Natalia-Lyrio-DISSERTACAO

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Universidade Federal do Rio de Janeiro 
Instituto de Química 
Programa de Pós-graduação em Ciência de 
Alimentos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATÁLIA NEY LYRIO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E DO PODER 
SURFACTANTE DAS SAPONINAS DO JUÁ (Ziziphus joazeiro) 
MODIFICADAS ENZIMATICAMENTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2016 
Natália Ney Lyrio 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E DO PODER 
SURFACTANTE DAS SAPONINAS DO JUÁ (Ziziphus joazeiro) 
MODIFICADAS ENZIMATICAMENTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de mestrado 
apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciência de 
Alimentos, do Instituto de Química 
da Universidade Federal do Rio de 
Janeiro objetivando a obtenção do 
título de Mestre em Ciências. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Orientadora: Profa. Maria Alice Zarur Coelho, D.Sc. 
 
Co-orientador: Prof. Bernardo Dias Ribeiro, D.Sc. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2016 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lyrio, Natália Ney. 
 
Avaliação da atividade antimicrobiana e do poder surfactante das 
saponinas do juá (Ziziphus joazeiro) modificadas enzimaticamente – Rio de 
Janeiro: UFRJ, 2016. 
 
65 f. 
 
 
Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal do Rio de 
Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Ciência de 
Alimentos, 2016. 
 
 
Orientadores: Maria Alice Zarur Coelho e Bernardo Dias Ribeiro. 
 
 
1. saponinas. 2. juá. 3. enzimas. 4.antimicrobiano. 5. surfactante. I. Coelho, Maria 
Alice Zarur. (orient). II. Ribeiro, Bernardo Dias. (orient). III. Universidade Federal do Rio 
de Janeiro. Programa de Pós Graduação em Química. IV. Título. 
 
 
 
 
Natália Ney Lyrio 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E DO PODER 
SURFACTANTE DAS SAPONINAS DO JUÁ (Ziziphus joazeiro) 
MODIFICADAS ENZIMATICAMENTE 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de mestrado 
apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciência de 
Alimentos, do Instituto de Química 
da Universidade Federal do Rio de 
Janeiro objetivando a obtenção do 
título de Mestre em Ciências. 
 
 
Aprovada em 
 
 
 
_____________________________________________________ 
Orientadora: Maria Alice Zarur Coelho, D.Sc. (EQ/UFRJ) 
 
 
 
_____________________________________________________ 
Orientador: Bernardo Dias Ribeiro, D.Sc. (EQ/UFRJ) 
 
 
 
_____________________________________________________ 
Alexandre Guedes Torres, D.Sc. (IQ/UFRJ) 
 
 
 
_____________________________________________________ 
Gizele Cardoso Fontes Sant’Ana, D.Sc. (IQ/UERJ) 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2016 
AGRADECIMENTOS 
 
 Agradeço a Deus, por me presentear com tamanho desafio e por ser tão generoso 
em permitir que eu pudesse contar com a ajuda de tantas pessoas especiais. Agradeço à 
minha linda família, em especial aos meus pais, Rodolpho e Arina, que sempre me 
deram toda a estrutura para que eu pudesse alcançar os meus objetivos e o fizeram com 
o amor mais lindo que eu poderia receber nesse mundo. Obrigada por cuidarem de mim, 
por me entenderem e por serem a minha melhor companhia. Obrigada aos meus irmãos 
e cunhada, Daniel, Felipe e Flávia, por serem, além de tudo, verdadeiros amigos, que eu 
tanto amo. 
 Agradeço aos meus amigos, que entenderam minhas ausências, minhas recusas 
de convites, meus adiamentos de encontros e meu humor, muitas vezes diferente do 
normal. Todos vocês foram importantes na minha jornada, ouvindo minhas dificuldades 
e ansiando, tanto quanto eu pelas minhas vitórias. 
 Às amigas de toda minha vida acadêmica, Ana Paula, Gabriela, Thaís e Marcela, 
com quem sei que posso contar, para o que for, meu muito obrigada por fazerem parte, 
tão de perto, da minha história e pelo suporte de sempre. Gostaria de agradecer, 
também, àquelas do meu convívio diário, pessoas que conheci há pouco tempo, mas que 
já levo no coração, pela forma carinhosa como me tratam, por terem se preocupado, 
acompanhado de perto todo meu esforço e por me darem o amparo que eu precisei: 
Juliana, Sandra, Helayne e Gabi. 
 Agradeço, de todo o coração, ao Renato, um grande companheiro, que se privou 
junto comigo de muitos finais de semana ensolarados e me proporcionou um ambiente 
propício ao estudo e à concentração, fundamental ao longo desse trabalho. Agradeço ao 
Rodrigo e ao Diego, que se dispuseram a tirar minhas dúvidas. E ao amigo Vinicius, por 
ter sido o porta-voz da esperança, quando eu achei que não teria forças para continuar. 
O seu recado ficou marcado em mim durante todo esse tempo. 
 Gostaria de agradecer especialmente àquela que esteve ao meu lado, desde o 
início de tudo, aquela que aprendeu junto comigo dos princípios mais básicos da 
química até a defesa do mestrado. Marselle, você e Rafael fazem jus ao significado da 
palavra amizade e contribuíram de sobremaneira para a realização deste trabalho. Vocês 
não fazem ideia do quanto foi importante tê-los por perto nos momentos em que mais 
precisei. 
 Agradeço profundamente aos meus orientadores, professores Maria Alice e 
Bernardo Dias, pela paciência, confiança e por todo o conhecimento passado através 
dessa bela profissão que escolheram. Entre tantas outras coisas, agradeço ao Prof. 
Bernardo pelas portas sempre abertas, e à Prof. Maria Alice por sua força, que nos traz 
confiança e conforto. 
 Agradeço a todos os membros do Grupo Biose, companheiros de laboratório, 
especialmente à doutoranda e amiga Ariane Gaspar, que me orientou durante todo o 
trabalho e com quem tive oportunidade de aprender tanto. E ao amigo Felipe Vale, que 
tanto contribuiu com suas boas ideias e ajudas. 
 Agradeço ao programa e aos professores do PPGCAL, em especial os 
Professores Alexandre Torres e Daniel Perrone, que me abriram as portas do seu 
laboratório, ao seu aluno e hoje meu amigo Fabrício Silva, que se dispôs a me ajudar a 
operar o rotaevaporador, e a todos eles por compartilharem seus conhecimentos na área 
de cromatografia. 
 Agradeço, finalmente, à CAPES pelo incentivo financeiro concedido através de 
bolsa de estudos, à Fiocruz, pelo fornecimento dos micro-organismos, e ao 
CENPES/Petrobras, pela análise das amostras por cromatografia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Nossa maior fraqueza está em 
desistir. O caminho mais certo de 
vencer é tentar mais uma vez.” 
Thomas Edison 
 
RESUMO 
 
LYRIO, Natália Ney. Avaliação da atividade antimicrobiana e do poder 
surfactante das saponinas do juá (Ziziphus joazeiro) modificadas 
enzimaticamente. Rio de Janeiro, 2016. Dissertação (Mestrado em Ciência de 
Alimentos) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio 
de Janeiro, 2016. 
 
Saponinas são glicosídeos encontrados, principamente, em vegetais 
superiores, mas também em alguns animais marinhos invertebrados. Possuem 
um esqueleto triterpênico ou esteroidal ligado a cadeias de açúcares através de 
uma ou mais ligações glicosídicas. A estrutura das saponinas apresenta 
característica anfifílica, o que faz com que essas substâncias apresentem 
propriedades surfactantes. Neste trabalho, investigaram-se as saponinas 
triterpênicas do juá (Ziziphus joazeiro), avaliando-se não só seu poder 
tensoativo, através da determinação da sua concentração micelar crítica (CMC) 
e do seu índice de emulsificação 24 horas (IE24), como também sua atividade 
antimicrobiana, pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) 
contra Salmonella choleraesuis (ATCC 10708), Escherichia coli (ATCC 8739), 
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), 
Bacillus subtilis (ATCC 6633) e Candida albicans (ATCC 10231). 
Posteriormente, as saponinas do juá foram submetidas a reações de hidrólise 
enzimática por três enzimas comerciais: Viscozyme L (celulases e 
hemicelulases), Ultrazym AFPL (pectinases) e Celluclast 1.5L (celulases). As 
condiçõesreacionais utilizadas foram pH 5, temperatura 50ºC, rotação 200 
rpm, concentração de saponina igual a 1%, enzima 5% (v/v) e tempo reacional 
mínimo de 24 horas. Os produtos das reações foram caracterizados por HPLC-
MS e avaliados quanto às propriedades surfactantes e antimicrobiana. A 
Celluclast foi a enzima que mais produziu compostos hidrolizados. Não houve 
alteração das propriedades surfactantes após a modificação enzimática das 
saponinas. As saponinas originais do juá apresentaram atividade contra C. 
albicans em concentrações entre 2,5 e 0,313 mg/mL, mas não apresentaram 
atividade contra nenhuma das bactérias testadas. As saponinas modificadas 
não apresentaram atividade contra nenhum dos micro-organismos testados. 
Observou-se uma relação entre a MIC e a CMC, indicando que o poder 
antimicrobiano de compostos surfactantes depende de como as moléculas se 
encontram em solução: na forma livre ou em micelas. 
 
 
 
 
 
 
Palavras-chave: Saponinas, juá, hidrólise, enzimas, surfactantes, 
antimicrobiano. 
 
ABSTRACT 
 
LYRIO, Natália Ney. Antimicrobial and surfactant activities of jua (Ziziphus 
joazeiro) enzymatically modified saponins. Rio de Janeiro, 2016. 
Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) – Instituto de Química, 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016. 
 
Saponins are glycosides mainly found in many higher plants but also in some 
marine invertebrates. They have a triterpenic or steroid skeleton linked to one or 
more sugar chains by glycosidic linkages. The structure of saponins has 
amphiphilic character, which makes these substances exhibit surfactant 
properties. In this work, we investigated the triterpenic juá saponins (Ziziphus 
joazeiro), evaluating not only their surfactant power, by determining the critical 
micellar concentration (CMC) and its 24 hours emulsification index (IE24), as 
well its antimicrobial activity, by determining the minimum inhibitory 
concentration (MIC) against Salmonella choleraesuis (ATCC 10708), 
Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), 
Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Bacillus subtilis (ATCC 6633) and 
Candida albicans (ATCC 10231). Subsequently, the juá saponins were 
subjected to enzymatic hydrolysis reactions of three commercial enzyme: 
Viscozyme L (cellulases and hemicellulases) Ultrazym AFPL (pectinase) and 
Celluclast 1.5L (cellulases). The reactions were conducted in pH 5, temperature 
50 ° C, 200 rpm, saponin concentration of 1% enzyme 5% (v / v) and minimal 
reaction time of 24 hours. The products of the reactions were characterized by 
HPLC-MS and evaluated for surfactants and antimicrobial properties. Celluclast 
enzyme produced more hydrolyzed compounds. There was no change in the 
surfactant properties after enzymatic modification of saponins. The original juá 
saponins showed activity against C. albicans at concentrations between 2.5 and 
0.313 mg / ml, but showed no activity against any of the bacteria tested. The 
modified saponins showed no activity against any of the tested microorganisms. 
It was observed a relationship between MIC and CMC, indicating that the anti-
microbial power of surfactant compounds depends on how the molecules are in 
solution: in free form or in micelles 
 
 
 
 
 
Keywords: Saponins, jua, hydrolysis, enzymes, surfactants, antimicrobial. 
 
Lista de Tabelas 
 
Tabela 1. Concentração final (em µmols equivalentes em glicose/mL) de 
açúcares redutores no meio após hidrólise enzimática.....................................44 
 
 
Lista de Ilustrações 
 
Figura 1. Disposição preferencial dos surfactantes nas interfaces ................................. 19 
Figura 2. Influência da formação de micelas nas propriedades físicas das soluções de 
surfactantes .......................................................................................................................... 21 
Figura 3. Esqueletos representativos de saponinas triterpênicas (ácido oleanólico) e 
esteroidais (diosgenina). ..................................................................................................... 23 
Figura 4. Saponinas esteroidais com esqueletos do tipo furostano e espirostano (R= 
açúcares). ............................................................................................................................. 24 
Figura 5. Estruturas dos 10 tipos de esqueletos triterpênicos das saponinas. .............. 24 
Figura 6. Estruturas das saponinas isoladas da banana-de-papagaio. .......................... 27 
Figura 7. Saponinas encontradas no juá. .......................................................................... 30 
Figura 8. Fluxograma do método de extração das saponinas. ........................................ 36 
Figura 9. Esquema ilustrativo do método de microdluição para determinação da MIC.40 
Figura 10. Curva-padrão de calibração do método DNS. ................................................ 42 
Figura 11. Cromatograma das amostras de saponinas a 203 nm................................... 45 
Figura 12. Cromatograma em escala aumentada, do tempo 30 a 48 minutos. ............. 46 
Figura 13. Espectro de massa do pico de tr=17,117 no modo negativo. ........................ 47 
Figura 14. Espectro de massas do pico de tr=20,496 no modo negativo. ...................... 48 
Figura 15. Espectro de massas do pico de tr=24,531 no modo negativo. ...................... 48 
Figura 16. Espectro de massas do pico de tr=29,354 no modo negativo. ...................... 49 
Figura 17. Espectro de massas do pico de tr=30,5 minutos no modo positivo. ............. 50 
Figura 18. Espectro de massas do pico de tr=33,5 minutos no modo positivo. ............. 50 
Figura 19. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina não-
modificada............................................................................................................................. 51 
Figura 20. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina 
modificada pela Viscozyme ................................................................................................. 52 
Figura 21. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina 
modificada pela Ultrazym. ................................................................................................... 52 
Figura 22. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina 
modificada pela Celluclast. .................................................................................................. 53 
Figura 23. Índice de emulsificação 24 horas para a saponina não-modificada e para as 
modificadas pelas enzimas Viscozyme, Ultrazym e Celluclast, nas concentrações 0,1 e 
1 g/L....................................................................................................................................... 53 
 
file:///E:/DISSERTACAO%20-%20Copia.docx%23_Toc464587315
Lista de Abreviaturas e Siglas 
 
ATCC American Type Culture Collection 
BHI Brain Heart Infusion 
CLSI/NCCLS Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards 
CMC Concentração Micelar Crítica 
DNS ácido 3,5-dinitrosalicílico 
ESI Ionização por Eletrospray 
Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz 
HPLC High Performance Liquid Chromatography 
IE24 Índice de Emulsificação 24 horas 
MIC Minimal Inhibitory Concentration 
g Micrograma 
mg Miligrama 
mL Mililitro 
MS Mass spectrometer 
pH Potencial hidrogeniônico 
rpm Rotações por minuto 
RPMI Roswell Park Memorial Institute 
Tween 80 Poloxietileno monooleato de sorbitana 
UV Ultravioleta 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14 
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 17 
2.1. SURFACTANTES .............................................................................................17 
2.1.1. Classificação dos Surfactantes ............................................................... 17 
2.1.1.1. Quanto à Natureza da Parte Hidrofílica................................................... 17 
2.1.1.2. Sintéticos x Naturais.................................................................................. 18 
2.1.2. Comportamento dos Surfactantes em Solução ................................... 19 
2.1.3 Emulsões ..................................................................................................... 21 
2.1.4. Formação de espuma ................................................................................ 22 
2.2. SAPONINAS ..................................................................................................... 22 
2.2.1. Classificação ................................................................................................ 23 
2.2.2. Fontes de Saponinas ................................................................................. 25 
2.2.3. Propriedades ................................................................................................ 25 
2.2.3.1. Poder Surfactante...................................................................................... 26 
2.2.3.2. Interação com esteróis .............................................................................. 26 
2.2.3.3. Atividade Antimicrobiana .......................................................................... 27 
2.2.4. Saponinas do Juá ...................................................................................... 28 
2.2.5. Modificação Estrutural das Saponinas ........................................................ 31 
2.2.5.1. Enzimas como Bioconversores ................................................................ 31 
3. OBJETIVOS .............................................................................................................. 34 
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 34 
4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 35 
4.1. MATERIAIS ....................................................................................................... 35 
4.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .......................................................... 35 
4.2.1. Extração e Hidrólise Total das Saponinas ............................................ 35 
4.2.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas ............................................... 35 
 
4.2.1.2. Hidrólise Total das Saponinas ....................................................................... 36 
4.2.2. Modificação Enzimática das Saponinas ................................................. 37 
4.2.3. Caracterização das Saponinas ................................................................. 38 
4.2.4. Concentração Micelar Crítica (CMC) ....................................................... 39 
4.2.5. Índice de Emulsificação (IE24) ................................................................... 39 
4.2.6. Atividade Antimicrobiana das Saponinas do Juá ................................. 39 
4.2.6.1. Cultivo e Preparo do Inóculo .................................................................... 40 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................... 42 
5.1. EXTRAÇÃO E HIDRÓLISE TOTAL DAS SAPONINAS .............................. 42 
5.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas .............................................. 42 
5.1.2. Hidrólise Total das Saponinas .................................................................. 42 
5.2. MODIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DAS SAPONINAS ....................................... 43 
5.3. CARACTERIZAÇÃO DAS SAPONINAS ....................................................... 44 
5.4. CONCENTRAÇÃO MICELAR CRÍTICA ........................................................ 51 
5.5. ÍNDICE DE EMULSIFICAÇÃO (IE24) .............................................................. 53 
5.6. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS SAPONINAS DO JUÁ .................... 54 
6. CONCLUSÕES E SUGESTÕES ............................................................................ 57 
7. PERSPECTIVAS ...................................................................................................... 59 
8. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 60 
14 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
Saponinas é o nome genérico dado a glicosídeos oriundos do metabolismo 
secundário dos vegetais. Consistem em um esqueleto derivado de 
isoprenóides, triterpênico ou esteroidal, denominado aglicona ou sapogenina, 
ligado a cadeias de açúcares através de uma ou mais ligações glicosídicas 
(Augustin et al., 2011). Assim como outros metabólitos secundários, tais como 
fitoesteróis, carotenóides, entre outros, as saponinas não desempenham papel 
essencial no crescimento das plantas, mas desempenham funções fisiológicas 
que favorecem sua sobrevivência, sendo parte do sistema de defesa dos 
organismos vegetais (Kalinowska et al., 2005 apud Ribeiro, 2012). 
O nome “saponina” está relacionado à capacidade dessas substâncias 
formarem espumas estáveis em soluções aquosas, da mesma forma que os 
sabões (Vincken et al., 2007; Wang et al., 2011). Essa propriedade é devida ao 
caráter anfifílico de suas moléculas, que possuem uma parte lipofílica 
(aglicona) e uma parte hidrofílica (cadeia de açúcares). Tal característica faz 
com que as saponinas sejam classificadas como surfactantes naturais. 
As saponinas, assim como os fosfolipídeos e algumas proteínas ou 
hidrolisados proteicos, apresentam-se como alternativas mais verdes em 
relação aos surfactantes sintéticos, devido à sua maior biodegradabilidade, 
menor toxicidade e por serem extraídos de fontes renováveis, ao contrário dos 
surfactantes sintéticos, que possuem o petróleo como matéria-prima (Nitschke 
& Pastore, 2002). 
Encontradas naturalmente em alguns alimentos, como alho-poró, cebola, 
beterraba, erva-mate, entre outros, as saponinas encontram-se inseridas na 
nossa dieta. Das fontes de saponina que compõem a biodiversidade brasileira, 
o juá (Ziziphus joazeiro) apresentou-se com o maior potencial de aplicação, em 
razão de suas propriedades tensoativas, como capacidade de redução da 
tensão superficial da água e índice de emulsificação, serem mais expressivas 
que as de saponinas oriundas de diversos vegetais estudados. Ainda assim, os 
índices de emulsificação encontrados são baixos em relação aos surfactantes 
comerciais, indicando que a saponina do juá deveria ser utilizada em conjunto 
15 
 
 
com outro surfactante, na estabilização de emulsões (Ribeiro, 2012). 
Entretanto, a presença de grupos sulfato em algumas saponinas encontradas 
no juá (Higuchi et al., 1984) amplia seu uso como surfactante, uma vez que 
elas podem apresentar-se com caráter aniônico, ao contrário da maioria das 
saponinas, que são surfactantes não-iônicos. 
A aplicação das saponinas, entretanto, vai além de sua atuação como 
surfactante. Elas têm potencial aplicação industrial também como 
preservativos, modificadores de sabor e até como agentes de remoção de 
colesterol de laticínios (Guclu-Ustundag & Mazza, 2007; San Martin & Briones, 
1999 apud Augustin et al., 2011). Com relação à sua potencial atividade 
antimicrobiana, saponinas de diversas fontes vegetais são citadas como 
portadoras de atividade antifúngica (Yang et al., 2006), porém não costumam 
ser eficientes em sua ação antibacteriana (Hostettmann & Marston, 2005). 
As propriedades funcionais, bem como as propriedades físico-químicas, 
são consequências da estrutura química das moléculas. Alterações na 
estrutura provocam, via de regra, alterações físico-químicas, uma vez que a 
massa e a geometria molecular são determinantes para tais propriedades,sendo relativamente fácil prever de que forma essas mudanças estruturais irão 
afetá-las. Quanto às propriedades funcionais, como a atividade antimicrobiana 
e o poder surfactante, por exemplo, tal relação de causa e efeito não é 
previsível. 
Nesse sentido, dada a imensa diversidade estrutural e de atividades das 
saponinas, ainda não é possível prever que tipo de atividade cada uma irá 
apresentar apenas conhecendo sua estrutura. Por se tratar de uma 
biomolécula com grande potencial tecnológico, estudos experimentais acerca 
da relação atividade/estrutura ainda são necessários e de grande relevância 
para seu melhor entendimento e definição de novos rumos de pesquisa 
(Augustin et al., 2011). 
Liu et al. (2013) avaliaram a relação estrutura-bioatividade de saponinas 
naturais e modificadas quimicamente, observando aumento da citotoxicidade 
de saponinas contra células cancerígenas quando se aumentava a cadeia de 
açúcares, entre outras conclusões. Feng et al. (2015) modificaram saponinas 
16 
 
 
de chá através de esterificação, obtendo saponinas modificadas com maior 
poder surfactante. 
Uma estratégia verde para serem obtidas saponinas modificadas é 
através de reações enzimáticas. Wie et al. (2007) utilizaram β-glicosidase e α-
rhamnosidase obtidas de Aspergillus niger para modificar enzimaticamente 
saponinas de Platycodon grandiflorum, obtendo saponinas com cadeia lateral 
de açúcares reduzida. Enzimas do tipo carboidrolases são biocatalisadores 
capazes de quebrar as ligações entre duas moléculas de açúcares, produzindo 
saponinas parcialmente hidrolisadas, o que pode ter algum efeito sobre suas 
propriedades, como o poder surfactante e a atividade antimicrobiana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
 
 
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
2.1. SURFACTANTES 
Surfactantes são moléculas que apresentam, em sua estrutura, uma 
parte apolar (hidrofóbica) e uma parte polar (hidrofílica). Essa característica 
anfifílica confere a elas algumas propriedades, tais como detergência, poder 
emulsificante e formação de espuma. 
De uma forma geral, os surfactantes atuam reduzindo a tensão 
interfacial entre duas fases imiscíveis. A tensão interfacial é definida como a 
energia livre da interface por unidade de área. Quanto maior essa energia, 
maior o trabalho necessário para expandir a interface (Tadros, 2005). 
As propriedades dos surfactantes fazem com que eles encontrem 
variadas aplicações na indústria, como na área de cosméticos, produtos de 
higiene e limpeza. Na indústria de petróleo, são importantes na recuperação 
terciária de óleo nos poços. Na indústria de alimentos, são utilizados como 
emulsificantes na formulação de diversos produtos, como achocolatados, leite 
em pó, pães, molhos, entre outros. 
 
2.1.1. Classificação dos Surfactantes 
Os surfactantes são classificados de acordo com a natureza da parte 
hidrofílica, que pode ser não-iônica, iônica (aniônica ou catiônica) ou anfótera. 
Podem, ainda, ser classificados como sintéticos ou naturais, sendo estes 
últimos subdivididos quanto à origem: microbiana ou vegetal. 
2.1.1.1. Quanto à Natureza da Parte Hidrofílica 
 A parte hidrofílica da molécula é a responsável pelo caráter iônico ou 
não-iônico dos surfactantes: se sua polaridade for grande o suficiente para 
gerar íons por dissociação (cargas verdadeiras), tem-se um surfactante 
aniônico ou catiônico, dependendo se a carga gerada na molécula for negativa 
ou positiva (Daltin, 2011). Exemplos de surfactantes aniônicos são os sabões 
(sais de ácido carboxílico) e os sulfatados, como o laurilsulfato de sódio. Os 
18 
 
 
surfactantes catiônicos são representados pelos sais quaternários de amônia 
(Peres, 2005). 
 Entretanto, se a parte polar da molécula apresentar apenas carga 
parcial, não havendo formação de íons, o surfactante é não-iônico. Existem, 
ainda, os surfactantes anfóteros, que são aqueles que podem apresentar-se 
carregados positiva ou negativamente, dependendo do pH do meio (Daltin, 
2011). 
2.1.1.2. Sintéticos x Naturais 
 Os surfactantes sintéticos são de origem petroquímica e encontram-se 
disponíveis comercialmente, com ampla aplicação industrial. Os álcoois 
sulfatados foram os primeiros surfactantes usados comercialmente. Depois, 
surgiram os alquilbenzenos sulfonados (ABS), que, por serem ramificados e, 
consequentemente, pouco biodegradáveis, foram substituídos pelo linear 
alquilbenzeno sulfonado (LAS), que é menos prejudicial ao meio ambiente 
(Peres, 2005). 
O mercado global de surfactantes foi avaliado pela Acmite Market 
Intelligence (2016) em aproximadamente US$ 30,65 bilhões em 2015. Com um 
crescimento esperado de 4,4% ao ano, espera-se que esse mercado chegue a 
US$ 39,69 bilhões em 2021. 
 Entretanto, em termos sustentáveis, os surfactantes naturais trazem 
inúmeras vantagens. Enquanto os surfactantes sintéticos são derivados de 
fontes fósseis, produzidos por processo que, em si, já traz impacto para o meio 
ambiente, os naturais são extraídos de fontes renováveis ou produzidos por 
micro-organismos, sendo muito menos agressivos por serem biodegradáveis e 
apresentarem baixa toxicidade, ao contrário dos sintéticos (Mulligan, 1993 apud 
Nitschke & Pastore, 2002). 
Os biossurfactantes incluem glicolipídeos, lipopeptídeos, lipoproteínas 
fosfolipídios e ácidos graxos, surfactantes poliméricos e surfactantes 
particulados produzidos por micro-organismos e são classificados de acordo 
com sua composição química ou origem microbiana (Desai, 1993 apud 
Nitschke & Pastore, 2002). São utilizados em várias aplicações, como na 
biorremediação de solos, na recuperação melhorada de petróleo, em 
19 
 
 
aplicações terapêuticas, na agricultura, na mineração, em produtos de higiene 
e cosméticos e na indústria de alimentos (Nitschke & Pastore, 2002). Apesar 
disso, ainda possuem um mercado muito menor do que o dos surfactantes 
sintéticos: espera-se atingir 2,3 milhões em 2020, segundo a Grand View 
Research, Inc (2016). 
Surfactantes também podem ser extraídos de fontes vegetais, como é o 
caso das saponinas, além de fosfolipídeos, proteínas ou hidrolisados proteicos. 
Um exemplo bem conhecido de surfactante natural é a lecitina de soja, mistura 
de fosfolipídeos amplamente utilizada na indústria alimentícia (Ribeiro, 2012). 
 
2.1.2. Comportamento dos Surfactantes em Solução 
 Devido ao seu caráter anfifílico, a solubilização de um surfactante em 
meio polar (como a água) ou apolar (como óleo) sempre envolve uma certa 
instabilidade, oriunda da não-afinidade de parte da molécula pelo meio 
solvente. A fim de diminuir essa instabilidade, as moléculas de surfactante 
tendem a migrar para as interfaces do sistema, sejam elas a superfície do 
líquido (interface líquido-ar), as paredes do sistema (interfaces líquido-sólido) 
ou a interface entre dois líquidos imiscíveis, se for um sistema com mais de 
uma fase. Dessa forma, a parte hidrofílica da molécula fica voltada para a fase 
mais polar, dando maior estabilidade ao sistema (Daltin, 2011). Esse processo 
é explicado na Figura 1, na qual a parte polar da molécula é representada por 
elipses. 
 
Figura 1. Disposição preferencial dos surfactantes nas interfaces 
Fonte: Daltin, 2011. 
20 
 
 
 Quando não há mais espaço para se dispor nas interfaces, as moléculas 
de surfactantes livres no meio do líquido começam a se agrupar. Por exemplo, 
em meio aquoso, essas moléculas se dispõem de forma que suas cadeias 
apolares se aproximem umas das outras, expondo as porções polares para o 
seio do líquido. Esse processo tem o mesmo objetivo que a disposição 
preferencial dos surfactantes quando se orientam perpendicularmente nas 
interfaces: diminuir a instabilidade do sistema, através da diminuição da 
energia livre. Às estruturas assim formadas, dá-se o nome de micelas, e 
concentração em que se inicia a formação de micelas é chamada 
Concentração Micelar Crítica(CMC) (Bordel & Giesecke, 2007; Daltin, 2011). 
 A CMC é uma importante propriedade, característica de cada 
surfactante. O processo de formação de micelas é fundamental para qualquer 
aplicação de um surfactante, uma vez que propriedades como emulsificação, 
detergência e formação de espuma só se pronunciam quando a concentração 
do surfactante é maior que a CMC (Jumpertz et al., 2010). 
A CMC pode ser determinada experimentalmente, aumentando-se 
gradativamente a concentração do surfactante em solução e observando-se a 
redução da tensão superficial que ocorre devido à migração das moléculas 
tensoativas para as interfaces líquido-ar e líquido-sólido. A tensão superficial 
cai com o aumento da concentração até que, na CMC, todas as interfaces 
estão saturadas e inicia-se a formação de micelas. Nesse ponto, a tensão 
deixa de variar e atinge um patamar mínimo, tornando possível a determinação 
da CMC graficamente (Daltin, 2011). Na CMC, ocorrem mudanças em 
propriedades macroscópicas da solução (Figura 2), sendo possível determiná-
las não só pelo acompanhamento da tensão superficial, como também pela 
variação da turbidez, pressão osmótica, solubilidade, condutividade, auto-
difusão, etc (Gurgel, 2000; Viades-Trejo et al., 2012). 
21 
 
 
 
Figura 2. Influência da formação de micelas nas propriedades físicas das soluções de surfactantes 
 
Fonte: Gurgel, 2000. 
 
2.1.3 Emulsões 
 Quando dois líquidos imiscíveis, como água e óleo, são agitados 
fortemente, forma-se uma emulsão na qual encontram-se suspensos entre si. A 
emulsão assim formada é um sistema instável, uma vez que a falta de 
afinidade entre a água e o óleo gera tensões interfaciais que o sistema tenderá 
a reduzir, a fim de ganhar mais estabilidade. Deste modo, as gotículas de água 
ou óleo suspensas tendem a coalescer aumentando de volume e, 
consequentemente, diminuindo a área superficial sujeita às tensões, até a 
completa separação das fases (Rieger, 1996 e Ansel et al., 2000 apud Casteli 
et al, 2008; Daltin, 2011). 
Os surfactantes têm a função de aumentar a estabilidade das emulsões, 
pois, além de reduzirem as tensões interfaciais, tendem a impedir a 
coalescência através de dois possíveis efeitos (dependendo do tipo de 
surfactante): repulsão eletrostática ou impedimento estérico. Quando dois 
líquidos imiscíveis são agitados na presença de um surfactante com 
concentração acima da CMC, ocorre a migração das moléculas surfactantes 
das micelas para as novas interfaces formadas. Se o surfactante for aniônico, 
as gotículas suspensas serão envoltas por cargas negativas que, por repulsão 
eletrostática, impedirão a coalescência e, consequentemente, a separação das 
fases. Se o surfactante for não-iônico, o efeito observado é o de impedimento 
estérico, ou seja, as gotículas suspensas não coalescem porque as moléculas 
22 
 
 
de surfactante encontram-se ao redor delas, impedindo sua aproximação. Para 
aumentar a estabilidade das emulsões de forma mais efetiva, é recomendado o 
uso combinado desses dois tipos de surfactantes (Daltin, 2011). 
Um importante parâmetro de avaliação do poder de um emulsificante e 
da estabilidade da emulsão é o Índice de Emulsificação (IE) (Cooper & 
Goldenberg, 1987; Abu-Ruwaida et al., 1991). De acordo com Cooper & 
Goldenberg (1987), o IE é calculado pela razão entre a altura remanescente de 
emulsão e a altura total de líquido, após agitação de dois líquidos imiscíveis, 
normalmente água e óleo, na presença de um surfactante. O IE é dependente 
do tempo, logo, estabelece-se um intervalo para sua avaliação, por exemplo, o 
IE24 é medido 24 horas após a agitação. O IE para um mesmo surfactante pode 
variar com o tipo de substância hidrofóbica utilizada (diferentes hicrocarbonetos 
ou óleos vegetais) (Barros et al., 2008). 
 
2.1.4. Formação de espuma 
 Quando uma solução contendo um surfactante em concentração acima 
da CMC é agitada, pequenas bolhas de ar podem entrar nessa solução e 
formar novas superfícies água–ar, em um processo muito semelhante ao de 
formação de uma emulsão. Como mais superfícies foram geradas, há migração 
das moléculas do surfactante para essas superfícies. As bolhas formadas, 
envoltas em surfactantes, emergem à superfície do líquido, formando a 
espuma. Surfactantes aniônicos, em especial os sulfatados, são geralmente os 
que proporcionam espumas mais volumosas e duradouras, uma vez que a 
espuma formada por estes possui um maior volume de filme líquido entre as 
bolhas de ar. Isso ocorre devido à repulsão eletrostática, uma vez que os 
surfactantes aniônicos apresentam a maior concentração de carga em suas 
partes polares (Daltin, 2011). 
 
2.2. SAPONINAS 
 Saponinas são glicosídeos produzidos como metabólitos secundários 
por diversos vegetais superiores. Apesar dessa classe de compostos naturais 
reunir substâncias com variadas estruturas, as saponinas apresentam algumas 
23 
 
 
características em comum, como a capacidade de formar espuma, devido ao 
caráter anfifílico de suas moléculas, que lhes confere atividade surfactante 
(Podolak et al., 2010). 
 
2.2.1. Classificação 
 As saponinas são classificadas de acordo com o tipo de esqueleto da 
aglicona: esteroidal ou triterpênico (Figura 3). Tanto os triterpenos como os 
esteroides são isoprenóides, que possuem como precursor o óxido de 
esqualeno, composto de trinta carbonos que sofre ciclizações enzimáticas, na 
biossíntese que dá origem às agliconas. Nas saponinas esteroidais, a aglicona 
é formada por um esqueleto de 27 carbonos, enquanto as agliconas 
triterpênicas mantêm os 30 carbonos do seu precursor (Augustin et al., 2011). 
Saponinas esteroidais são encontradas nas famílias Liliaceae, 
Dioscoreaceae, Agavaceae. As triterpênicas são as mais abundantes na 
natureza e encontram-se mais difundidas nas dicotiledôneas (famílias 
Primulaceae, Sapotaceae, Caryophyllaceae, entre outras) (Podolak et al., 
2010). 
 
 
Figura 3. Esqueletos representativos de saponinas triterpênicas (ácido oleanólico) e esteroidais 
(diosgenina). 
Fonte: Augustin et al, 2011. 
 
 Existem, ainda, subclassificações quanto ao esqueleto da aglicona. As 
saponinas esteroidais podem ser do tipo espirostano, ou furostano (Figura 4) 
(Sparg et al, 2004 apud Ribeiro, 2012). Já as saponinas triterpênicas, podem 
24 
 
 
ser dos seguintes tipos: damarano, tirucalano, lupano, hopano, oleanano, 
taraxasterano, ursano, cicloartano, lanostano e cucurbitano. Dentre eles, as do 
tipo oleanano são as mais comumente encontradas no reino vegetal (Figura 5) 
(Vincken et al., 2007). 
 
 
Figura 4. Saponinas esteroidais com esqueletos do tipo furostano e espirostano (R= açúcares). 
Fonte: Sarker e Nahar, 2009. 
 
 
Figura 5. Estruturas dos 10 tipos de esqueletos triterpênicos das saponinas. 
Fonte: Vincken et al, 2007. 
 
Outra forma de classificação das saponinas é quanto ao número de 
glicosilações. Desta forma, elas podem ser classificadas como mono, di ou 
25 
 
 
tridesmosídicas. A glicosilação geralmente ocorre no carbono C3 (via éter) e/ou 
C28 (via éster), ocorrendo raramente em outras posições, no caso das 
tridesmosídicas. É comum que se encontrem ligados à aglicona 
monossacarídeos, tais como D-glicose, D-galactose, ácido D-glucurônico, ácido 
D-galacturônico, L-ramnose, L-arabinose, D-xilose e D-fucose (Vincken et al., 
2007). 
 
2.2.2. Fontes de Saponinas 
 As saponinas podem ser encontradas nas raízes, caules, folhas, flores 
ou nos frutos de organismos vegetais. A quilaia (Quillaja saponaria), o juazeiro 
(Ziziphus joazeiro) e o sisal (Agave sisalana) são exemplos de plantas que 
contêm saponinas. A quilaia apresenta elevada concentração de saponinas, 
presentes no caule (5 a 20% da casca), sendo uma das principais fontes 
conhecidas e estudadas. Extratos de quilaia são utilizados em alimentos como 
emulsificantes (San Martín & Briones, 1999; Resnik, 2003). 
Dentre os alimentos que consumimos,existem também diversas fontes 
de saponinas. Alguns alimentos possuem alta concentração desses 
compostos, como é o caso do ginseng e do alcaçuz, cujas saponinas 
representam cerca de 4 - 20% do peso seco da raiz, no caso do alcaçuz, e 1,5 
- 6%, no caso do ginseng. O alho-poró, o alho, a cebola, o aspargo, a erva-
mate, a beterraba, a quinoa e a soja, entre outros, apresentam concentrações 
mais baixas de saponinas (Ribeiro, 2012). Apesar de serem largamente 
distribuídas no reino vegetal, as saponinas também podem ser encontradas em 
algumas espécies animais, como certos animais marinhos invertebrados 
(Podolak et al., 2010). 
 
2.2.3. Propriedades 
 A diversidade estrutural das saponinas é extremamente grande, porém 
pode-se atribuir, de uma forma geral, algumas propriedades às saponinas. O 
poder surfactante, por ser inerente à anfifilicidade da molécula, é a propriedade 
mais comum. Entretanto, certas saponinas podem apresentar propriedades 
mais específicas, como é o caso do poder antimicrobiano. 
26 
 
 
2.2.3.1. Poder Surfactante 
Uma das principais características das saponinas é a sua capacidade de 
formar espuma, o que explica a origem de seu nome (do latim sapo, que 
significa sabão) (Vincken et al., 2007). A espuma formada é estável à ação de 
ácidos minerais diluídos, diferenciando-se dos sabões comuns (Cunha & 
Roque, 2005 apud Castejon, 2011). A formação de espuma é uma das 
consequências da estrutura anfifílica das saponinas, que lhes confere poder 
surfactante. 
Saponinas têm sido estudadas e, até mesmo, disponibilizadas 
comercialmente como surfactantes naturais (Wang et al., 2011; Yang et al., 
2013). O poder surfactante de saponinas de quilaia foi semelhante ao do 
tensoativo comercial Tween 80, um surfactante não-iônico muito utilizado na 
indústria de alimentos, concluindo-se que saponinas de quilaia têm potencial 
para substituir os surfactantes comerciais em formulações de alimentos e 
bebidas (Yang et al., 2012). 
 
2.2.3.2. Interação com esteróis 
 A capacidade de interação das saponinas com esteróis é uma 
característica bastante estudada dessa classe de compostos. A digitonina, por 
exemplo, uma saponina esteroidal, forma complexos com o colesterol em 
solução aquosa (Akiyama et al., 1980). A interação com esteróis foi uma 
característica elucidada a partir de estudos que indicaram que saponinas 
seriam responsáveis pela formação de poros em membranas de células virais, 
o que, por sua vez, estaria diretamente relacionado com os esteróis presentes 
na membrana celular (Bangham & Horne, 1962; Glauert et al., 1962). 
 Como consequência da capacidade de interagir com os esteróis das 
membranas celulares, tem-se as atividades hemolítica, antifúngica, 
antiprotozoário, hipocolesterolêmica e até mesmo farmacológicas (Giner et al., 
2000; Zhang et al., 2008) observadas para muitas saponinas (Micich et al., 
1992; Hwang & Damodaran, 1994; Mitra & Dungan, 2000 apud Ribeiro, 2012). 
Todas essas propriedades estão, obviamente, fortemente relacionadas à 
estrutura de cada saponina, em termos do tipo de aglicona, quantidade de 
27 
 
 
glicosilações e o número e tipo de açúcares ligados à aglicona (Augustin, 
2011). 
 
2.2.3.3. Atividade Antimicrobiana 
Saponinas de diversas fontes podem apresentar atividade 
antimicrobiana. Saponinas triterpênicas com esqueleto do tipo oleanano, como 
hederagenina e ácido oleanólico, demonstraram possuir efeito antifúngico 
contra Candida glabratra, C. albicans, Trichosporon beigeli, Penicillium 
avelaneum UC-4376, Pyriculataoryzae, Cryptococcusneoformans, Coccidioides 
immitis, Saccharomyces cerevisiae, Microsporum canis e Trichophyton 
mentagrophytes (Du et al., 2003; Lee et al., 2001 apud Tsuzuki et al., 2007). 
Escalante et al. (2002) também estudaram saponinas triterpênicas com 
esqueletos do tipo oleanano, com grupos dicarboxílicos em C-28 e C-30 e 
dupla ligação no C-12, concluindo que estas possuíam atividade contra alguns 
fungos patogênicos. 
Saponinas antifúngicas de banana-de-papagaio (Swartzia langsdorffii) 
que foram isoladas por Monti et al. (2008) também apresentavam esqueleto 
oleanano e uma carboxila livre no C28 (Figura 6). Santiago et al. (2005) haviam 
concluído que a existência de uma carboxila livre no C28 era essencial para a 
atividade larvicida de saponinas com esqueleto do tipo oleanano sobre Aedes 
aegypti, bem como observaram que essa atividade era maior para as 
saponinas monodesmosídicas e com um menor números de açúcares na 
cadeia lateral no C3. 
 
Figura 6. Estruturas das saponinas isoladas da banana-de-papagaio. 
Fonte: Monti et al., 2008. 
28 
 
 
 
Em relação à atividade antibacteriana, Lemos et al. (1992) observaram 
que a saponina acetilada 3-β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1→3)-β-D-glicopiranosil]-
hederagenina possuía efeito contra Pseudomonas aeruginosa ATCC 15422, 
Bacillus subtilis ATCC 6633 e Cryptococcus neoformans. Ahmad e Beg (2001) 
também reportaram sua ação contra Staphylococcus aureus. 
Ginsenosídeos, saponinas triterpênicas de Panax ginseng, com 
esqueleto do tipo damarano (Park et al., 2016), apresentaram ação 
antimicrobiana, atuando através de disrupção da membrana celular de 
bactérias gram positivas e gram negativas, como Staphylococcus aureus e 
Salmonella typhimurium (Sung & Lee, 2008). 
 
2.2.4. Saponinas do Juá 
 O juazeiro (Ziziphus joazeiro Martius, Família Rhamnaceae) é uma 
árvore encontrada preferencialmente na caatinga, ocorrendo naturalmente na 
região Nordeste do Brasil, mas também em alguns estados do Norte, Centro-
Oeste e Sudeste (Lima, 1985). Tem grande importância socioeconômica na 
região Nordeste, onde suas folhas e frutos são utilizados na alimentação 
animal (Barros et al., 1991); seus frutos, na alimentação humana; suas cascas, 
como detergente e dentifrício; seus caules, como combustível e material de 
construção, entre outros (Carvalho, 1994). As cascas do caule e as folhas do 
juá também são utilizadas para fins medicinais, como cicatrizantes e anti-
inflamatório, entre outros (Matos, 1999). 
As seis saponinas do juá possuem agliconas triterpênicas do tipo 
damarano, com um quinto anel formado contendo um oxigênio como 
heteroátomo. As estruturas 1, 2 e 3 da Figura 7 representam as saponinas 
encontradas em maior quantidade no juá, chamadas jujubosídeos, cujas 
agliconas são chamadas jujubogeninas. São monodesmosídicas, com uma 
única glicosilação no carbono 3. Os açúcares encontrados nesses glicosídeos 
são glicose e arabinose, na forma dos anéis α-arabinopiranosil, β-glicopiranosil 
e α-arabinofuranosil, sulfatados ou não. (Higuchi et al., 1984; Schühly et al., 
2000). 
29 
 
 
As saponinas 4, 5 e 6 da Figura 7 foram isoladas por Schühly et al. 
(2000). Os compostos 4 e 5 são denominados juazeirosídeos A e B, 
respectivamente. O esqueleto do composto 6 é derivado da lotogenina, sendo 
denominado lotosídeo A. Encontram-se ligados aos esqueletos, os anéis β-
glicopiranosil, α-arabinopiranosil e β-apiofuranosil. 
As saponinas 1 a 6 são denominadas: (1) Jujubogenina 3-O-α-L-
arabinofuranosil-(12)-[β-D-glicopiranosil (13)]-α-arabinopiranosídeo; (2) 
Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil-(12)-[β-D-glicopiranosil-4-O-sulfato 
(13)]-α-arabinopiranosídeo; (3) Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil-
(12)-[β-D-glicopiranosil-4-O-sulfato (13)]-α-arabinopiranosídeo-3-O-sulfato; 
(4) Juazeirogenina 3-O-β-D-glicopiranosídeo; (5) Juazeirogenina 3-O-β-D-
glicopiranosil-(12)-[β-D-apiofuranosil-(13)]-β-D-glicopiranosil-(12)-α-L-
arabinopiranosídeo; e (6) Lotogenina 3-O-β-D-glicopiranosil-(12)-[β-D-
apiofuranosil-(13)]- β-D- glicopiranosil-(12)-α-L-arabinopiranosídeo. 
Dentre as fontes de saponinas que compõem a biodiversidade brasileira, 
o juá apresenta-se como uma boa alternativa, levando-se em consideração o 
teor (2 a 10% das cascas do caule) e o poder de emulsificação das suas 
saponinas. As saponinas do juá foram capazes dereduzir a tensão superficial 
em aproximadamente 35 mN/m, além de apresentarem Índice de Emulsificação 
em torno de 50%, o que representa um dos melhores desempenhos, quando 
se compararam saponinas de diversas fontes vegetais (Ribeiro, 2012). 
Apesar das saponinas do juá terem demonstrado possuir maior poder 
tensoativo que a maioria das saponinas investigadas, seu desempenho ainda 
pode ser melhorado, especialmente em relação à estabilização de emulsões. 
Além do poder surfactante, as saponinas do juá apresentaram atividade contra 
a levedura Candida albicans a uma concentração de 156 µg/mL e contra o 
fungo Aspergillus niger a 312,5 µg/mL, mas não apresentaram atividade 
antibacteriana. 
Cruz et al. (2007) observaram atividade antifúngica de extrato aquoso de 
juá em concentrações entre 6,25 a 400 μg/mL. Alviano et al. (2008) observaram 
atividade antibacteriana do mesmo tipo de extrato em concentrações entre 1,0 
e 16,0 mg/mL. Porém, nesses casos, por se tratar de extratos aquosos, outros 
componentes do juá poderiam estar contribuindo para tais atividades, como os 
30 
 
 
compostos fenólicos, alcaloides e triterpenos (Cushnie & Lamb, 2005 apud 
Ribeiro, 2012). 
 
Figura 7. Saponinas encontradas no juá. 
Fonte: Higuchi et al., 1984; Schühly et al., 2000. 
 
31 
 
 
2.2.5. Modificação Estrutural das Saponinas 
 Diversos trabalhos investigaram a quebra ou aumento da cadeia lateral 
de açúcares e os consequentes efeitos na bioatividade e demais propriedades 
das saponinas. As cadeias laterais de açúcar nas posições C3 e C28 da 
aglicona, bem como a presença de grupos funcionais nessas posições, 
desempenham papel fundamental na biotividade da molécula (Wie et al., 2007; 
Zhu et al., 2011). As modificações podem ser efetuadas via processamento 
químico ou por bioconversão microbiana ou enzimática. 
Monti et al. (2005) utilizaram glicosidases, glicosiltransferases, lipases e 
lacases para modificar a parte glicosídica de saponinas de Centella asiática. 
Wie et al. (2007) estudaram o efeito da quebra parcial da cadeia de açúcares 
de saponinas de Platycodon grandiflorum por enzimas produzidas por A. niger, 
obtendo saponinas modificadas com maior poder antioxidante, melhores 
características sensoriais e menor toxicidade. 
Outras abordagens, porém, vão além da modificação da parte glicosídica 
da molécula. Modificações estruturais no esqueleto lipofílico, como inserção de 
grupos funcionais e esterificação, por exemplo, também podem ter impacto 
significativo na bioatividade. Zhu et al. (2011) estudaram a biotransformação de 
derivados do ácido oleanólico e suas saponinas pela ação dos micro-
organismos Streptomyces griseus ATCC 13273 e Aspergillus ochraceus CICC 
40330, caracterizando os novos compostos produzidos. Feng et al. (2015) 
sintetizaram saponinas modificadas através de esterificação da aglicona das 
saponinas do chá, obtendo um produto com melhor atividade tensoativa. 
 
2.2.5.1. Enzimas como Bioconversores 
 Enzimas são proteínas que atuam como catalisadores naturais, ou 
biocatalisadores, sendo largamente utilizadas na biotransformação de 
compostos naturais. Através de seu centro-ativo, as enzimas se ligam ao 
substrato, formando um complexo enzima-substrato, que, após a reação, dará 
origem aos produtos mais a enzima livre. As enzimas aceleram as reações pelo 
decréscimo da energia livre de ativação necessária, através da formação de 
um complexo intermediário de menor energia (Stryer, 2008). 
32 
 
 
 As reações enzimáticas trazem uma série de vantagens em relação às 
reações com catalisadores químicos, dentre elas o fato das enzimas serem 
obtidas a partir de organismos vivos, por simples extração ou fermentação a 
partir de matérias primas renováveis, trabalharem em condições reacionais 
mais brandas e terem altíssima especificidade. Entretanto, são extremamente 
sensíveis às condições ambientais, como temperatura, pH e força iônica do 
meio, fatores que podem causar alterações na sua estrutura terciária e/ou 
secundária, o que levará à sua desnaturação e consequente perda de atividade 
enzimática (Illanes, 1994). 
As enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação que 
catalisam em seis classes: oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, 
isomerases e ligases. O grupo das hidrolases engloba a maioria das enzimas 
com aplicação industrial, como as carboidrolases, proteases etc (Illanes, 1994). 
Podem-se obter saponinas com cadeias laterais parcialmente 
hidrolisadas ou até mesmo agliconas livres a partir de reações enzimáticas 
(Monti et al., 2005; Wie et al., 2007). No caso da modificação enzimática de 
saponinas via quebra da cadeia de açúcares, as carboidrolases apresentam-se 
como possíveis biocatalisadores da reação. Pertencem ao grupo das 
carboidrolases, as amilases, glicoamilases, pectinases, celulases, 
hemicelulases, lactases, galactosidases e invertases (Illanes, 1994). 
Celulases são enzimas que atuam na quebra da celulose e derivados, 
gerando glicose. Os três tipos de celulase envolvidos nessa reação são a 
exocelulase, a endocelulase e a celobiase. A exocelulase (1,4-β-D-glucano 
celobiohidrolase) atua na extremidade da cadeia de celulose, produzindo 
celobiose; a endocelulase (1,4-β-D-glucano-4-glucanohidrolase) atua na quebra 
de ligações no meio da cadeia, gerando celodextrinas; e a celobiase (β-
glicosidase) hidrolisa a celobiose e celodextrinas de baixo peso molecular, 
gerando glicose (Gerhartz, 1990). 
As hemicelulases são enzimas que atuam nas ligações encontradas nas 
hemiceluloses, que são polissacarídeos heterogêneos compostos 
predominantemente de pentoses (xilose, arabinose) e hexoses (manose, 
glicose, galactose) (Gerhartz, 1990; Saha, 2003). Dentre as hemicelulases, 
encontram-se as xilanases, que hidrolisam ligações do tipo β-1,3 e β-1,4 entre 
33 
 
 
moléculas de xilose; as arabanases, que quebram ligações α-1,5 e α-1,3 entre 
arabinases; as dextranases, que atuam na ligação α-1,6 de dextranas; as 
inulinases, que quebram as ligações β-1,2 entre as moléculas de frutose da 
inulina; as pentosanases; as β-glucanases (ligações β-1,3, β-1,4 e β-1,6 de β-
glucanos), entre outras (Gerhartz, 1990; Uhlig, 1998; Koblitz, 2008). 
As pectinases são um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar as 
ligações glicosídicas da pectina. São muito utilizadas na indústria de bebidas, 
como na clarificação de sucos e no aumento de rendimento de suco na 
produção de vinho. Pectinases comerciais utilizadas em tais aplicações são 
capazes de degradar a parede celular de vegetais, sendo compostas, muitas 
vezes, além das enzimas pectinolíticas, por celulases e hemicelulases. 
Levando em consideração a estrutura das saponinas, em especial os 
tipos de açúcares presentes na cadeia lateral e das ligações existentes entre 
eles, nota-se que preparados enzimáticos comerciais com atividade em 
diversos tipos de ligações glicosídicas, compostos por celulases, hemicelulases 
e/ou pectinases, são capazes de modificar a estrutura original da molécula. Os 
preparados contendo hemicelulases são os mais promissores quando se trata 
das ligações do tipo α-1,2, α-1,3, β-1,2 e β-1,3 presentes nas saponinas do juá. 
 Kim et al. (2006) modificaram enzimaticamente ginsenosídeos, obtendo 
novos compostos quando utilizaram-se as enzimas comerciais Pectinex 
(pectinase e arabanase) e Viscozyme (hemicelulases, celulases). As condições 
ótimas de reação para esses tipos de enzimas, segundo a literatura, são 
temperaturas em torno de 50°C, pH entre 4 e 5 e concentração de enzima de 
5%. O tempo de incubação pode variar de acordo com o grau de reação que se 
deseja, podendo chegar a dois ou três dias (Kim et al., 2006). 
34 
 
 
3. OBJETIVOS 
O objetivo do trabalho é investigar como se comportam as atividades 
emulsificante e antimicrobiana das saponinas do juá frente a alterações em sua 
estrutura molecular, efetuadas a partir de reações enzimáticas,tendo como 
estratégia o encurtamento da cadeia lateral de açúcares. 
 
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
Obter um extrato purificado de saponinas a partir das cascas do juá; 
Avaliar as propriedades surfactantes e o poder antimicrobiano das 
saponinas extraídas do juá; 
Realizar reações de hidrólise enzimática utilizando enzimas comerciais 
com diferentes atividades: Viscozyme L, Ultrazym AFPL e Celluclast 1.5L; 
Caracterizar os produtos formados pelas reações através de HPLC-MS; 
Determinar as propriedades (CMC, IE24 e MIC) das saponinas do juá 
após as modificações enzimáticas; 
Avaliar como se comportam as propriedades surfactante e atimicrobiana 
frente às modificações estruturais provocadas pelas reações de hidrólise 
enzimática. 
 
 
35 
 
 
4. MATERIAIS E MÉTODOS 
Extratos liofilizados ricos em saponinas do juá foram submetidos a 
reações enzimáticas, e os produtos dessas reações, bem como o próprio 
extrato original, foram analisados quanto ao poder surfactante e antimicrobiano. 
 
4.1. MATERIAIS 
 O juá foi obtido no mercado local na forma de pedaços da casca e do 
tronco. As enzimas utilizadas foram Viscozyme L (lote KTN02215), Ultrazym 
AFPL (lote KJN07024) e Celluclast 1.5 L (lote CCN03138), todas da 
Novozymes®. Demais solventes e reagentes utilizados: ácido sulfúrico, 
metanol, hidróxido de sódio e butanol (Vetec); óleo de soja (Leve). 
 
4.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS 
4.2.1. Extração e Hidrólise Total das Saponinas 
4.2.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas 
As cascas do caule do juá foram trituradas e peneiradas (Mesh Tyler 
32). Em um Erlenmeyer, 100 gramas desse material foram, então, extraídos 
com solução metanol/água 1:1 (150mL de metanol + 150 mL de água) por 24 
horas, sob agitação constante à temperatura ambiente. Após esse tempo, o 
meio extrativo foi filtrado em funil de Büchner à vácuo. O filtrado foi reservado e 
o resíduo sólido passou por nova extração por mais duas vezes. Ao final das 
três extrações, o resíduo sólido foi descartado, e o filtrado foi rotoevaporado em 
Evaporador Rotativo TE-210 acoplado a bomba de vácuo TE-0581. O metanol 
foi, assim, recuperado e a solução aquosa resultante seguiu para a etapa de 
partição com butanol. 
 Na partição, ocorre transferência de massa das saponinas da fase 
aquosa para a fase butanólica. Essa etapa foi feita em funil de decantação, 
repetindo-se o processo até que a fase butanólica adicionada à solução aquosa 
ficasse quase incolor. Todo volume de butanol contendo as saponinas, oriundo 
da partição, foi, então, lavado duas vezes em funil de decantação com solução 
36 
 
 
de NaOH 1%. Essa lavagem tem como objetivo remover os flavonóides 
presentes no extrato butanólico. Após a lavagem com NaOH, foi feita uma 
lavagem com água destilada. A solução butanólica purificada foi, então, 
rotoevaporada até todo butanol ser recuperado e restar apenas as saponinas 
cristalizadas no balão de evaporação. As saponinas foram ressuspensas em 
uma quantidade mínima de água e, em seguida, liofilizadas por 24 horas em 
Liofilizador Terroni Enterprise I, de forma a obter-se um extrato liofilizado rico 
em saponinas. A Figura 8 mostra o fluxograma do procedimento de extração. 
Fonte: Elaboração própria. 
 
4.2.1.2. Hidrólise Total das Saponinas 
A hidrólise da saponina resulta na quebra das ligações glicosídicas, 
gerando agliconas e açúcares livres. Estes foram quantificados pelo método do 
ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para açúcares redutores totais adaptado de 
Miller (1959). Adicionaram-se 150µL da amostra, 200µL do reagente DNS e 
Figura 8. Fluxograma do método de extração das saponinas. 
37 
 
 
200µL de água destilada em frasco do tipo eppendorf; a solução reagiu por 10 
minutos a 90ºC e, em seguida, adicionou-se 1,5mL de água destilada. A 
absorbância da solução final foi lida a 540nm em espectrofotômetro Shimadzu 
modelo UV-1800, frente a uma curva-padrão de glicose (0 a 10µmol/mL). Os 
ensaios foram feitos em triplicata. 
A hidrólise total, realizada com o intuito de fornecer um valor máximo de 
concentração final de açúcares redutores, foi realizada pelo método adaptado 
de Rothrock et al. (1957). Efetuou-se a reação da solução de saponina 1% com 
HCl 4N, por 48 horas à temperatura ambiente. O meio hidrolisado foi, então, 
centrifugado, e o sobrenadante foi neutralizado com NaOH 4N. A amostra 
neutralizada foi submetida ao ensaio de determinação de açúcares redutores, 
conforme descrito anteriormente. 
 
4.2.2. Modificação Enzimática das Saponinas 
As reações enzimáticas teoricamente produzirão saponinas parcialmente 
hidrolisadas, ou seja, com uma cadeia menor de açúcares, mas ainda na forma 
glicosídica. Como biocatalisadores dessas reações, foram utilizadas três 
enzimas comerciais: Viscozyme L (celulases e hemicelulases), Ultrazym AFPL 
(pectinases) e Celluclast 1.5L (celulase). A reação foi conduzida em shaker, 
com rotação de 200 rpm, à 50ºC e pH 5, a partir de solução de saponina 1% 
com adição de enzima 5% v/v, por um tempo mínimo de 24 horas. O ponto final 
de reação foi determinado através da determinação, por DNS, dos açúcares 
formados. 
Após o tempo de reação, filtrou-se o meio reacional para remoção de 
agliconas e, então, realizou-se a partição das saponinas modificadas com 
butanol, parando a reação. Em seguida, o extrato butanólico foi lavado com 
água para remoção de açúcares residuais e, então, partiu-se para a 
rotoevaporação e liofilização do extrato rico em saponinas modificadas. 
O pH utilizado nas reações enzimáticas foi escolhido após a 
determinação das concentrações finais de açúcar (em equivalentes de glicose) 
para tratamentos com as três em enzimas, nos pH´s 4, 5, 6 e 7. Utilizou-se 
análise de variância (ANOVA) seguida de teste de Tukey para analisar a a 
38 
 
 
existência de diferença estatística entre as médias, com auxílio do software 
Statistica 13.0. 
4.2.3. Caracterização das Saponinas 
A caracterização das saponinas e dos produtos obtidos na hidrólise enzimática 
foi feita por HPLC-MS. A análise foi realizada pelo Laboratório de 
Cromatografia do CENPES/ Petrobras, coordenado pelo químico Íris Medeiros 
Junior. As amostras de saponinas (não-modificadas e modificadas) foram 
solubilizadas em metanol e transferidas para o frasco de amostrador 
automático, sendo diretamente injetadas no HPLC-MS (módulos positivo e 
negativo). O sistema de HPLC utilizado (Agilent Technologies, modelo 1200) é 
constituído por amostrador automático, degaseificador de solventes, bomba 
quaternária e detector de ultravioleta (UV) por arranjo de diodos. Os principais 
parâmetros da análise encontram-se descritos no Quadro 1. 
Quadro 1: Parâmetros e condições analíticas da identificação das saponinas por HPLC-MS. 
Parâmetro Condição 
Pré-Coluna + Coluna: 
Vydac Guard Column C-18 + Zorbax XDB-C18 3,5 
µm, 4,6 x 150 mm. 
Temperatura da coluna: Ambiente 
Volume de injeção: 10 µL 
Composição da fase móvel: 
 
Solvente A: Acetonitrila + Ácido acético 0,1% 
Solvente B: Água + Ácido acético 0,1% 
Gradiente de composição: 
0 min 
3 min 
35 min 
37 min 
45 min 
47 min 
55 min 
 
25% A / 75% B 
25% A / 75% B 
50% A / 50% B 
100% A / 0% B 
100% A / 0% B 
25% A / 75% B 
25% A / 75% B 
Fluxo de fase móvel: 1,0 mL/min 
Detector de UV: 
Comprimento de onda 203 nm 
Intervalo do espectro 190-400 nm 
39 
 
 
 
4.2.4. Concentração Micelar Crítica (CMC) 
Mediu-se a transmitância a 450nm de soluções aquosas com 
concentrações variando de 10 a 0,001g/L de saponinas (original e modificadas) 
em espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-1800. O ensaio foi feito em 
duplicata, e a variação da transmitância com a concentração foi avaliada, para 
se determinar a concentração micelar crítica. 
 
4.2.5. Índice de Emulsificação (IE24) 
Os índices de emulsificação da saponina original e das modificadas 
enzimaticamente foram determinados segundo Cooper & Goldenberg(1987) e 
Sarubbo et al. (2006). Adicionaram-se 4mL de solução aquosa de saponinas 
(0,1 e 1g/L) a 4mL de óleo de soja, agitando-se em vórtex por dois minutos a 
2500 rpm, formando uma emulsão. O IE24 é calculado como a razão entre a 
altura em emulsão após 24 horas e a altura total de mistura. Os ensaios foram 
feitos em duplicata. Utilizou-se análise de variância (ANOVA) seguida de teste 
de Tukey para analisar a a existência de diferença estatística entre as médias, 
com auxílio do software Statistica 13.0. 
 
4.2.6. Atividade Antimicrobiana das Saponinas do Juá 
A atividade antimicrobiana das saponinas do juá foi determinada pelo 
método padrão internacional de microdiluição, de acordo com as normas M27-
A2 (NCCLS, 2002a) e M7-A6 (NCCLS, 2003), do CLSI/NCCLS (Clinical and 
Laboratory Standards Institute). Este método baseia-se na inoculação de uma 
suspensão de micro-organismos (bactérias, fungos ou leveduras) em placas de 
96 poços tipo ELISA, contendo meio de cultura específico para bactérias 
(Müller-Hinton), fungos ou leveduras (RPMI-1640). 
Antes da inoculação, adicionou-se a solução de saponina de juá ao meio 
de cultura, fazendo-se diluições sucessivas que resultaram em uma faixa de 
concentração de saponina no meio que variou de 40 a 0,02 mg/mL para 
bactérias e de 20 a 0,01 mg/mL para leveduras. A Figura 9 mostra o esquema 
do método de microdiluição. 
40 
 
 
 
Figura 9. Esquema ilustrativo do método de microdluição para determinação da MIC. 
Fonte: SANTOS, 2013. 
A atividade antimicrobiana da saponina do juá foi testada para os micro-
organismos listados no Quadro 2, gentilmente cedidos pela Coleção de 
Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária-CMRVS, FIOCRUZ-
INCQS, Rio de Janeiro, RJ. Através do método descrito, é possível determinar 
a concentração inibitória mínima (CIM), ou seja, a menor concentração de 
saponina capaz de inibir o crescimento microbiano. A CIM é determinada 
visualmente, 24 horas após a incubação da placa de 96 poços, pela turvação 
e/ou adição de corante resazurina (0,005% em tampão fosfato-salino pH 7.2). 
Quadro 2: Micro-organismos utilizados na determinação de atividade antimicrobiana. 
Bactérias 
Gram negativas 
Salmonella choleraesuis (ATCC 10708) 
Escherichia coli (ATCC 8739) 
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) 
Gram positivas 
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) 
Bacillus subtilis (ATCC 6633) 
Levedura Candida albicans (ATCC 10231) 
 
4.2.6.1. Cultivo e Preparo do Inóculo 
 Existem diferenças no método para cada tipo de micro-organismo, não 
só em razão dos diferentes tempos e temperaturas ótimos de crescimento, mas 
41 
 
 
também em relação ao preparo do inóculo a ser utilizado. Esta etapa apresenta 
singularidades quando se trata de bactérias, leveduras ou fungos, no que 
concerne à determinação da turbidez padrão da suspensão e à seguinte 
diluição da mesma. 
 No caso de bactérias, o inóculo é preparado a partir de uma subcultura 
(repique) de 24 horas, incubada à 35 ± 2 ºC em ágar BHI. Com auxílio de uma 
alça microbiológica esterilizada, suspende-se uma quantidade de células em 
água destilada estéril. A densidade celular dessa suspensão deve ser ajustada 
por espectrofotômetro, a fim de obter-se turbidez equivalente a de uma 
solução-padrão da escala de McFarland igual a 0,5. A absorbância dessa 
solução deve variar entre 0,08 e 0,10, à 625nm. Essa suspensão padronizada 
apresenta concentração de células bacterianas de aproximadamente 1x108 
UFC/mL. A fim de se obter uma concentração final, no poço, de 5x105 UFC/mL, 
a suspensão padronizada é diluída 1:20 em meio Müller-Hinton e, finalmente, 
adiciona-se10µL dessa suspensão diluída a cada poço que contém 100µL de 
meio já com o agente antimicrobiano. 
 No caso da levedura (C. albicans), o inóculo foi preprarado a partir de 
subcultura de 24h incubada à 35ºC em ágar Sabouraud-dextrose. Foi feita a 
suspensão de células em água, da mesma forma descrita aneriormente, porém 
a leitura da turbidez para fungos e leveduras é feita a 530nm. Dilui-se a 
suspensão-padrão 1000 vezes (para leveduras) e, finalmente, adicionam-se 
100µL de inóculo a cada poço (contendo 100µL de meio já com a substância 
teste), de forma que a concentrção final de células seja de aproximadamente 
5x102 a 2,5x103 UFC/mL. 
42 
 
 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
5.1. EXTRAÇÃO E HIDRÓLISE TOTAL DAS SAPONINAS 
 
5.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas 
A extração, realizada a partir do caule do juá, produziu um extrato 
liofilizado rico em saponinas: um sólido de cor amarela-clara, com rendimento 
próximo ao descrito na literatura, em torno de 2% em massa. Esse foi o produto 
de partida para o estudo descrito neste trabalho. 
 
5.1.2. Hidrólise Total das Saponinas 
 A Figura 10 mostra a curva-padrão de glicose (0 a 10µmol/mL) para o 
método DNS, utilizada na determinação da concentração de açúcares 
redutores das amostras. A absorbância foi lida à 540nm em espectrofotômetro 
Shimadzu modelo UV-1800. 
 
 
Figura 10. Curva-padrão de calibração do método DNS. 
Fonte: Elaboração própria. 
 
 Através da curva-padrão foi possível determinar a concentração total de 
açúcares redutores, em equivalentes de glicose, no meio reacional, após 
y = 0,1354x - 0,0586
R² = 0,9938
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
A
b
s
Concentração de glicose (µmol/mL)
Curva-padrão DNS
43 
 
 
hidrólise com ácido clorídrico 4N, por 48 horas à temperatura ambiente. A 
hidrólise ácida deveria ser capaz de quebrar todas as ligações glicosídicas, 
liberando a aglicona e os monossacarídeos presentes na molécula. Quando 
hidrolizou-se a solução de saponina na concentração de 0,1% (1g/1000mL), 
obteve-se, ao final da reação, uma concentração de açúcares redutores igual a 
2,55 µmol/mL em equivalentes de glicose. Quando a solução de saponina na 
concentração de 1% (10g/1000mL) foi hidrolizada, obteve-se uma 
concentração final de 14,08 µmol/mL, ou seja, 1,41 µmol/mL. g. 
 Esperava-se que a concentração final de açúcares redutores, partindo-
se da solução de saponina 1%, fosse aproximadamente 10 vezes maior que 
aquela obtida para a saponina 0,1%. Entretanto, pela estequiometria da reação 
e levando-se em consideração as diversas estruturas de saponinas 
possivelmente presentes no juá, conclui-se que os dois valores de 
concentração obtidos encontram-se na faixa esperada. 
 Se considerarmos a estrutura da saponina 3, um jujubogosídeo com 
duas sulfatações, de massa igual a 1055 g/mol e que possui 3 moléculas de 
açúcar por esqueleto, tem-se que a hidrólise dessa saponina geraria 2,84 
µmol/mL.g de açúcares redutores (3 vezes a concentração de saponina, em 
µmols). Já a saponina 4, o joazeirosídeo A, que possui massa igual a 666 g/mol 
e apenas uma glicose ligada ao esqueleto, produziria uma concentração final 
de açúcares redutores igual a 1,5 µmol/mL.g. 
 Apesar dos valores obtidos na prática estarem bem próximos a esses 
valores teóricos, não se pode afirmar se a hidrólise foi total, devido à 
diversidade estrutural das saponinas no juá e à falta de conhecimento das 
proporções de cada tipo de estrutura. Entretanto, os valores obtidos foram 
utilizados apenas como uma forma de comparação, a fim de balizarem os 
resultados das hidrólises enzimáticas, os quais não devem ultrapassar, em 
termos de concentração final de açúcares, o resultado da hidrólise ácida. 
5.2. MODIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DAS SAPONINAS 
 As reações enzimáticas foram realizadas nas condições pré-definidas: 
temperatura igual a 50˚C, rotação de 200 rpm, concentração de saponina igual 
a 1% e enzima a 5% (v/v). O pH=5 foi selecionado como ótimo para a atividade 
44 
 
 
das enzimas, após as reações serem testadas em quatro diferentes pHs, 
mantendo-se constantes as demais variáveis, como mostra a Tabela 1. 
Tabela 1: Concentração final (em µmols equivalentes em glicose/mL) de açúcares redutores no meioapós hidrólise enzimática (*). 
Enzima pH=3 pH=4 pH=5 pH=6 
Celluclast 1.5L 3,18 d ± 0,30 4,84 a,b,c ± 0,51 6,10 a ± 0,63 5,04 a,b ± 0,43 
Ultrazym AFPL 4,37 b,c ± 0,28 4,37 b,c ± 0,22 4,74 b,c ± 0,27 3,69 c,d ± 0,21 
Viscozyme L 4,56 b,c ± 0,02 4,72 b,c ± 0,17 5,25 a,b ± 0,15 4,77 b,c ± 0,15 
 *Valores representam a média da triplicata, acrescida do desvio-padrão. 
Letras iguais representam ausência de diferença estatística, a um nível de 5% de significância, segundo o 
teste de Tukey. 
 
Os resultados da Tabela 1 mostram que, para a enzima Celluclast, o pH 
igual a 3 foi o que menos favoreceu a reação. O pH não influenciou 
significativamente as reações catalisadas pelas enzimas Ultrazym e 
Viscozyme, mas o pH=5 foi considerado como ótimo para a Celluclast. Desta 
forma, selecionou-se o pH igual a 5 para todas as reações enzimáticas para 
obtenção de saponinas modificadas. Observa-se, também, que a enzima 
Celluclast (pH=5) obteve a maior concentração final em açúcares redutores 
dentre as enzimas utilizadas. 
Em relação à hidrólise ácida da saponina na concentração de 1%, as 
enzimas Celluclast 1.5L, Ultrazym AFPL e Viscozyme L apresentaram 
percentuais de hidrólise iguais a 43, 34 e 37%, respecivamente, em um tempo 
de reação igual a 24 horas. Esse intervalo de tempo foi adotado como tempo 
mínimo de reação para a produção propriamente dita das saponinas 
modificadas. O ponto final de reação foi determinado, observando-se a 
variação da concentração de açúcares no meio reacional, por DNS. 
 
5.3. CARACTERIZAÇÃO DAS SAPONINAS 
 A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma das técnicas 
mais indicadas na determinação de saponinas, entretanto a detecção por UV 
se limita aos comprimentos de onda entre 200 e 210 nm e necessita da 
utilização de padrões (Oleszek, 2002). A espectrometria de massas, acoplada 
45 
 
 
a HPLC, apresenta-se como mais uma ferramenta na elucidação de estruturas 
dos compostos analisados. 
 Na espectrometria de massas, ocorre a ionização dos compostos, e os 
íons gerados são agrupados de acordo com sua razão massa/carga (m/z), na 
forma de um espectro que indica a abundância de cada íon formado, de acordo 
com essa razão. Durante a ionização por electrospray (ESI), pode ocorrer a 
formação de íons moleculares (pela perda ou ganho de elétrons), pseudo-
moleculares (pela protonação ou desprotonação da molécula) ou moléculas 
cationizadas/anionizadas através de coordenação com íons metálicos (Na+, K+) 
ou cloreto (Crotti et al., 2006). 
O espectro UV das amostras no comprimento selecionado (203 nm) é 
mostrado na Figura 11. Foram analisadas amostras liofilizadas da saponina do 
juá não-modificada (curva azul), saponina modificada pelas enzimas Celluclast 
(curva vermelha), Ultrazym (curva verde) e Viscozyme (curvas rosa e bege). 
 
Figura 11. Cromatograma das amostras de saponinas a 203 nm. 
 
 Através do cromatrograma da Figura 11, nota-se que as saponinas não-
modificadas e as modificadas pelas enzimas Celluclast e Ultrazym apresentam 
cromatogramas muito semelhantes, enquanto as amostras modificadas pela 
enzima Viscozyme praticamente não apresentaram picos no comprimento de 
onda selecionado. 
min0 10 20 30 40 50
mAU
0
20
40
60
80
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\091-0103.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\092-0202.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\093-0302.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\094-0402.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\096-0602.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
46 
 
 
 Apesar de não ter havido diferença em termos dos tempos de retenção, 
é possível perceber que alguns picos sofreram mudança de intensidade após a 
reação enzimática. A saponina modificada por Celluclast apresentou picos 
ligeiramente mais intensos nos tempos 28-29 e 33 minutos. Já no tempo de 
retenção igual a 39 minutos, a saponina não-modificada apresenta um pico 
ligeiramente mais intenso, indicando a possibilidade da reação ter modificado a 
substância em questão. Entre 40 e 44 minutos, a saponina modificada com a 
enzima Celluclast apresenta picos de maior intensidade que as demais, como 
se observa na Figura 12. 
 
Figura 12. Cromatograma em escala aumentada, do tempo 30 a 48 minutos. 
 
 
 Analisaram-se, então, nos modos positivo e negativo, os espectros de 
massas dos picos que apresentaram tais variações de intensidade, bem como 
daqueles que, apesar de não apresentarem mudança de intensidade entre as 
três amostras, foram os mais significativos para todas elas (picos com tempos 
de retenção 17, 20 e 24,5 minutos). Os dados das razões m/z das saponinas 
da literatura e das suas respectivas agliconas encontram-se no Quadro 3. 
 
 
 
min30 32 34 36 38 40 42 44 46
mAU
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\091-0103.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\092-0202.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\093-0302.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\094-0402.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\096-0602.D - SAPONINAS_1609\SAPONIN
47 
 
 
Quadro 3. Dados de m/z de saponinas de jua 
Saponina Denominação 
m/z 
(saponina) 
m/z 
(aglicona) 
Referência 
1 
Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil-
(12)-[β-D-glicopiranosil (13)]-α-
arabinopiranosídeo 
897 472 
Higuchi et al., 
1984; Schühly 
et al., 2000 
2 
Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil-
(12)-[β-D-glicopiranosil-4-O-sulfato 
(13)]-α-arabinopiranosídeo 
977 472 
Higuchi et al., 
1984 
3 
Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil-
(12)-[β-D-glicopiranosil-4-O-sulfato 
(13)]-α-arabinopiranosídeo-3-O-sulfato 
1055 472 
Higuchi et al., 
1984 
4 Joazeirozídeo A 666 504 
Schühly et al., 
2000 
5 Joazeirozídeo B 1092 504 
Schühly et al., 
2000 
6 Lotosídeo A 1078 487 
Schühly et al., 
2000 
 
Os picos de tempos de retenção 17 e 20 minutos possuem intensidades 
bem próximas para as três amostras. O espectro de massas (Figuras 13) 
mostra a presença de um pico de razão m/z 1078, que pode representar a 
saponina 6 (Schühly et al., 2000), no tempo de retenção de 17 minutos. Os 
íons de m/z maiores podem indicar a presença de outra saponina 
(desconhecida) com mesmo tempo de retenção. 
 
Figura 13. Espectro de massa do pico de tr=17,117 no modo negativo. 
m/z200 400 600 800 1000 1200 1400
0
20
40
60
80
100
*MSD2 SPC, time=17.175 of C:\CHEM32\1\DATA\SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\091-0103.D ES-API, Ne
Max: 568299
 1
08
0.
4
 1
14
0.
4
 1
19
1.
4
 1
11
3.
4
 1
07
8.
4
 1
07
7.
4
48 
 
 
 
N tr igual a 20 minutos (Figura 14), o pico de m/z 1092 pode representar 
a saponina 5 (Schühly et al., 2000), enquanto os demais podem representar 
saponinas maiores até então desconhecidas. Nota-se que, tanto no pico de tr 
igual a 17 minutos como no de 20 minutos, a diferença entre o íon de maior m/z 
e o pico de massa correspondente à da saponina da literatura (1078 e 1092, 
respectivamente) é igual a 113. Daí pode surgir a hipótese de que estes picos 
poderiam conter também saponinas com estruturas semelhantes às das 
saponinas 5 e 6, com um grupamento a mais. 
 
Figura 14. Espectro de massas do pico de tr=20,496 no modo negativo. 
 
 
Para o tempo de retenção de 24,5 minutos, no modo negativo (Figura 
15), o pico m/z 977,2 pode representar