Endófitos fúngicos como fonte de novas enzimas

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fundo
Programas de triagem ambiental são usados ​​para encontrar novas enzimas que podem ser utilizadas em processos industriais de larga escala. Entre as fontes microbianas de novas enzimas, a justificativa para o rastreamento de endófitos fúngicos como fonte potencial de tais enzimas está relacionada à hipotética relação mutualística entre o endófito e sua planta hospedeira. Existe uma necessidade de novas amilases microbianas que são ativas em baixas temperaturas e condições alcalinas, pois estas poderiam encontrar aplicações industriais como detergentes.
Resultados
Uma α-amilase produzida pela Preussia minima, isolada da planta nativa australiana, Eremophilia longifolia, foi purificada até a homogeneidade através de precipitação fracionada de acetona e filtração em gel Sephadex G-200, seguida por cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose. A α-amilase purificada mostrou uma massa molecular de 70 kDa que foi confirmada por zimografia. Temperatura e pH ótimos foram 25 ° C e pH 9, respectivamente. A enzima foi ativada e estabilizada principalmente pelos íons de metal manganês e cálcio. A atividade enzimática também foi estudada usando diferentes fontes de carbono e nitrogênio. Observou-se que a atividade enzimática foi maior (138 U / mg) com amido como fonte de carbono e L-asparagina como fonte de nitrogênio. Estudos em biorreatores mostraram que a atividade enzimática era comparável àquela obtida em culturas agitadas, o que encoraja a fermentação em escala para a produção de enzimas. Após digestão em gel da proteína purificada por tripsina, um péptido 9-mer foi sequenciado e analisado por LC-ESI-MS / MS. A seqüência parcial de aminoácidos da enzima purificada apresentou similaridade à α-amilase de Magnaporthe oryzae.
Conclusões
Os resultados do presente estudo indicam que a α-amilase purificada exibe várias propriedades promissoras que a tornam uma forte candidata para aplicação na indústria de detergentes. Até onde sabemos, esta é a primeira amilase isolada de uma estirpe minúscula da Preussia de origem endofítica.
Os endófitos são microorganismos que vivem em íntima associação com tecidos vegetais vivos em uma relação simbiótica. Os fungos formam uma porção importante da população endofítica [1]. Fungos endofíticos de plantas passam a totalidade ou parte de seu ciclo de vida colonizando o interior de tecidos saudáveis ​​das plantas hospedeiras inter e / ou intracelularmente [2]. Essa relação simbiótica protege a planta hospedeira dos predadores, enquanto os endofíticos recebem nutrientes e espaço de vida em troca [3]. Os fungos endofíticos produzem vários metabólitos secundários e enzimas com o potencial de hidrolisar várias macromoléculas derivadas de plantas [4]. Diferentes cepas fúngicas produzem diferentes enzimas com propriedades naturais adequadas às condições ambientais em que devem atuar [5]. Em muitas indústrias, há uma demanda crescente por novas fontes de enzimas com vários perfis de termoestabilidade e pH para diferentes aplicações [4]. Essa demanda tem impulsionado a exploração de endófitos como fontes de enzimas para aplicações industriais promissoras na agricultura, medicina e indústria alimentícia [6].
As amilases são enzimas onipresentes, sendo difundidas em animais, fungos, plantas, eucariontes unicelulares e procariontes. As amilases são responsáveis ​​por aproximadamente 30% da produção mundial de enzimas [7] e são uma das mais importantes enzimas industriais que estão em alta demanda em vários setores, como alimentos, produtos farmacêuticos, têxteis e detergentes. Fontes fúngicas de amilases são principalmente isolados terrestres como as espécies de Aspergillus. Suas aplicações incluem a conversão de amido em xarope de açúcar e a produção de ciclo-dextrinas na indústria farmacêutica. As amilases mais importantes para aplicações industriais e biotecnológicas são glucoamilases e α-amilases [7]. Os últimos têm a mais variada gama de aplicações industriais, incluindo fabricação de cerveja, panificação, têxteis e detergentes. Cada uma destas aplicações requer propriedades enzimáticas únicas em relação ao pH, temperatura, especificidade e estabilidade [7, 8, 9].
As α-amilases atuam como enzimas degradadoras de amido, catalisando a hidrólise de ligações α-1,4-O-glicosídicas internas em polissacarídeos com a retenção da configuração α-anomérica nos produtos. São na sua maioria metaloenimas e requerem íons cálcio para atividade, integridade estrutural e estabilidade. As α-amilases podem ser divididas em quatro categorias básicas: 1. endoamilases (clivagem de ligações α-1,4 internas resultando em produtos α-anoméricos), 2. exoamilases (clivagem de ligações α-1,4 ou α-1,6 de os resíduos externos de glicose que resultam em produtos anoméricos α ou β, 3. enzimas de desramificação (hidrólise de ligações α-1,6 deixando exclusivamente polissacarídeos lineares longos) e 4. transferases (clivam a ligação α-1,4 glicosídica da molécula doadora e da parte de transferência do doador para um aceitador glicosídico formando uma nova ligação glicosídica) [7].
Na tentativa de identificar novas amilases com potencial aplicação na indústria, purificamos e caracterizamos uma amilase obtida a partir de um fungo de origem endofítica, Preussia minima, isolado de Eremophila longifolia. Este fungo foi previamente isolado em nosso laboratório [4] a partir de material vegetal fornecido pela Canopus Corporation (Byrock, Nova Gales do Sul, Austrália) e identificado pelo Dr. Bob Chinnock (Herbário do Estado, Adelaide, Austrália do Sul). Esta planta nativa australiana foi escolhida devido à sua história etnobotânica e sua importância para os povos aborígenes australianos devido às suas propriedades medicinais. Otimização e estudos de escala foram realizados para estabelecer a adequação do fungo para produção potencial em escala industrial de amilase. Nós ainda caracterizamos a enzima usando LC-ESI-MS / MS para determinar sua seqüência parcial de peptídeos. As características da enzima indicaram que ela tem o potencial de atender às especificações de diversas aplicações industriais, especialmente a indústria de detergentes.
Preparação de enzima extracelular bruta
O micélio de Preussia minima EL-14, [4], cultivado em placas de Agar de Dextrose de Batata (PDA), foi inoculado no primeiro meio de indução de hidrolase (que foi posteriormente demonstrado induzir maior expressão proteica total) [10] e incubado em 25 durante 7 dias. O meio foi então centrifugado a 10 000 g durante 15 min para separar os micélios do caldo e o caldo foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm (Millipore). O caldo esterilizado foi então concentrado por liofilização e usado para caracterização de amilase e para estudar o secretoma de P. minima EL-14.
Um segundo meio indutor de hidrolase (que foi subsequentemente demonstrado induzir uma maior produção de amilase) foi utilizado para cultivar o crescimento de EL-14 para fins de otimização da produção de amilase. A suspensão fúngica foi preparada com 0,1% de Triton X-100 adicionado a 100 ml de meio glucose-aspargina [11]. A cultura foi incubada durante 4 dias a 25 com agitao a 220 rpm. Para iniciar a produção de enzima, 5 ml da cultura crescida no meio acima foi introduzida em 150 ml de meio de indução em que a glucose foi substituída com 4% de amido solúvel. A mistura foi deixada a fermentar durante 5 dias a 28 ° C. Depois disso, o miecélio foi removido por filtração e o filtrado foi guardado como fonte de amilase extracelular bruta.
Purificação enzimática
O filtrado de cultura foi liofilizado e dialisado contra Tris-HCl 20 mM, pH 8. A amostra foi então precipitada usando ácido tricloroacético (TCA) / acetona e aplicada a uma coluna de filtração em gel Sephadex G-200, previamente equilibrada e eluída com o mesmo tampão . As fracções foram recolhidas e monitorizadas quanto à actividade de α-amilase. As fracções com actividade foram então reunidas e aplicadas numa coluna de permuta iónica DEAE-Sepharose, previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8, e eluídas com um gradientede concentração linear (0-17 M) de NaCl no mesmo tampão. As fracções de α-amilase foram novamente reunidas e utilizadas para posterior caracterização, nomeadamente electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), ensaio de Bradford, zimografia e ensaio enzimático.
Análise do conteúdo proteico extracelular por SDS-PAGE
O SDS-PAGE [12] foi realizado com o kit Mini-protean® 3 (Bio-Rad, EUA) usando um gel de resolução de 12% e um gel empilhável de 5% a 200 V por 45 minutos. Após a eletroforese, o gel foi corado com Coomassie Blue G-250 durante a noite, demarcado e uma imagem do gel foi capturada.
Zymografia
PAGE não desnaturante (12%) foi usado para determinar a homogeneidade da enzima de acordo com Martinez et al. [13] A eletroforese em gel SDS-PAGE e 2D foram usadas para determinar a massa molecular da enzima purificada produzida em diferentes condições sob condições desnaturantes usando 12% de gel de acrilamida, como descrito por Laemmli [12]. A colorao foi realizada com o Coomassie Brilliant Blue G-250 e as bandas de protea extracelular foram comparadas com os padrs Precision PlusProtein Kaleidoscope (Bio-Rad) para determinar as massas moleculares. Para identificar a atividade de amilase 'em gel', 1% (p / v) de géis PAGE não desnaturantes polimerizados com amido foram inundados com 0,1 M de fosfato-citrato e 0,05 M de tampão NaCl (pH 6) e incubados a 39 ° C por 2 horas. A banda com atividade de amilase foi exposta por coloração com solução de Lugol (0,67% KI e 0,33% I2).
Atividade de amilase e teor de proteína
A actividade da amilase foi determinada medindo a produo de acar redutor do amido utilizando ido 3, 5-dinitrosalicico (DNS) como descrito por Miller [14]. O sistema de reação incluiu 50 μl de amostra de enzima e 50 μl de solução de amido a 1,0% em tampão citrato-fosfato 0,1 M, pH 5,5. Após 20 min de incubação a 37 ° C, a reação foi interrompida pela adição de 100 μl de reagente DNS. Os brancos continham todas as soluções e amostra de enzima inativada (fervida). Uma unidade de atividade da amilase foi definida como a quantidade de enzima que produziu 1 μmol de açúcar redutor por minuto. A concentração de proteína foi medida de acordo com Bradford [15] usando albumina sérica bovina (BSA) como padrão.
Efeito de diferentes parâmetros do processo e nutrientes adicionais na atividade da amilase
Diferentes condições, incluindo pH (3, 5, 7, 9 e 10), temperatura (9 ° C, 25 ° C e 37 ° C), fontes alternativas de carbono (maltose, celulose e glicose) e nitrogênio (nitrato de amônio, levedura extrato, peptona e triptofano) nos meios e diversos sais (CaCl, CoCl, MgCl, NaCl e MnCl) no tampão fosfato para ensaio enzimático, foram considerados para estabelecer as condições ótimas de produção de amilase para EL-14 na hidrolase induzida induzindo meio [11]. O caldo de fermentação liofilizado foi usado como a solução enzimática bruta. Depois de a protea extracelular ter sido precipitada utilizando TCA / acetona, o sedimento de proteas foi dissolvido em 0,1 M de tamp fosfato, depois foram realizados ensaios de Bradford, SDS-PAGE, zimografia e ensaios enzimicos. Os mesmos procedimentos foram utilizados para os fungos padrão Aspergillus oryzae (ATCC 10124) e A. niger (ATCC 10577) como controle a 25 ° C e pH 9. As análises estatísticas foram realizadas por análise de variância (ANOVA) usando o Statistical Analysis System ( SAS). Um experimento fatorial baseado em delineamento inteiramente casualizado em três repetições foi considerado para cada experimento individualmente. O Teste de Intervalo Múltiplo (DMRT) de Duncan foi usado para determinar meios que diferiam significativamente.
Estudos de biorreatores
A produção de α-amilase por P. minima foi estudada em um biorreator de 1,4 L (Infors AG, Schweiz) com um volume de trabalho de 1 L. O biorreator foi equipado com dois impulsores e defletores do tipo Rushton e foi preenchido com 1 L do mídia otimizada. O meio foi esterilizado a 115 durante 10 min. O pH final do meio foi ajustado pela adição de HC1 1 M estéril ou NaOH 1M. O meio foi então inoculado com 10 mL de solução de cultura P. minima. Todas as fermentações foram realizadas durante 5 dias a 25 ° C com a velocidade do rotor ajustada a 180 rpm. O ar comprimido foi pulverizado no meio a 1 vvm. Parâmetros de fermentação (temperatura, pH e pO2) foram continuamente monitorados com sondas controladas por microprocessador. Os procedimentos analíticos foram realizados após estudos de expansão. O açúcar redutor foi estimado pelo método de Miller. O teor de proteína foi determinado pelo Bradford Assay com BSA como padrão.
Eletroforese em gel bidimensional (2D)
As proteínas foram precipitadas em TCA, recolhidas por centrifugação e dessalinizadas utilizando dispositivos de filtração centrífuga Microcon YM-3 (limite de peso molecular nominal de 3.000; Millipore, Bedford, MA) de acordo com o protocolo descrito por Peterson et al. [16] A eletroforese em gel 2D foi realizada utilizando tiras de gradiente de pH (IPG) imobilizadas (11 cm, pH 4 a 7) (GE Healthcare) submetidas à focalização isoelétrica em uma máquina de focalização isoelétrica Q (Bio-Rad, CA) usando o protocolo padrão recomendado pelo fabricante. Os géis foram fixados em 10% (v / v) de metanol, 7% (v / v) de ácido acético, corados em azul de Coomassie G-250 e descorados em ácido acético a 1% (v / v). Os géis foram então observados quanto a manchas proteicas.
Preparação e digestão em gel da fração de amilase purificada / secretoma de EL-14
Após a filtração da amostra extracelular bruta através de um filtro de 0,22 μm, o secretoma de P. minima foi investigado. Trinta e três manchas protéicas maiores do secretoma EL-14 e da amilase purificada foram excisadas dos géis de eletroforese replicada 2D e SDS-PAGE, respectivamente, e lavadas duas vezes com 600 μL de solução de revelação 1: 1 (v / v) % de acetonitrilo em NH4HCO3 50 mM) com agitao a 37 durante 30-60 min. Os pedaços de gel foram então desidratados com 200 mL de acetonitrila 100% e secos ao ar por 10 min. As prote�as nos peda�s de gel foram reduzidas com 50 � de TCEP 50 mM acabado de preparar, NH4HCO3 50 mM durante 1 h a 60 �. As proteínas reduzidas foram subsequentemente alquiladas por incubação dos pedaços de gel com iodoacetamida 100 mM preparada de fresco em NH4HCO3 50 mM durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. Após a redução e alquilação, os pedaços de gel de cada banda de proteína foram lavados duas vezes com 200 mL de uma mistura de NH4HCO3 / acetonitrila 100 mM 1: 1 (v / v) por 15 min, seguido de desidratação com 200 mL de 100% acetonitrila e ar - Secado por 5 min. Os pedaços de gel seco foram reidratados com 40 μl de NH4HCO3 50 mM contendo 250 ng de tripsina (Sigma) e então incubados a 37 ° C durante a noite [17].
Sequenciação peptídica por espectrometria de massa (LC-ESI-MS / MS)
As bandas de proteína coradas com Coomassie foram excisadas do gel e digeridas com tripsina. Os péptidos gerados a partir da digestão tríptica foram analisados ​​por LC-ESI-MS / MS utilizando um HPLC Agilent 1100 Series acoplado a um espectrómetro de massa Agilent LC / MSD Trap XCT Plus equipado com um cubo de chip HPLC (Agilent, Palo Alto, CA). Os péptidos foram injectados numa coluna de captura de 40 nL Zorbax 300SB-C18 a uma taxa de 4 μL min − 1 e depois separados por comutação da coluna da armadilha em linha com a coluna de separação (Zorbax300SB-C18, 75 μm x 43 mm). As amostras foram separadas em 5% de solvente B (95% v / v acetonitrilo / 0,1% v / v de ácido fórmico; caudal 4,00 μL min − 1). Um aumento do solvente B de 5% para 15% ao longo de 1 min, depois um gradiente linear de 15 min (caudal 300 nL min − 1) de 15 a 35% do solvente B foi realizado seguido por um passo de 35 a 80% do solvente B mais de 0,5 minutos e mantido por 1 min para eluir qualquer proteína remanescente da coluna.
As sequências peptídicas do espectro MS / MS foram identificadas pela ferramenta de pesquisa MASCOT (Matrix Science Ltd., Londres, Reino Unido) contra a base de dados de sequências do NCBI nr (Centro Nacionalde Informação de Biotecnologia não redundante). Os critios para a identificao da sequcia de proteas e ptidos foram baseados nas definies do fabricante (Matrix Science Ltd). Essencialmente, os peptídeos com alta probabilidade (escores da MASCOT que excedem o limiar; p <0,05) foram referidos como “acertos”. Os escores de proteína foram derivados dos escores de íons peptídicos como uma base não probabilística para classificar as proteínas. A sequ�cia prim�ia foi analisada utilizando a base de dados BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) contra prote�as em NCBI nr (todas as entradas).
Resultados
Purificação da α-amilase
O filtrado de cultura dialisado foi precipitado e aplicado a uma coluna Sephadex G-200. Após reunir as fracções de actividade, a amostra concentrada foi aplicada a uma coluna de permuta iónica DEAE-Sepharose. Os dados da purificao de? -Amilase est resumidos na Tabela 1. A purificao de.-Amilase utilizando saturao de TCA / acetona rende uma purificao de 5 vezes. A actividade específica nesta fase foi de 235 U / mg com um rendimento de 80,86%. Após a filtração com Sephadex G-200, a atividade específica da α-amilase aumentou para 298 U / mg, que aumentou ainda mais para 350 U / mg após cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose. No geral, a enzima foi purificada aproximadamente 7 vezes, com 55,11% de recuperação. A proteína total e a atividade enzimática foram medidas após cada etapa de purificação e uma única banda foi observada em SDS-PAGE e zimografia (Figura 1).
Efeito da temperatura na atividade da α-amilase
A temperatura óptima da α-amilase foi avaliada medindo a actividade específica dos extractos extracelulares a diferentes temperaturas a pH 5,5. A enzima apresentou uma temperatura ótima a 25 ° C. O valor ótimo para a produção de α-amilase foi observado em 98 U / mg (Figura 2). A atividade enzimática a baixa temperatura também foi notável.
Efeito do pH na atividade da α-amilase
O efeito do pH também foi investigado. A enzima foi pré-incubada a temperatura ótima de 25 ° C e pH diferente. O pH ótimo foi 9,0 com uma atividade específica de 138 U / mg (Figura 2). Sabe-se que as α-amilases da maioria dos fungos têm um pH óptimo no intervalo ácido / neutro. Eles são geralmente estáveis ​​em uma ampla faixa de pH de 4 a 11 [18]. A enzima particular investigada neste estudo mostrou atividade ótima em condições alcalinas (semelhantes às bactérias) e alta atividade a baixa temperatura (semelhante a outros fungos). Assim, a combinação de temperatura e pH ótimos torna esta α-amilase fúngica única. Todos os resultados foram confirmados por zimografia (Figura 3). A significância de cada fator foi determinada pelos valores de F e valores de P (Tabela 2). O modelo P <0,0001 implícito no modelo foi significativo e todos os fatores e suas interações com valores de P menores que 0,01 foram significativos (α = 0,01). De particular interesse foi que a atividade enzimática de P. minima foi maior que a dos fungos padrão, A. oryzae e A. niger, cultivados nas mesmas condições (Figura 2).
Efeito de diferentes íons metálicos na atividade da amilase
Ensaios enzimáticos foram realizados sob duas condições diferentes, o ensaio enzimático normal descrito anteriormente e ensaios realizados com adição de diferentes íons metálicos (Na +, Mg2 +, Ca2 +, Co2 +, Mn2 +) a 2,5 mM. Os sais cloreto destes íons metálicos foram utilizados (CaCl, CoCl, MgCl, NaCl e MnCl). A atividade da amilase foi medida no pH e temperatura ótimos na presença desses íons metálicos. A actividade relativa da enzima foi comparada com a actividade obtida utilizando tampão citrato-fosfato 0,1 M. Os resultados demonstraram que CaCl e MnCl aumentaram a atividade total de amilase, enquanto MgCl e NaCl inibiram a atividade da enzima em comparação ao controle (Figura 4A).
Efeito do uso de diferentes fontes de carbono e nitrogênio na atividade da amilase
Os efeitos de diferentes fontes de nitrogênio e carbono foram estudados em condições ótimas [11] e foi observado que a inclusão de amido e L-asparagina (meio de controle) produziu maior atividade específica (138 U / mg). A substituição por três diferentes fontes de carbono (maltose, celulose, glicose) e nitrogênio (nitrato de amônio, extrato de levedura, peptona e triptofano) não aumentou a produção de amilase. Os resultados baseados na medição da atividade enzimática específica estão resumidos na Figura 4B. A zimografia foi realizada para todas as amostras e os resultados confirmaram que a maior atividade foi observada quando se utilizaram amido e L-asparagina como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente (dados não mostrados). A análise estatística mostrou que três fatores, incluindo meios (diferentes fontes de carbono e nitrogênio), pH e temperatura e suas interações tiveram efeitos significativos na atividade da amilase (dados não mostrados). A média de atividades utilizando diferentes fontes de carbono e nitrogênio foi comparada pelo teste de múltiplas faixas de Duncan e mostrou que o amido como fonte de carbono e L-asparagina como fonte de nitrogênio produziu a maior atividade de amilase a 25 ° C e pH 9.
Produção de α-amilase em biorreator de 1,4 L
A produção de α-amilase foi estudada sob condições controladas de temperatura e pH (condições ótimas para P. minima) de 25 ° C e pH 5 [11] em um biorreator de 1,4 L com 1 L de meio por 5 dias. Essas condições de reação foram melhores para o crescimento do fungo. A atividade enzimática total obtida com o biorreator foi de 212 U / ml, o que foi comparável à atividade enzimática em frascos agitadores (214 U / ml). Portanto, pode-se concluir que o scale-up laboratorial de P. minima não afeta a atividade da α-amilase.
Espectrometria de massa e sequenciamento peptídico
Um espectro de péptido obtido a partir da digestão tríptica no gel da a-amilase purificada deu 13 iões proeminentes (Figura 5A). Essa lista de picos gerados a partir do espectro foi utilizada para identificação de proteínas contra o banco de dados NCBI nr, utilizando o mecanismo de busca MASCOT, resultando em um acerto. O sinal 543.4 foi escolhido como o alvo para analisar no modo MS para identificar o ião precursor formado pela fonte de iões ESI. Os fragmentos e informao de impress digital do espectro MS / MS do pico precursor foram analisados ​​e os resultados com pontuaes superiores a 54 identificaram a sequcia de aminoidos de um ptido 9-mero como SIYFALTDR (Figura 5B). A sequ�cia pept�ica foi utilizada para pesquisar a base de dados NCBI que identificou semelhan� com a α-amilase [NCBI nr: gi 389646691] de Magnaporthe oryzae. Dado que esta sequência é um RefSeq provisório no banco de dados NBCI e não foi submetida a revisão final, realizamos uma pesquisa adicional no banco de dados UniProt usando o mecanismo de busca Protein Pilot que produziu a mesma correspondência.
Identificação de proteínas e estudo secreto da Preussia minima
A separao de proteas no sobrenadante de P. minima pelo seu peso molecular, bem como o ponto isoeltrico, foi uma forma eficaz de isolar proteas com actividade de amilase de outras proteas abundantes que ocorrem com o mesmo peso molecular. A identificação inequívoca da proteína purificada com atividade de amilase (Figura 6B, spot 26) foi realizada usando ESI-LC MS / MS. Os outros 32 pontos de proteína no gel 2D (Figura 6A) que foram identificados estão listados na Tabela 3.
 DISCURSAO 
O presente estudo foi realizado para investigar uma α-amilase recém-isolada de um fungo de origem endofítica, a Preussia minima, e as oportunidades potenciais que ela pode oferecer como um aditivo, particularmente para a indústria de detergentes. A purificao da? -Amilase foi realizada a partir de extractos brutos de cultura e obteve-se uma concentrao de enzima aproximadamente 7 vezes maior do que a enzima bruta com uma recuperao de 55,11%. Como a atividade específica é afetada pelas diferentes condições usadas nas etapas de fermentação e purificação, vários valores de atividade foram relatados [19, 20]. O menor rendimento de purificação da α-amilasepode ser atribuído à maior perda de enzima durante o processamento a jusante ou, alternativamente, menor concentração inicial de proteína do extrato bruto utilizado para o processo de purificação [20]. A atividade da α-amilase pode ser aumentada usando vários ativadores [19].
Ensaios enzimáticos foram realizados de sobrenadantes de culturas de P. minima após incubação no segundo meio indutor de hidrolase [11] em diferentes temperaturas e pH. A temperatura e o pH ótimos com base na atividade enzimática específica foram 25 ° C e 9, respectivamente; no entanto, a atividade a baixa temperatura também foi notável. As condições ótimas de temperatura e pH da produção de amilase provavelmente refletirão as condições climáticas encontradas em ambientes habitados pela planta hospedeira original [4]. O nome Eremophila significa "amante do deserto" e esse gênero é geralmente encontrado em toda a Austrália, predominantemente em condições áridas.
A atividade específica (138 U / mg) em pH 9 foi notável em comparação com atividades relatadas anteriormente [8, 9, 18, 21, 22, 23, 24]. Estes resultados foram confirmados por zimografia. As α-amilases da maioria dos fungos exibem um pH óptimo no intervalo ácido / neutro; no entanto, esta enzima parece ser excepcional com um pH ótimo de 9,0. Apesar de ligeiramente alcalinas, as α-amilases foram relatadas como estáveis ​​em uma ampla faixa de pH [18]. A atividade da amilase sob essas condições de baixa temperatura ótima e pH ótimo alcalino seria desejável para a aplicação desta enzima na indústria de detergentes como um aditivo para remover manchas à base de amido [25]
O efeito dos íons metálicos na atividade total da amilase foi estudado. Os resultados demonstraram que CaCl e MnCl aumentaram a atividade total da amilase em comparação ao controle, confirmando relatos anteriores que indicaram que as amilases são na sua maioria metaloenimas e necessitam de íons cálcio e manganês para atividade, integridade estrutural e estabilidade [7, 9, 18]. O cálcio aumenta a atividade da amilase por sua interação com resíduos de aminoácidos negativamente carregados, como os ácidos aspártico e glutâmico [22]. Íons de magnésio e sódio inibiram a atividade de amilase e observações similares foram feitas por Varalakshmi et al. [9] e Reyed [26]. Os resultados obtidos com MnCl sugerem que este sal pode ser um forte candidato como aditivo de cultura para aumentar a produção de enzimas. Os efeitos de diferentes fontes de nitrogênio e carbono sugeriram que a inclusão de amido e L-asparagina (no meio padrão) produziu maior atividade específica (138 U / mg). A substituição por três diferentes fontes de carbono (maltose, celulose e glicose) e nitrogênio (nitrato de amônio, extrato de levedura, peptona e triptofano) não aumentou a produção de amilase. Estes resultados foram confirmados por zimografia. Observamos que o crescimento fúngico foi superior quando o meio foi suplementado com fontes específicas de carbono e nitrogênio, o que refletiu os níveis relatados de produção de enzima. Isto sugere que a atividade enzimática está ligada à produção de biomassa. Muitos relatórios anteriores mostraram o mesmo efeito sobre a atividade enzimática, alterando as condições de fermentação [8, 9, 21, 24]. Como os fungos não produzem naturalmente enzimas em níveis suficientemente altos para fins comerciais, a fermentação é realizada para aumentar a secreção de enzimas alvo para níveis que sejam economicamente sustentáveis. Consequentemente, programas de triagem ambiental são usados ​​para buscar enzimas de vários ambientes, com o objetivo de expressar essas enzimas em hospedeiros de produção altamente secretores [27]. No presente estudo, diferentes fontes de carbono e nitrogênio apresentaram efeitos significativos tanto na produção de amilase quanto na atividade enzimática.
Nos estudos de biorreatores, a atividade enzimática total (212 U / ml) foi comparável à das culturas agitadas (214 U / ml). Assim, a partir dos estudos atuais no biorreator, concluiu-se que o processo para a produção de α-amilase a partir de P. minima pode ser otimizado com sucesso em um biorreator sem perda de atividade enzimática, o que tem implicações significativas para aplicações práticas na indústria. .
O secretoma de P. minima foi analisado por eletroforese em gel e espectrometria de massa. Como a sequência do genoma não estava disponível, a identificação entre espécies e a zimografia auxiliaram a análise. A maioria das proteínas identificadas no seio do P. minima secretome são enzimas envolvidas na degradação dos polímeros da parede celular da planta (amido, celulose, lignina, pectina e proteínas). Uma gama diversificada de outras enzimas, bem como algumas proteínas com funções desconhecidas, também foram identificadas a partir do estudo do secretome. Duas das manchas de proteína no gel 2D foram identificadas como α-amilase. No entanto, alguns pontos podem ser vistos agrupados em torno do mesmo peso molecular de uma das manchas (ponto 26), mas com valores pI ligeiramente diferentes, que podem ser isoenzimas da α-amilase. A actividade de amilase foi mostrada por bandas comuns agudas no zimograma de amilase 1D (aproximadamente 70 kDa) com o peso molecular aproximado da mancha de amilase identificada 26 no gel 2D. O local proeminente foi identificado como α-amilase com base nos dados de LC-ESI-MS / MS de uma mancha de proteína a aproximadamente 70 kDa, pI 6 no gel 2D.
Para auxiliar no metabolismo e subsequente sobrevivência sob diferentes condições ambientais, os fungos endofíticos secretam várias enzimas que degradam polímeros, muitas das quais foram identificadas no secretoma de P. minima. Um destes polímeros é o xilano, que é abundante nas folhas de dicotiledóneas, como as espécies de Eremopholia. Isso requer a ação de numerosas enzimas, como endo-1, 4- β-xilanases, por sua completa degradação. Atua clivando a espinha dorsal do açúcar xilose. Xilanase também foi encontrada no secretoma de outros fungos, incluindo Podospora anserina e Doremomyces stemonitis [16]. A celulose forma uma parte integral da parede celular da planta, onde é covalentemente ligada à lignina. A presença de celulase no secretoma de P. minima implica a necessidade de a enzima decompor o material vegetal pelo fungo para obter nutrientes. Outra enzima identificada no secretoma de P. minima foi a pectinase, que está envolvida na degradação da pectina, um polissacarídeo indigerível nas folhas. A presença de enzimas degradadoras de pectina no secretoma de P. minima pode ser reflexo de altos níveis de pectina contida nas folhas de E. longifolia. Em estudos anteriores, a pectinase foi identificada em outros fungos industriais, como o Aspergillus sp. e D. stemonitis [16]. A mannase também foi encontrada no secretoma de P. minima. Manana forma um componente da matriz da parede celular de folhas dicotiledóneas e a manase actua clivando no esqueleto de manose do polímero manano. Dois tipos diferentes de proteases foram encontrados no secretoma de P. minima que poderiam permitir que o fungo aumentasse a eficiência da degradação da matriz da parede celular da planta. Metaloproteases são endoproteases que clivam dentro de cadeias de aminoácidos e permitem que os fungos utilizem proteínas durante o processo de digestão. Proteases foram encontradas nos segredos de outros fungos filamentosos, incluindo Aspergillus oryzae [28], Aspergillus niger [29], Botrytis cinerea [30] e Trichoderma reesei [31].
Como o genoma de P. minima não foi seqüenciado, todas as atribuições de proteínas no secretoma de P. minima foram feitas por meio da identificação de espécies cruzadas baseada em similaridades de seqüência com proteínas de outras espécies de fungos e bactérias na base de dados do NCBI. O maior número de atribuições (nove) foi para proteínas de Bacillus subtilis. Muitas das outras proteínas eram dos fungos Magnaporthe oryzae e Aspergillus sp. Mais de vinte tipos diferentes de enzimas foram identificados no secretoma de P. minima como resultado de nosso trabalho, embora a α-amilasedominasse o secretoma. As outras proteínas eram principalmente enzimas que quebram celulose, lignina, pectina e proteína, refletindo o estilo de vida endofítico dos fungos. No entanto, havia muitos pequenos pontos de proteína que foram deixados não identificados, pois os espectros de MS / MS de boa qualidade não podiam ser atribuídos com segurança a nenhuma proteína conhecida no banco de dados do NCBI. Estas proteínas não identificadas podem ser enzimas que possuem atividade complementar às enzimas já identificadas no secretoma, aumentando assim seu acesso aos seus substratos alvo.
Conclusões
O presente estudo descreveu, pela primeira vez, a purificação e caracterização de uma α-amilase de uma linhagem da Preussia minima isolada da planta nativa australiana, Eremophila longifolia. As técnicas de eletroforese em gel, zimografia e espectrometria de massas permitiram caracterizar a α-amilase e identificar outras proteínas no secretoma desse fungo. Os resultados aqui obtidos mostram que a principal enzima extracelular secretada por P. minima é uma α-amilase. O rendimento e a atividade desta enzima não foram apenas aumentados pela natureza das fontes de carbono e nitrogênio, mas também pelo pH específico do meio de fermentação e pela temperatura de incubação. O pH alcalino ótimo o torna adequado para a produção industrial. O estudo de expansão bem sucedido incentiva a sua utilização efetiva para processos industriais de larga escala. As amilases são muito procuradas na indústria alimentícia para a produção de vários xaropes e na indústria de detergentes como um aditivo para remover a sujeira à base de amido. Portanto, a α-amilase apresentada neste trabalho pode ser considerada como uma forte potencial candidata para futura aplicação na indústria de detergentes onde as amilases alcalinas são particularmente procuradas, já que a maioria das amilases fúngicas industriais conhecidas e comumente usadas são ativas em condições ácidas [ 21]. A caracterização adicional desta enzima incluirá a avaliação de sua atividade e desempenho na presença de surfactantes para determinar sua adequação para uso na indústria de detergentes. Adicionalmente, a comparação detalhada do secretoma de P. minima com outros secretomes fúngicos endofíticos relatados pode fornecer informações valiosas sobre a associação planta-fungo hospedeiro. Como o primeiro estudo proteômico do secretoma de P. minima, o conjunto de enzimas identificadas poderia ter o potencial de aumentar a eficiência de vários processos industriais no futuro.