 
(trioleína) e heterogêneos de azeite de oliva; 
 
d) Determinar a regiosseletividade da lipase livre de Y. lipolytica em reações de acidólise, na 
a produção de lipídios estruturados. 
 
 
 
23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 1 
 
Revisão de Literatura 
 
 
 
24 
 
 
 
1. LIPASE 
 
A utilização de lipases vem se intensificando nos últimos anos, devido à versatilidade 
dessas enzimas. Na indústria de alimentos, por exemplo, a lipase é utilizada principalmente 
para a produção de ácidos graxos (AGs), responsáveis pelo desenvolvimento do aroma e 
sabor, principalmente em queijos e na modificação de lipídios, aumentando seu valor 
comercial e nutritivo (Akin et al, 2003). 
As lipases são enzimas, que por sua vez são classificadas e codificadas pela NC-
IUBMB (Nomemclature Committee of the International Union of Biochemistry and 
Molecular Biology) de acordo com a sua reação catalítica. As enzimas recebem uma 
classificação numérica da Enzyme Comission, cuja abreviação é E.C., seguida de até quatro 
dígitos referentes a classes e subclasses à que pertencem. Lipases são pertencentes a classe 
das hidrolases (E.C.3.1) e que atuam sobre as ligações éster (E.C.3.1.1), ou seja, constituem 
um grupo de enzimas que são esterases e catalisam a hidrólise de ligações éster de 
triacilgliceróis (TAGs), formando diacilglicerol (DAG), monoacilglicerol (MAG), ácidos 
graxos livres (AGL) e glicerol. Assim, foram definidas como glicerol éster hidrolases 
(E.C.3.1.1.3). Essas enzimas ainda podem realizar reações de síntese reversa à hidrólise, 
como é possível observar na Figura 1, quando são submetidas a meios reacionais não 
aquosos ou micro-aquosos, catalisando a síntese de vários ésteres (Jaeger et al, 1999; 
Cambon et al, 2008; Brígida et al, 2014b). 
 
 
Figura 1: Representação esquemática da reação de hidrólise e de síntese reversa catalisada pela 
lipase (Amaral, 2007, com adaptações). 
 
As lipases podem ser encontradas em animais (pâncreas, plasma sanguíneo, saliva, 
suco pancreático), em vegetais (soja, amendoim, etc.), bactérias e fungos (Whitaker, 1972). 
 
 
25 
 
 
 
Em eucariotos, as lipases estão envolvidas em vários estágios do metabolismo lipídico, 
incluindo a digestão de gorduras, o metabolismo de lipoproteínas, absorção e reconstituição. 
Nas plantas, as lipases são encontradas nos tecidos de reserva de gordura (Shamar et al, 
2001). 
 As lipases são esterases que atuam em substratos insolúveis em água, agindo na 
interface água/óleo de soluções emulsionadas, catalisando, preferencialmente, a hidrólise de 
ésteres de ácidos graxos de cadeia mais longa. A principal diferença entre lipases com o 
restante das esterases é que as lipases apresentam maiores atividades com substratos 
insolúveis, como os TAGs compostos por AGs de cadeia mais longa. Porém, as esterases 
preferem catalisar reações com AGs com menores números de átomos de carbono, 
geralmente até 6 carbonos (Lopes, 2011). Os AGs que compõem os TAGs apresentam 
números de átomos de carbono de 4 a 18 e podem apresentar insaturações. A diversidade de 
AGs e, consequentemente, de TAGs presentes na natureza, propiciou a existência de vários 
tipos de lipases, apresentando características distintas (Amaral, 2007). 
 O sítio ativo das lipases é composto por uma tríade catalítica, que consiste em uma 
sequência de três resíduos de aminoácidos fundamentais para a atividade catalítica, sendo 
Serina-Asparagina-Histidina e Serina-Glutamina-Histidina as mais frequentes. O sítio ativo 
das lipases é protegido por uma cadeia peptídica denominada de “tampa”, formada por 
resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, que são deslocados ao entrar em contato com o 
substrato apolar, expondo o sítio ativo. O movimento da estrutura que compõe a tampa 
confere às lipases pelo menos duas conformações distintas, sendo a primeira denominada 
“fechada” ou inativa pelo não deslocamento da “tampa” e a segunda denominada “aberta” 
ou ativa, pelo deslocamento da “tampa” na presença de uma interface lipídeo-água. O sítio 
ativo fica acessível ao substrato e, adicionalmente, a lipase expõe uma larga superfície 
hidrofóbica (Amaral, 2007). 
 Existe uma forte tendência no crescimento do uso das lipases por conta do seu vasto 
campo de aplicação. Isso porque, atualmente, além de se buscar processos industriais mais 
eficientes, também se procura processos mais conscientes, que não geram resíduos e onde os 
catalisadores podem ser reutilizados. Com isso, o interesse das indústrias pela substituição 
de produtos químicos pelo uso de enzimas vem aumentando, tornando a tecnologia da 
catálise enzimática de grande interesse biotecnológico no cenário mundial (De Araújo et al, 
2011; De Lima, 2013). 
 Há uma série de vantagens no uso de lipases em relação aos métodos convencionais 
de síntese orgânica. Primeiro, as reações podem ocorrer em temperaturas moderadas e, dessa 
 
 
26 
 
 
 
forma, há uma menor degradação tanto de substratos como dos produtos formados. 
Segundo, algumas lipases podem promover reações de síntese reversa, além das reações de 
hidrólise, em ambientes micro-aquosos. As reações de síntese reversa, dependendo dos 
reagentes de partida empregados, podem resultar em reações de interesterificação, como por 
exemplo, a troca de radicais acil entre um éster e um ácido (acidólise) ou ainda de um éster e 
outro éster, reação intitulada de transesterificação. Isto pode resultar em um novo óleo com 
rearranjo de AGs formando um novo TAG, com propriedades químicas, físicas e 
nutricionais específicas (Brandoo, 2002; Kumar, 2005). As reações de hidrólise e de síntese 
reversa (acidólise e transesterificação), catalisadas por lipases, estão demonstradas 
esquematicamente na Figura 2. 
 
 
Figura 2: Representação esquemática das reações de hidrólise, acidólise e transesterificação e 
catalisada por lipases (Carvalho et al, 2003, com adaptações). 
 
 
27 
 
 
 
Entretanto, o uso de lipases proporciona reações que possibilitam na formação de 
produtos mais específicos, pelo fato de seu poder catalítico apresentar seletividade frente aos 
substratos (Feltes, 2013). Com isso, os produtos produzidos a partir de óleos ou gorduras por 
meio de processos utilizando lipases, são gerados com maior rapidez e maior seletividade, 
que faz com que despertem maiores interesses em aplicações industriais (Saxena, 2003). 
Esta potente habilidade na modificação lipídica atrai grandes interesses em pesquisas 
e aplicações biotecnológicas (Brígida, 2014a). As aplicações de lipases estão intimamente 
relacionadas com a sua seletividade frente ao substrato, que podem expandir suas 
aplicações. A seletividade das lipases pelos AGs é relacionada pelo comprimento de cadeia 
carbônica, bem como o número e posição das insaturações. O elevado grau de especificidade 
que as lipase podem apresentar, tanto para as reações de hidrólise como também para as 
reações de síntese reversa, as tornam um excelente biocatalisador (Long, 2010; De Araújo et 
al, 2011). 
 A seletividade das lipases pode ser classificada de três formas: a regiosseletividade, 
a tiposseletividade e a estereoseletividade. A regiosseletividade é a característica da lipase 
em possuir a habilidade de distinguiras duas posições externas da molécula do triacilglicerol 
(ésteres primários) da posição central (éster secundário). Esta seletividade é dividida em três 
grupos que são descritos a seguir (Saxena, 2003; Long, 2010; De Araújo et al, 2011): 
 1,3-regiosseletiva: é a habilidade que a lipase tem em distinguir entre as duas 
posições externas da molécula do TAG (ésteres primários) da posição central da 
molécula (éster secundário). Em reações de hidrólise, a lipase apresenta preferência 
em catalisar a hidrólise daqueles AGs que estão esterificados nas posições externas 
da molécula. Em reações de síntese reversa, a lipase apresenta preferência em 
catalisar a esterificação dos AGs nos ésteres primários na molécula do TAG; 
 2-regiosseletiva: esta habilidade é contrária a 1,3-regiosseletiva, em que a lipase 
possui a capacidade de distinguir a posição central (éster secundário) das duas 
posições externas da molécula do TAG (ésteres primários). Logo, em reações de 
hidrólise, a lipase apresenta preferência em catalisar a hidrólise daqueles AGs que 
estão esterificados na posição central da molécula. Em reações de síntese reversa, a 
lipase apresenta preferência em catalisar a esterificação dos AGs no éster secundário 
na molécula do TAG; 
 Não-seletiva: por fim, esta característica indica que a lipase não apresenta 
preferência posicional frente ao substrato. Essas lipases catalisam a hidrólise dos 
TAGs e/ou a incorporação dos AGs na molécula de uma forma aleatória. 
 
 
28 
 
 
 
 
 A Figura 3 apresenta de uma forma geral, a representação do comportamento das 
lipases 1,3-regiosseletivas e não seletivas, em reações de hidrólise. 
 
 
Figura 3: Representação esquemática das reações de hidrólise catalisadas por lipases do tipo não-
seletivs e 1,3-regioseletiva (Long, 2010, com adaptações). 
 
 Como pode ser observado na Figura 3, a reação de hidrólise biocatalisada por lipases 
não-seletivas tende a resultar na produção de DAGs que não contenham seus AGs nas 
posições sn-1 ou sn-2 na molécula de glicerol. Entretanto, conforme avança a reação de 
hidrólise, ocorre a formação de 2-monoacilglicerol (2-MAG), pois começa a ocorrer a 
hidrólise dos AGs em ambas as posições externas da molécula de TAGs. Porém há lipases 
que apresentam um forte comportamento de 1,3-regiosseletividade, como por exemplo, a 
lipase pancreática, que em poucos minutos de reação de hidrólise já é observado a presença 
da classe de 2-MAG no meio reacional (De Araújo et al, 2011). 
 A Figura 4 apresenta uma ilustração com dois exemplos da ação de uma lipase 1,3-
regiosseletiva em TAGs: uma em reação de hidrólise e outra em reação de síntese reversa, 
como por exemplo, a reação de acidólise. Na reação de hidrólise, a lipase prefere hidrolisar 
os AGs nas posições externas da molécula do TAG. Na reação de acidólise, a lipase prefere 
esterificar os AGs nas posições externas. 
 
 
 
29 
 
 
 
 
Figura 4: Ilustração apresentando a 1,3-regiosseletividade da lipase em reação de hidrólise e 
acidólise. 
 
 A tiposseletividade é a característica da lipase em catalisar preferencialmente a 
hidrólise ou esterificação de um grupo específico de AGs da molécula de TAG ou AGs com 
características estruturais semelhantes. Por fim, a estereosseletividade, é a capacidade da 
lipase de catalisar a hidrólise e/ou esterificação do AG que está em um éster primário em 
comparação com o outro (sn-1 vs. sn-3) (Ren, 2011; Brígida, 2014a). 
 Já foi determinada a regiosseletividade e a tiposseletividade frente ao substrato em 
diversas lipases. Geralmente as lipases apresentam o mesmo perfil seletivo em ambas as 
reações, porém as lipases podem apresentar comportamentos distintos dependendo da reação 
que é aplicada (Ren, 2011). A Tabela 1 foi elaborada para apresentar a seletividade do grupo 
das principais lipases que são utilizadas, que apresentam o mesmo perfil seletivo tanto em 
reação de hidrólise como também em reações de síntese reversa. A maioria das lipases 
exibem 1,3-regiosseletividade ou são não-seletivas, porém é possível que uma lipase 
apresente comportamento de 1,3-regiosseletividade mais expressivo em comparação com 
outra lipase. Entretanto, poucas lipases apresentam a preferência na atividade catalítica na 
posição central (sn-2). 
 
 
 
30 
 
 
 
Tabela 1: Caracterização de algumas lipases frente ao substrato em hidrólise e reações de síntese 
reversa. 
 
Fonte 
(animal, vegetal e 
microbiológica) 
Regiosseletividade 
 
 
Tiposseletividade 
 
Fonte 
Lipase pancreática (animal) 1,3-regiosseletiva 
AGs insaturados e 
saturados 
Christie, 2010 
Latex de Babaco (vegetal) 1,3-regiosseletiva AGs insaturados 
Cambon et al, 
2008 
Carica papaya (vegetal) 1,3-regiosseletiva AGs insaturados 
Cambon et al, 
2008 
Candida rugosa 
(microbiológica) 
Não-seletiva Não-seletiva Vaysse, 2002 
Thermomyces lanuginose 
(microbiológica) 
1,3-regiosseletiva 
Seletiva para AGs 
insaturados 
Yang, 2003 
Rhizomucor miehei 
(microbiológica) 
1,3-regiosseletiva 
Seletiva para AGs 
saturados individuais 
e AGs insaturados 
Araújo, 2011 
Candida antarctica 
(microbiológica) 
 
Não-seletiva e 2-
regiosseletiva 
Não-seletiva 
Chnadhapura, 
2001 
 
 As lipases comerciais Novozyme-435, oriunda da lipase de Candida antarctica, e a 
Lipozyme-IM de Mucor mieihei, são geralmente as lipases mais utilizadas em pesquisas. 
Estas lipases são 1,3-regiosseletividas, principalmente para AGCL, principalmente o ácido 
linoleico (18:2n-6) e linolênico (18:3n-3), como também demonstraram tiposseletividade 
para estes AGs, em ambas as reações de hidrólise e de síntese reversa. Porém, a Novozyme-
435 e Lipozyme-IM também apresentam forte preferência em incorporar o AG docosa-
hexaenóico (DHA; 22:6n-3) e AG eicosapentaenoico (EPA; 20:5n-3) em trioleína, AGs 
insaturados com 22 e 20 átomos de carbono, respectivamente, presente em óleo de peixe, 
que possui elevada propriedade na prevenção de diversas doenças, como as cardiovasculares 
(Haman, 2008). 
 As lipases vegetais também podem apresentar características em relação a posição do 
AG na molécula do TAG e a preferência de hidrolisar ou esterificar um tipo e/ou um grupo 
específico de AG. As lipases obtidas do látex da planta do mamão (Carica papaya) e do 
látex da planta do Babaco foram estudadas minuciosamente e, por ambos os vegetais 
apresentarem similaridade no látex, também apresentaram que suas lipases também são 
semelhantes em relação a caracterização frente ao substrato (Cambon et al, 2008). Esse 
estudo afirma que ambas as lipases apresentam forte comportamento 1,3-regiosseletivo, 
principalmente para AGs insaturados em apenas 15 minutos de reação de hidrólise. Em 
 
 
31 
 
 
 
relação a tiposseletividade, a preferência foi em incorporar o grupo de AGs de cadeia curta 
(AGCC), porém esta tiposseletividade só foi detectada após 1 hora de reação de acidólise. 
 Considerando todas essas vantagens descritas, a caracterização dessa seletividade das 
lipases frente ao substrato expande potencialmente suas aplicações biotecnológicas, 
principalmente permitindo que possam ser utilizadas na customização de óleos e gorduras 
objetivando na síntese de novos lipídios. No âmbito nutricional, esta aplicabilidade das 
lipases possui elevado interesse, uma vez que interferem no melhoramento da saúde dos 
indivíduos (Liese, 2000; Jaeger, 2002; Long, 2010; Kanjilal et al, 2013; Feltes, 2013). 
 
1.1 Lipases microbianas 
 
As lipases microbianas são glicoproteínas de peso molecular variando entre 19 e 60 
kDa, apresentando em torno de 258 e 544 aminoácidos, dos quais um grande número são 
hidrofóbicos e responsáveis pela interação entre a enzima e substratos insolúveis em água 
(Jaeger, 1998; Amaral, 2007). As lipases microbianas apresentam estruturas tridimensionais 
(3D), na qual as lipases de Rhizomucor miehei e do pâncreas humano foram as primeiras a 
terem suas estruturasdeterminadas em 1990 (Brady et al, 1990). 
As lipases microbianas são aquelas que mais se destacam, por apresentarem maior 
interesse industrial por diversos motivos, entre eles, a grande variedade de micro-
organismos produtores. Inclusive, existem diversas lipases microbianas que estão 
disponíveis comercialmente (Jaeger, 1998; Treichel, 2010), como pode ser visto na Tabela 
2. 
 
 
 
32 
 
 
 
Tabela 2: Algumas lipases microbianas comercialmente disponíveis. 
 
Fonte Aplicação Companhia produtora 
Fungos 
 
Candida rugosa Síntese orgânica 
Amano, Biocatalyst, Boehinger, 
Sigma, Mannheim 
Candida antarctica Síntese orgânica 
Boehinger, Mannheim, Novo 
Nordisk 
Thermomyces lanuginosus Aditivos em detergente 
Boehinger, Mannheim, Novo 
Nordisk 
Rhizomucor miehei 
Processamento de 
alimentos 
Novo Nordisk, Amano, Biocatalyst 
 
Bactérias 
 
Burkholderia cepacia Síntese orgânica 
Amano, Fluka, Boehriner, 
Boehringer 
Pseudomonas alcaligenes Aditivos em detergente Genecor 
Pseudomonas mendocina Síntese orgânica Genecor 
Chromobacterium 
viscosum 
Síntese orgânica Asahi, Biocatalyst 
Fonte: Jaeger, 1998 e Reetz, 2006 
 
As lipases microbianas ainda se destacam por não serem sujeitas a efeitos sazonais, 
os micro-organismos produtores serem de fácil manipulação genética e possuírem pequeno 
tempo de geração, poder apresentar seletividade frente ao substrato e, na maioria dos casos, 
são produzidas extracelularmente, o que facilita sua obtenção (Treichel, 2010). 
Entre os micro-organismos produtores de lipases, estão as bactérias (Jaeger, 1999), 
as leveduras (Muralidhar, 2001), os fungos filamentosos (Elibol, 2002) e os actinomicetos 
(Sztajer, 1988). As leveduras apresentam uma série de vantagens frente às outras fontes 
microbianas, como por exemplo, menor tempo de geração e melhor adaptação a longos 
tempos de processos. Além disso, são geneticamente mais estáveis do que as bactérias e não 
são patogênicas (apresentam GRAS Status; Generally Recognized as Safe), o que permite 
que os produtos obtidos por estes micro-organismos sejam mais aceitos nos setores 
alimentícios (Pereira-Meireles, 1997). 
As lipases microbianas são enzimas que apresentam elevado potencial 
biotecnológico, pois catalisam a hidrólise de uma ampla variedade de lipídios (TAGs) para 
formar outras classes lipídicas, como os DAGs, MAGs, AGLs e glicerol, que nesta reação 
ocorre na interface lipídio/água. As lipases microbianas, no geral, possuem a característica 
de promover as reações de síntese reversa, além das reações de hidrólise, em ambientes 
 
 
33 
 
 
 
micro-aquosos. Diante desses aspectos, as lipases são consideradas excelentes 
biocatalisadores em modificações lipídicas (Bornscheuer, 2002). 
 Além do âmbito nutricional e alimentício, as lipases microbianas também têm 
aplicações promissoras na indústria de detergentes, removendo resíduos gordurosos, como 
também sua aplicação na indústria farmacêutica, que foi um dos setores que mais beneficiou 
o avanço dos estudos da utilização de lipases (Hemachander, 2000). Além disso, uma 
promissora aplicação das lipases reside na produção de Biodiesel, que são ésteres metílicos 
de ácidos graxos, que consiste em um combustível biodegradável, não tóxico, de combustão 
limpa, produzido de fontes renováveis (Marchetti et al, 2007). 
 
 
 
34 
 
 
 
2. LIPASE DE Yarrowia lipolytica 
 
Yarrowia lipolytica é um micro-organismo estritamente aeróbico, eucariótico, do 
reino Fungi, pertence à classe dos Ascomicetos e subclasse Hemiascomicetos. Foi 
originalmente classificada como Candida lipolytica e depois reclassificada como 
Endomycopsis lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica e, finalmente, Yarrowia lipolytica 
(Barth, 1997). É geralmente isolada, principalmente, de meios contendo fonte de carbono 
lipídica, tais como ambientes poluídos, como a Baía de Guanabara (Haegler, 2001). Y. 
lipolytica apresenta naturalmente diformismo, apresentando a habilidade de alternar, 
reversivelmente, entre duas formas morfológicas (células ovoides e hifas bastante 
alongadas), como é possível observar na Figura 5 (Szabo, 2002). 
 
 
Figura 5: Observação em microscópio de células de Y. lipolytica (Szabo, 2002). 
 
Y. lipolytica pertence ao grupo das leveduras “não convencionais” e é a espécie mais 
estudada deste grupo. Por pertencer a este grupo, é bastante diferente dos modelos celulares 
das leveduras “convencionais”, que são as espécies mais estudadas, como a Saccharomyces 
cerevisiae. A principal diferença entre os grupos é em relação a morfologia, para o primeiro 
grupo, a presença de oxigênio que é essencial, fazendo com que a Y. lipolytica seja 
classificada como aeróbio restrito (Barth, 1997; Flores et al, 2000). 
Essa levedura apresenta GRAS Status, logo não é patogênica, que proporciona sua 
aplicação na indústria alimentícia, como por exemplo, no desenvolvimento de flavour de 
pêssego e ácido cítrico (Tsugawa et al, 1986). Porém sua principal aplicação é na produção 
de diversas enzimas, como proteasas, esterases, fosfatases e, principalmente, lipases, todas 
de elevado interesse biotecnológico (Nicaud et al, 2002; Brígida et al, 2014b). 
A levedura Y. lipolytica IMUFRJ 50682 é isolada do lixo proveniente da Baía de 
Guanabara. Esta levedura já vem sendo estudada no grupo BIOSE (Biological System 
 
 
35 
 
 
 
Engineering Group) da Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ. Caracterização dos 
produtos secretados desta levedura, produção de biodiesel, melhores condições para 
obtenção dos seus produtos secretados e estudo de imobilização de lipases fazem parte do 
grupo das principais pesquisas desse grupo com essa levedura. 
As enzimas secretadas por Y. lipolytica se encontram tanto intra quanto extracelular, 
como também ligada à membrana. Porém, como geralmente ocorre com as lipases 
microbianas, a Y. lipolytica é capaz de produzir mais lipases extracelulares. A YlLip2 é uma 
lipase extracelular codificada pelo gene LIP2 e é a lipase majoritariamente produzida. 
Porém, outras 25 lipases também são secretadas e já foram purificadas e caracterizadas, 
como por exemplo, a YlLip8 que é uma lipase ligada a membrana e YlLip 1, YlLip 3 e YlLip 
6 que são enzimas intracelulares (Brígida et al, 2014b). A lipase secretada a partir do gene 
LIP2, a YlLip2, apresenta 301 aminoácidos e, recentemente, a configuração 3D da YlLip2 foi 
revelada e apresentou elevada similaridade com as lipases de outros fungos, como de 
Rhizomucor miehei e Thermomyces lanuginose (Bordes et al, 2010; Bordes, 2011). 
A forma de condução do processo de produção de lipases de Y. lipolytica são 
caracterizados por dois tipos de sistemas: fermentação em meio sólido (FES) e fermentação 
submersa (FSm). A FES é bastante interessante do ponto de vista econômico, pois tem a 
possibilidade de aproveitar resíduos agroindustriais. No entanto, apresenta dificuldades em 
monitorar o processo, além de baixa oxigenação. Kamini et al (1998) estudaram a produção 
de lipases por Apergillus niger utilizando torta de óleo de gergelim. No estudo de Gombert 
et al (1999) avaliaram a produção de lipases por Penicillium restrictum utilizando resíduos 
industriais de óleo de babaçu. 
A produção de enzimas microbianas em escala industrial se faz majoritariamente por 
FSm. A fermentação ocorre em um meio fermentativo líquido, em que as fontes de 
nutrientes utilizadas são solúveis. As técnicas de cultivo submerso têm se beneficiado dos 
avanços da instrumentação e controle de processos, uma vez que são utilizados biorreatores, 
proporcionando maior controle no processo e maior produção de lipases. Os biorreatores 
proporcionam condições controladas, como o controle na agitação, temperatura e vazão de 
oxigênio. Apesar de o custo ser maior em comparação com a FES devido a utilização desses 
biorreatores, a relação custo/benefício no final fica menor, uma vez que há biorretores de 
diversostamanhos proporcionando a produção de lipases em escala industrial (Feitosa, 
2009). As Figuras 6 e 7 apresentam biorreatores de nível de bancada, com capacidade de 2 L 
e 3 L, respectivamente, produzindo extrato enzimático rico em lipases, pela FSm, pela Y. 
lipolytica. 
 
 
36 
 
 
 
 
 
Figura 6: Biorreator de capacidade de 2 L utilizado na produção de lipase de Y. lipolytica por 
fermentação submersa. 
 
 
Figura 7: Biorreator de capacidade de 3 L utilizado na produção de lipase de Y. lipolytica por 
fermentação submersa. 
 
 
 
37 
 
 
 
As lipases podem ser utilizadas na sua forma livre e imobilizada, na qual a forma 
imobilizada apresenta um grande interesse industrial devido suas vantagens. A imobilização 
da lipase pode conferir maior termoestabilidade a lipase, maior separação com os produtos 
formados, permite o reaproveitamente da lipase, entre outros fatores. Os métodos de 
imobilização de enzimas podem ser por encapsulamento ou por ligação. O método por 
encapsulamento pode ser em matriz ou em membranas, que é divida em 
microencapsulamento e entre membranas macroscópicas. O método por ligação pode ser por 
adsorção ou por ligação covalente, que é dividida em ligação no suporte ou ligação cruzada 
entre as enzimas (IUPAC, 1995). O grupo BIOSE já investigou a imobilização da lipase de 
Y. lipolytica, como no caso do estido de Brígida (2010) que investigou a imobilização por 
adsorção e ligação covalente pelo reaproveitamento da fibra da casca de coco verde como 
suporte. Já em outro estudo do mesmo grupo (Rios, 2014), investigaram a imobilização da 
lipase de Y. lipolytica por adsorção em hidróxido duplo lamelar. Atualmente, em parceria 
com a professora Finotelli, P. da Faculdade de Farmácia da UFRJ, o grupo está investigando 
a imobilização por adsorção da lipase em nanopartículas magnéticas de Fe2O3, assim como a 
caracterização desta enzima imobilizada em relação a sua estabilidade em diferentes 
temperaturas e pH, eficiência da imobilização e atividade hidrolítica. 
Embora a lipase de Y. lipolytica seja uma potente lipase microbiana, estudos sobre a 
sua caracterização em relação a seletividade frente ao substrato é escassa. Recentes trabalhos 
abordaram quanto à regiosseletividade desta lipase em reações de hidrólise, porém nenhum 
deles apresentou esta caracterização com detalhes. Casas-Godoy et al (2014) avaliaram a 
regiosseletividade da lipase extracelular de Y. lipolytica (YlLip2) em reações de hidrólise e 
apresentou considerável tiposseletividade para o DHA em óleos de atum, em comparação 
com as lipases comerciais de Candida rugosa e Thermomyces lanuginosus, mostrando ser 
eficaz no processo de purificação deste ácido graxo. Kumari (2012) e Kamoun et al (2015) 
abordaram a atividade lipolítica da YlLip8, lipase ligada à membrana, em padrões de TAGs 
com AGCC, ácidos graxos de cadeia média (AGCM) e AGCL. A lipase não apresentou 
regiosseletividade em reações de hidrólise desses TAGs. Adicionalmente, não há nenhum 
estudo que avalie o comportamento da lipase de Y. lipolytica em reações de síntese reversa, 
tanto para a sua caracterização da regiosseletividade como também na preferência em 
esterificar um tipo específico de ácido graxo. 
 Entretanto, é muito provável que a lipase extracelular (YlLip2) de Y. lipolyica 
apresente a caracterização frente ao substrato bastante semelhante a lipase de Rhizomucor 
miehei (Lipozyme-IM), fortemente 1,3-regiosseletiva e tiposseletiva, preferencialmente, 
 
 
38 
 
 
 
para alguns AGS isolados e AGs insaturados (AGIs), em reações de hidrólise e síntese 
reversa. Isso devido a configuração 3D da YlLip2 apresentar expressiva similaridade com 
essa lipase (Bordes et al, 2010; Bordes, 2011). Por esta lipase apresentar ser uma potente 
lipase microbiana, torna-se interessante um estudo mais aprofundado quanto a esta 
seletividade tanto em hidrólise, como também em reações se síntese reversa. 
 
 
 
39 
 
 
 
3. APLICAÇÕES DE LIPASES EM MODIFICAÇÕES LIPÍDICAS 
 
O grande interesse na produção de lipases microbianas tem crescido nas últimas 
décadas devido ao seu largo potencial em aplicações industriais. Pesquisadores e indústrias 
estão cada vez mais interessados nos processos enzimáticos, visando diminuição de custos 
de processo, diminuição de resíduos e subprodutos oriundos de rotas químicas e, 
principalmente, obtenção de novos e mais saudáveis produtos que atendam as necessidades 
do mercado consumidor (Akanbi, 2015). 
As enzimas relacionadas a alimentos constituem o maior segmento de enzimas 
industriais (World Enzymes, 2011). Uma das principais atividades das lipases utilizadas em 
indústrias de alimentos é na produção de AGs, responsáveis pelo desenvolvimento do aroma 
e sabor, principalmente de queijos (Akin et al, 2003). Esta característica é muito bem 
explorada pela indústria de laticínios pela atuação das lipases na hidrólise da gordura do 
leite, gerando AGLs que são marcantes para a produção das características específicas do 
flavour do queijo em questão (Hasan, 2006). Entretanto, desde algumas décadas até hoje, o 
mercado promissor das lipases está focado na modificação de lipídeos, aumentando o valor 
comercial e nutritivo desses alimentos (Undurraga et al, 2001; Bednarski, 2003; Kanjilal et 
al, 2013). 
As lipases microbianas são utilizadas na purificação de óleos, como por exemplo, na 
obtenção de ácidos graxos poli-insaturados (AGPIs) a partir de óleos vegetais, que 
apresentam propriedades físico-químicas benéficas à saúde. Estes AGs podem ser utilizados 
como aditivos alimentares, bem como na produção de leites e derivados, biscoitos, pães e 
óleos enriquecidos (Belarbi, 2000). Estudos já isolaram AGs de interesse nutricional, como 
o ácido α-linolênico e o DHA, para serem implementados em outros óleos que não 
contenham estes ácidos graxos em sua composição (Casas-Godoy et al, 2014). 
No entanto, é sabido que as propriedades funcionais dos óleos estão diretamente 
relacionadas com o seu perfil de TAGs e também de antioxidantes. As características físicas 
e propriedades nutricionais dos óleos dependem da composição dos seus AGs, além de suas 
localizações nas posições sn-1, 2 ou 3 na molécula de glicerol (Lísa, 2008). Com isso, o 
mercado de lipases para a modificação de óleos e gorduras para síntese de novos lipídios 
com propriedades desejáveis é de extremo interesse, pois além de essas enzimas 
promoverem reações que são consideradas renováveis, elas são altamente seletivas e 
específicas na produção destes compostos (De Lima, 2013). As lipases podem proporcionar, 
com sucesso, a produção de lipídios estruturados, ou TAGs estruturados (TAGs-ES), que 
 
 
40 
 
 
 
são novos TAGs com composição de AGs e/ou localização dos AGs diferenciada em 
comparação com os TAGs de origem. Estes novos óleos são ditos como a nova geração de 
lipídios, sendo considerados como alimentos funcionais (Akoh, 2002; Bednarski, 2003; 
Combon, 2008). 
Devido a todas essas características apresentadas sobre as lipases, principalmente as 
microbianas, torna-se cada vez mais interessante a utilização dessas enzimas como 
biocatalisadores na produção de novos lipídios, em função de sua alta seletividade catalítica 
e potencial adequação do processo como tecnologia renovável (De Lima, 2013). Portanto, a 
caracterização da seletividade das lipases frente ao substrato que, anteriormente ainda não 
foi realizada, pode expandir as aplicações biotecnológicas da enzima, podendo ser 
efetivamente utilizada na customização de óleos e, consequentemente, agregando maior 
valor às lipases microbianas. 
 
 
 
41 
 
 
 
4. LIPÍDIOS NA NUTRIÇÃO HUMANA 
 
Lipídios são biomoléculas derivadas química ou bioquicamente de AGs que, por sua 
vez, são ácidos monocarboxílicos de cadeia aberta, em geral linear e de cadeia par, que 
podem ser saturados ou apresentar uma ou mais ligações duplas. As classes químicasde 
lipídios são variadas e incluem AGs e seis ésteres, esteroides, terpenos, isoprenoides, entre 
outros compostos que tendem a apresentar elevada solubilidade em solventes orgânicos, tais 
como éter, clorofórmio e acetona, e baixa solubilidade em água (Christie, 2010). 
Os óleos vegetais, juntamente com a gordura animal, consistem em uma das 
principais fontes de lipídios na alimentação humana, são basicamente constituídos por 
TAGs. Os TAGs são mais comumente formados por AGs com 12, 14, 16 e/ou 18 átomos de 
carbono (C), embora AGs com menor ou maior número de C sejam encontrados em óleos 
vegetais. Devido à enorme variedade de AGs, fica evidente que os óleos são compostos de 
muitos tipos de TAGs, variando na composição em AGs (Tabela 3, Lísa, 2008) e nas 
posições às quais estão esterificados ao glicerol. 
 
Tabela 3: Composição média dos ácidos graxos majoritários em alguns dos óleos vegetais com alta 
produção mundial. 
 
Ácidos graxos 
Conteúdo (g/ 100g) nos óleos 
Oliva Soja Girassol Canola Amendoim 
16:0 7,50 – 20,0 8,00 – 13,5 3,60 – 6,00 1,50 – 6,00 8,00 – 14,0 
18:0 0,50 – 5,00 2,00 – 5,40 0,90 – 4,00 0,50 – 3,10 1,00 – 4,50 
18:1n-9 55,0 – 83,0 17,0 – 30,0 14,0 – 39,4 50,0 – 60,0 35,0 – 69,0 
18:2n-6 3,50 – 21,0 48,0 – 59,0 48,3 – 74,0 11,0 – 23,0 12,0 – 43,0 
18:3n-3 0,10 – 0,50 4,50 – 11,0 ND – 0,30 5,00 – 13,0 ND – 0,3 
Fonte: Codex Alimentarius, 1981; Codex ALimentarius, 1999. 
 
Os TAGs da dieta têm importante papel como fonte de energia (9 Kcal/g), são fonte 
de AGs essenciais (linoleico e linolênico), consistem na principal fonte de AGIs para o 
organismo que terão importante papel estrutural nos lipídios de membranas celulares, são 
veículos para absorção de vitaminas lipossolúveis e outros compostos não polares, entre 
outros. No organismo humano, a maior reserva de energia se localiza no tecido adiposo 
subcutâneo na forma de TAGs (Gusntone, 2006; McClements, 2010). 
Além dessas funções, as funcionalidade das gorduras e dos óleos vegetais está 
relacionada com a composição dos TAGs, no que diz respeito aos AGs em cada molécula 
 
 
42 
 
 
 
desses lipídios somado à sua distribuição posicional no glicerol, que são representadas pelo 
sistema de numeração estereoespecífica (stereospecific numbering, sn) sn-1, 2 e 3 
(Senanayake, 2005; Lísa, 2008). As posições sn-1 e sn-3 designam as mais externas (ésteres 
primários) no TAG e sn-2 a posição central (éster secundário). A posição de esterificação do 
AG no glicerol influencia diretamente na sua absorção no trato gastrointestinal, no 
metabolismo dos enterócitos e quilimícrons e, consequentemente, na sua distribuição nos 
tecidos (Senanayake, 2005; Gunstone, 2006). 
Os TAGs ingeridos pela dieta são emulsinonados pela ação dos sais biliares, 
fosfolipídios da dieta e AGLs e MAGs formados pela hidrólise de TAGs no duodeno. A 
formação desse sistema disperso, emulsionado, provoca a ativação da lipase pancreática, que 
é a principal enzima responsável pela hidrólise de TAGs da dieta. Esta lipase atua na 
interface óleo/água, hidrolisando TAGs em AGLs e MAGs. Eventualmente, são formados 
micelas mistas, ricas em compostos anfipáticos e pobres em TAGs e outros lipídios neutros, 
que se desprendem das gotas de lipídios maiores e são suficientemente pequenas e polares 
para aproximar da membrana dos enterócitos, permitindo a absorção de compostos 
lipofílicos. Os AGs em sn-1 e 3 dos TAGs são hidrolisados preferencialmente pela lipase 
pancreática (regiosseletiva), formando AGLs e 2-MAGs, prontamente absorvíveis pelos 
enterócitos. Portanto, os AGs em sn-2 nos TAG originais, que em geral são insaturados, são 
absorvidos como MAGs e tenden a ser dirigidos nos enterócitos para a síntese de 
fosfolipídios, que são, por sua vez, preferencialmente captados pelo fígado no período pós-
prandial (Hunter, 2001). Dessa forma, os AGs em sn-2 nos TAGs da dieta têm um papel 
importante em direcionar AGs insaturados para lipídios estruturais no organismo. Portanto, 
AGCLs esterificados na posição sn-2 do TAG são melhor absorvidos e direcionados 
metabolicamente. Além disso, AGCL na forma livre interagem mais facilmente com cátios 
divalentes, como o cálcio, tornando-se insolúveis no meio alcalino do intestino e, portanto, 
menos biodisponíveis (Hunter, 2001; Gunstone, 2006). 
O tipo de AG nas posições sn-1 e sn-3 do TAG irá influenciar sua dispersabilidade 
nas micelas mistas e, portanto, pode interferir na facilidade de absorção dos lipídios. Por 
exemplo, TAG composto por AGCM nas posições externas (sn-1 e sn-3) do TAG são 
facilmente absorvíveis no trato gastroentérico, por diversos fatores. Os AGCM nessas 
moléculas de TAG podem ser hidrolisados pela lipase gástrica, além da pancreática, 
acelerando a absorção. Além disso, TAG com AGCM em sn-1 e sn-3 podem ser absorvidos 
diretamente, sem hidrólise prévia e transferidos para a corrente sanguínea, onde se ligam à 
albumina, e são transportados até o fígado através da veia porta. Portanto, TAGs contendo 
 
 
43 
 
 
 
AGCM nas posições externas podem ser usados como fonte rápida de energia em algumas 
síndromes absortivas, como por exemplo, na deficiência de enzima pancreática (Berry, 
2007). Na Figura 8, é possível observar uma apresentação resumida de oito etapas que 
compõe o processo digestivo e absortivo de lipídios provenientes da alimentação. 
 
 
Figura 8: Apresentação resumida de oito etapas que compõe o processo de digestão e absorção de 
lipídios provenientes da alimentação (Nelson, 2002). 
 
No enterócito jejunal, AGLs e 2-MAGs são convertidos a TAGs e fosfolipídios, que 
juntamente a outros compostos, tais como colesterol, vitaminas lipossolúveis, entre outros, 
formam lipoproteínas denominadas de quilimícrons. Os quilomícrons não entram no sangue 
portal, pois são demasiadamente grandes para penetrar nos capilares intestinais e, portanto, 
são transportados em princípio pela circulação linfática. Os TAGs nos quilomicrons 
circulantes são hidrolisados pela lipase lipoproteínas na parede do endotélio vascular, no 
tecido adiposo subcutâneo. A hidrólise dos TAGs e captação dos AGs produzidos aumentam 
a densidade dessas lipoproteínas que eventualmente, como quilimícrons remanescentes, são 
captados pelo fígado (Berry, 2007). 
O conhecimento desses processos de absorção e metabolismo pós-prandial de 
lipídios dietéticos tem estimulado a investigação da distribuição de AGs na molécula de 
 
 
44 
 
 
 
TAG, assim como sua alteração por vias tecnológicas para a produção de lipídios 
estruturados. Grande parte dessa motivação dirige para os lipídios que apresentam 
funcionalidade nutricional agregada, pois podem atuar na prevenção e/ou tratamento de 
diversas enfermidades (Berry, 2007). 
 
4.1 Ácidos graxos insaturados 
 
Os óleos vegetais, que são utilizados como alimentos, são amplamente consumidos 
no mundo, pois são as principais fontes lipídicas da dieta (USDA, 2015). A atração da 
população pelo consumo dos óleos vegetais está relacionada, principalmente, ao baixo custo, 
com os ácidos graxos insaturados (AGIs) e com os compostos polares bioativos, como os 
compostos fenólicos, por exemplo. Os óleos vegetais são basicamente constituídos por 
TAGs, que apresentam 3 moléculas de AGs esterificados na molécula de glicerol. A 
presença de insaturações na molécula dos AGs permite classificar os AGs em 
monoinsaturados (AGMI) e poli-insaturados (AGPI; mais de uma dupla ligação). Aquele 
AG que não apresenta nenhuma insaturação é denominado de saturado (AGS). Entretanto, 
os óleos vegetais apresentam, predominantemente, TAGs com AGIs, logo os óleos são ditos 
como fonte de AGCL com insaturações em sua molécula. Alguns óleos, como o azeite de 
oliva e o óleo de amendoim, apresentam com destaque os AGMI (ácido oleico, 18:1n-9, 
principalmente), porém em outros óleos, como a soja e o girassol, destacam-se os AGPIs 
(ácidos linoleico, 18:2n-6, e linolênico,