Tecnicas de Imunodiagnóstico

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O Western Blotting é uma técnica imunológica para
determinar a presença de uma proteína em uma amostra
biológica.
Western Blotting é usado para identificar e determinar a
quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína
em uma mistura de proteínas ou de outras moléculas.
Primeiro a mistura é sujeita à separação analítica,
normalmente por SDS-PAGE, de modo que as posições
finais de proteínas diferentes no gel são uma função do
seu tamanho molecular.
A coleção de proteínas é então transferida, por
eletroforese, do gel separador de poliacrilamida para uma
membrana de suporte de forma que a membrana adquire
uma réplica da coleção de macromoléculas separadas
presentes no gel. SDS é deslocado da proteína durante o
processo de transferência, e frequentemente
determinantes antigênicos nativos são recuperados
conforme a proteína se redobra.
A posição do antígeno protéico na membrana pode então
ser detectada pela ligação de um anticorpo específico não
marcado para aquela proteína (o anticorpo primário)
seguido por um segundo anticorpo marcado que se liga ao
anticorpo primário. Esta abordagem fornece informações
sobre o tamanho e a quantidade de antígenos.
No geral, sondas do segundo anticorpo são marcadas com
enzimas que geram sinais quimiluminescentes e deixam
imagens em filme fotográfico. Fluoróforos próximos do
infravermelho também podem ser usados para marcar
anticorpos, e a luz produzida pela excitação do fluoróforo
fornece uma quantificação mais precisa de antígenos
quando comparado com anticorpos secundários ligados à
enzima. A sensibilidade e especificidade desta técnica
podem ser aumentadas começando com proteínas
imunoprecipitadas em vez de misturas brutas de proteína.
Este procedimento sequencial é especialmente útil para a
detecção de interações proteína-proteína.
Por exemplo, a associação física de duas proteínas
diferentes na membrana de um linfócito pode ser
estabelecida pela imunoprecipitação de um extrato de
membrana com o uso de um anticorpo específico para uma
das proteínas e realizando um Western Blotting do
imunoprecipitado usando um anticorpo específico para a
segunda proteína que pode ter sido coimunoprecipitada
juntamente com a primeira proteína.
Uma variação da técnica de Western é usada
rotineiramente para detectar a presença de
anticorpos anti-HIV em soros de pacientes. Neste
caso, uma mistura definida de proteínas HIV é
separada por SDS-PAGE e transferida para uma
membrana, e a membrana é incubada com diluições do
soro de teste. A membrana é então analisada com uma
segunda Ig anti-humana marcada para detectar a
presença de anticorpos HIV-específicos que estavam
no soro e se ligaram às proteínas HIV.
A técnica de transferir proteínas de um gel para uma
membrana é chamada de Western Blotting como uma
piada de bioquímicos. Southern é o sobrenome do
cientista que primeiro transferiu DNA de um gel
separador para uma membrana por transferência
capilar, uma técnica chamada de Southern blotting
desde então. Por analogia, Northern blotting foi o
termo aplicado à técnica de transferir RNA de um gel
para uma membrana, e Western Blotting é o termo
usado para descrever a transferência de proteínas
para uma membrana.
.
Western Blotting/Immunoblotting
Técnicas de Imunodiagnóstico
Andreinna Ryanne 
Imunopatologia
Em seguida, um anticorpo anti fração Fc do anticorpo
primário (anticorpo secundário, construído após
injeção da fração Fc em animais, normalmente
cabras/ratos) é colocado na membrana, faz o
reconhecimento, liga no primário, marcando-o. 
O anticorpo secundário tem ligado a ele uma enzima
que, ao entrar em contato com um reagente, emite
fluorescência ou quimioluminescência, permitindo a
quantificação do antígeno. 
Quando o antígeno ou anticorpo é ligado
covalentemente a uma enzima, ele pode ser
quantificado por determinação espectrofotométrica
da taxa de conversão na qual a enzima converte um
substrato cristalino em um produto colorido; o ensaio
é chamado de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima
(ELISA).
Existem diversas variações de ELISA, mas a versão do
ensaio usada mais comumente é o ensaio sanduíche. O
ensaio sanduíche usa dois anticorpos reativos
diferentes com epítopos diferentes no antígeno cuja
concentração deve ser determinada. Uma quantidade
fixa de um anticorpo é ligada a uma série de suportes
sólidos replicados, como tiras plásticas de
microtitulação.
Soluções de amostra contendo antígeno a uma
concentração desconhecida ou uma série de soluções
padrão com concentrações de antígeno conhecidas são
acrescentadas às tiras e deixadas para que a ligação
ocorra. Antígeno não ligado é removido por lavagem, e
o segundo anticorpo, que é ligado à enzima ou rádio-
marcado, é adicionado para se ligar.
O antígeno serve como uma ponte, então quanto mais
antígeno nas soluções padrão ou de teste, mais
segundos anticorpos ligados à enzima ou
radiomarcados irão se ligar. Os resultados das
soluções padrão são usados para construir uma curva
de ligação para o segundo anticorpo como função da
concentração de antígeno, da qual podem ser inferidas
as quantidades de antígeno nas soluções de amostra.
Quando este teste é realizado com dois anticorpos
monoclonais, é essencial que estes anticorpos vejam os
determinantes não sobrepostos no antígeno; de outra
maneira, o segundo anticorpo não pode se ligar. Em
uma variante clínica importante de ensaios de imuno
ligação, amostras de pacientes podem ser testadas
para a presença de anticorpos que são específicos
para um antígeno microbiano (p. ex., anticorpos
reativos com proteínas do vírus da imunodeficiência
humana [HIV] ou o vírus da hepatite B) como
indicadores de infecção. Neste caso, uma quantidade 
Consiste na detecção de um antígeno em uma matriz
fixa/ membrana através de um componente imune.
Para que a matriz contenha o antígeno, primeiramente
ele deve ser tratado por meio da técnica de
eletroforese (matriz de gel porosa - poliacrilamida com
SDS - dodecil sulfato de sódio), que permite a passagem
de proteínas, as quais migram em um campo elétrico
induzido do pólo negativo para o positivo.
Por que as proteínas migram todas para o polo positivo,
sendo que algumas podem ter cargas positiva, negativa
ou neutra? Porque na técnica, ou seja, no tratamento da
mistura de antígenos proteicos, as proteínas são
desnaturadas na presença de calor, unidas ao SDS e
aplicadas ao gel.
O que é SDS? É uma molécula que possui um ramo de 12
átomos de carbono (apolar), ligados a um grupo sulfato
(polar), dando a molécula propriedades anfipáticas
requeridas por um detergente.
As proteínas são aquecidas e perdem sua conformação
estrutural. Quando são resfriadas, elas se enovelam
novamente com o SDS dentro delas, ficando, assim,
carregadas negativamente.
As proteínas grandes migram menos em direção ao pólo
positivo do que as proteínas pequenas, pois apresentam
dificuldade em passar pelos poros do gel. Assim, quanto
maior o peso molecular, menor será a migração, mesmo
apresentando mais cargas.
O gel é extremamente quebradiço, o que inviabiliza o
tratamento com anticorpos. Dessa forma, as proteínas
são transferidas para uma membrana/ papel tratado
com polímeros de nitrocelulose que não se desmancha na
água. A transferência ocorre quando se destina o campo
elétrico do gel para o papel e este passa a ter o pólo
positivo.Assim, as proteínas migram e colam na
membrana/papel. 
Para identificar determinado antígeno, coloca-se
anticorpos do tipo IgG para realizar o reconhecimento.
Quando ocorre o reconhecimento pelo anticorpo
primário, a membrana é lavada e ele fica nela, pois o
reconhecimento da região hipervariável do anticorpo
com antígeno ocorre por ligações fracas. 
Resumo
ELISA
O soro é adicionado e se o anticorpo estiver presente,
este se liga ao antígeno. Em seguida, o anticorpo
secundário anti IgG e IgM é adicionado (pode
reconhecer somente IgG ou IgM) e reconhece o
primário ligado na placa. O secundáriopossui uma
enzima que, ao entrar em contato com o reagente
presente na placa, emite fluorescência.
 Dessa forma, o sinal somente para o IgG indica que a
infecção é crônica ou o indivíduo foi vacinado; sinal
para o IgM indica que ele está com a infecção ativa/
aguda recente e o sinal para IgM e IgG indica que a
infecção está ativa, mas crônica/menos aguda recente
- desenvolveu anticorpos. Quanto mais diluído for o
sinal, maior a infecção ou maior a formação de
memória imunológica de IgG ou IgM.
A linhagem do tecido, estágio de maturação, ou status
de ativação de uma célula pode ser determinado pela
análise da superfície celular ou expressão intracelular
de moléculas diferentes. Esta técnica é geralmente
realizada pela coloração da célula com sondas
marcadas por fluorescência que são específicas para
aquelas moléculas e pela medição da quantidade de
fluorescência emitida pela célula.
O citômetro de fluxo é um instrumento especializado
que pode detectar fluorescência em células individuais
em uma suspensão e, assim, determinar o número de
células expressando a molécula à qual uma sonda
fluorescente se liga. Suspensões de células são
incubadas com sondas marcadas por fluorescência, e a
quantidade de sonda ligada por cada célula na
população é medida pela passagem das células, uma de
cada vez, através de um fluorímetro com um feixe
incidente gerado por laser.
As quantidades relativas de uma molécula específica
em diferentes populações celulares podem ser
comparadas pela coloração de cada população com a
mesma sonda e pela determinação da quantidade de
fluorescência emitida. Como preparação para análise
por citometria de fluxo, suspensões celulares são
coradas com as sondas fluorescentes de preferência.
Mais frequentemente, estas sondas são anticorpos
marcados com fluoróforos específicos para uma
molécula na superfície celular.
Alternativamente, moléculas citoplasmáticas podem
ser coradas pela permeabilização temporária de
células e pela permissão da entrada de anticorpos
marcados através da membrana plasmática. Além dos
anticorpos, diversos indicadores fluorescentes de
concentrações de íon citoplasmático e de potencial de 
saturante de antígeno é adicionada para replicar em
poços contendo anticorpos ligados à placa ou o antígeno
fica diretamente ligado à placa, e então diluições em
série do soro do paciente são adicionados para se ligar.
A quantidade de anticorpos do paciente ligada ao
antígeno imobilizado é determinada pelo uso de um
segundo anticorpo anti-imunoglobulina (Ig) humano
ligado à enzima ou radiomarcado.
Este ensaio pode detectar tanto antígenos, quanto
anticorpos, pois antígenos proteicos e anticorpos são
muito bons para ligar em placas, tornando-se uma base
estrutural para captura.
A primeira forma é com placas que possuem vários
anticorpos colados e quando se adiciona o soro de um
indivíduo infectado com alguma doença, o antígeno se
liga ao anticorpo. O excesso é lavado e, em seguida, é
adicionado um anticorpo anti outro epítopo do antígeno
(anticorpo secundário). Quanto maior a diluição na placa,
há persistência do sinal, indicando que o indivíduo está
muito infectado.
Outra forma de realizar o teste é por meio da detecção
do anticorpo. Assim, utilizam-se placas com antígenos
colados para determinada doença, a fim de determinar
se o soro ou amostras biológicas do paciente possuem
anticorpos anti o antígeno.
Resumo
Citometria de Fluxo e Separação por
Fluorescência de Células Ativadas
 
Consiste na detecção de células.
Muito aplicado para contagem de linfócitos de
pacientes com infecções virais.
Exemplo: quantificação de linfócitos T CD4 e
linfócitos T CD8 em pacientes com HIV. Utiliza -se um
anticorpo que liga ao CD4 com fluorescência vermelha
e outro que se liga ao CD8 com fluorescência verde, o
soro é colocado em uma máquina que possui um bico e
este puxa todas as células da amostra para dentro do
equipamento, o bico seleciona célula por célula do
sangue do indivíduo.
Um laser excita o composto que está ligado ao
anticorpo, havendo emissão de sinal. A partir disso, um
gráfico é construído com eixos referentes à
fluorescência vermelha e verde, permitindo a
quantificação de células CD4 e CD8, duplo positivo e
negativo. 
Se houver diminuição de células CD4 e aumento de
CD8, significa que a contagem de monitoramento do
nível de CD4 no indivíduo infectado com HIV está
muito baixa, ou seja, a terapia não está adequada,
necessitando ajustar a dose.
redução-oxidação podem ser detectados por citometria
de fluxo. Estudos do ciclo celular podem ser realizados
por análise de citometria de fluxo de células coradas
com sondas fluorescentes ligantes de DNA como o
iodeto de propídio.
Células apoptóticas podem ser identificadas com sondas
fluorescentes, como a anexina V, que se liga a
fosfolipídios expostos anormalmente na superfície de
células em processo de morte. Citômetros de fluxo
modernos podem detectar três ou mais sinais
fluorescentes de cores diferentes rotineiramente, cada
um ligado a um anticorpo diferente ou a outra sonda.
Esta técnica permite a análise simultânea da expressão
de muitas combinações diferentes de moléculas por uma
célula.
Além da detecção de sinais fluorescentes, citômetros
de fluxo também medem as propriedades de dispersão
de luz frontal e lateral das células, que refletem o
tamanho da célula e sua complexidade interna,
respectivamente. Frequentemente, esta informação é
usada para distinguir diferentes tipos de células. Por
exemplo, comparado a linfócitos, neutrófilos causam
maior dispersão lateral por causa de seus grânulos
citoplasmáticos, e monócitos causam maior dispersão
frontal devido a seu tamanho.
Resumo