Eletroforese I

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2023.1 16/06/2023 ENZIMOLOGIA
Eletroforese I
O que é?
● Técnica de separação baseada na migração de
moléculas carregadas, numa solução, em função da
aplicação de um campo elétrico.
● Na eletroforese em gel, o deslocamento das
partículas é retardado pelas interações com o gel da
matriz que constitui o meio de migração e
comporta-se como um tamis (peneira) molecular.
➔ Obs: As partículas menores vão correr mais
que as partículas maiores.
● Migração por tamanho, forma e cargas das partículas.
Quais as aplicações da técnica de
eletroforese?
● Ampla utilização na bioquímica, biologia e
biotecnologia:
➔ Análise de DNA;
◆ Já tem carga negativa naturalmente.
➔ SDS-PAGE (unidimensional);
◆ Precisa conferir uma carga.
◆ Separação por massa.
◆ Não consegue utilizar as proteínas
usadas nessa técnica para realizar
outros possíveis testes complementares.
➔ Eletroforese bidimensional;
◆ Primeiro ocorre a separação por carga,
depois ocorre a separação por massa.
◆ Consegue utilizar as proteínas usadas
nessa técnica para realizar outros
possíveis testes complementares.
Qual a principal utilidade da
técnica em Enzimologia?
● Caracterização de amostras;
● Puri�cação de enzimas;
Eletroforese em gel de
poliacrilamida com dodecilsulfato
de sódio (SDS-PAGE)
● Permite avaliar a massa molecular das subunidades
protéicas, determinar as subunidades que compõem
as proteínas e avaliar a sua pureza.
● A migração ocorre por massa, não por carga.
➔ Existe uma carga puxando as moléculas, e as
menores vão conseguir correr mais que as
maiores.
● Obs: As proteínas têm cargas diferentes, bem como
estruturas variadas (1ª, 2ª, 3ª e 4ª).
● SDS: Detergente aniônico que desnatura proteínas
fornecendo cargas negativas a elas, mantendo uma
relação carga/massa constante.
➔ Quebra ligações hidrofóbicas, desnovelando as
proteínas (desnaturando-as e as deixando
linearizadas) e conferindo cargas negativas.
● SDS-PAGE desnaturante:
➔ Condições não-redutoras.
◆ Ligações dissulfeto íntegras, subunidades
protéicas juntas (não é possível
determinar o número de subunidades).
➔ Condições redutoras.
◆ Ligações dissulfeto quebradas,
subunidades protéicas separadas (é
possível determinar o número de
subunidades).
◆ Agentes redutores quebram as ligações
dissulfeto e separam as subunidades.
■ Agentes redutores:
1. DTT;
2. B-Mercaptoetanol;
● Para ser submetida à eletroforese, a proteína deve
estar desnaturada, para dessa forma termos uma
separação baseada apenas no tamanho (massa
molecular) das moléculas.
● Passos para a execução da técnica de SDS-PAGE:
1) Preparo da amostra
a) Tampão de amostra:
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i) Glicerol -> Aumenta a densidade,
para impedir que as amostras
migrem pros pocinhos vizinhos.
ii) SDS -> Quebra as ligações
hidrofóbicas e confere carga
negativa.
iii) Β-mercaptoetanol -> Quebra
as ligações dissulfeto.
iv) Azul de bromofenol -> Confere
cor para auxiliar na visualização
do processo (não mostra as
bandas, apenas se a corrida está
de fato acontecendo).
v) Incubação a 100ºC por
aproximadamente 5 minutos ->
Quebra as ligações de
hidrogênio.
2) Preparo do gel
a) Gel de poliacrilamida:
i) Mistura de acrilamida com
bis-acrilamida.
● Ambas são neurotóxicas
e carcinogênicas.
ii) Forma uma rede tridimensional
de �bras e poros (tamis
molecular).
iii) A quantidade de acrilamida é
inversamente proporcional ao
tamanho dos poros:
● +Poliacrilamida = Poros
menores;
● - Poliacrilamida = Poros
maiores;
b) Polimerização da acrilamida:
i) Persulfato de amônio (APS) ->
Agente polimerizador.
● Confere radicais livres
para que se polimerize.
● A acrilamida e a
bis-acrilamida não se
juntam sozinhas,
precisam do APS para
que isso ocorra, para
formar ligações
cruzadas.
ii) TEMED -> Catalisador.
● Vai facilitar a
polimerização.
● Promove maior
produção de radicais
livres liberados pelo
APS.
c) Gel de empacotamento, empilhamento ou
gel de cima:
i) Menor concentração de
poliacrilamida -> poros maiores
-> migração livre das proteínas
formando uma pilha.
ii) Permite que a corrida comece
igual para todas as moléculas.
Como uma linha de largada.
iii) 4% normalmente.
d) Gel de separação ou gel de baixo:
i) Maior concentração de
poliacrilamida -> poros menores
-> migração diferencial das
proteínas de acordo com suas
massas moleculares.
ii) Separa as proteínas.
iii) 10 - 15% normalmente.
3) Aplicação das amostras
a) Tampão de corrida:
i) Tris-HCl
ii) Glicina
iii) SDS
b) Além dos poros, o tipo de tampão auxilia
para "segurar" as proteínas, para
começar a corrida igual.
c) O tampão permite que a corrente
elétrica passe.
4) Corrida eletroforética: aplicação de campo
elétrico
a) Direção da corrida:
( - ) Cátodo ---> ( + ) Ânodo.
5) Coloração do gel
a) Coomassie Brilhante BLUE -> Especí�co
para proteínas.
i) Mais especí�co, porém menos
sensível.
ii) 1 a 10 ug de proteínas.
iii) Corou, pode descorar.
b) Nitrato de prata -> Proteínas,
carboidratos, lipídios.
i) Menos especí�co, porém mais
sensível.
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ii) Caso o Coomassie Brilhante
BLUE não core as proteínas, o
Nitrato de prata pode ser
utilizado como substituto, visto
que é mais sensível.
iii) 10 a 100 ng de proteínas.
iv) Corou, não consegue descorar.
6) Interpretação dos resultados
a) Sem cálculos: Compara-se as massas
moleculares com o padrão.
b) Com cálculos: Realiza-se para ter
certeza.
i) Migração relativa:
Migração individual ÷ migração total
● OBS: A poliacrilamida é ideal para separação de
proteínas porque é quimicamente inerte,
eletricamente neutra, hidrofílica, e transparente
para detecção óptica.
○ Não interage com as proteínas.
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