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Material Complementar Unidade 1 CONCEITO DE IDENTIFICAÇÃO A identificação é uma soma de caracteres que individualizam uma pessoa. Tal processo determina a identificação ou a não identificação de um indivíduo, ou seja, aquela pessoa é ou não é determinado indivíduo. França (20011) define identidade como sendo o conjunto de caracteres que individualiza uma pessoa ou uma coisa, fazendo-a distinta das demais. Dentre os requisitos técnicos para um processo de identificação ser utilizado estão: • Unicidade - elementos ou conjunto de sinais escolhidos devem permitir a distinção de um indivíduo dos outros; • Imutabilidade - o que se usa para identificar um indivíduo tem que ser imutável, ou seja, não pode sofrer mudanças devido a ação da idade ou de doenças; • Praticabilidade - deve haver uma possibilidade de uso prático, compatível com custo, facilidade de obtenção etc; • Classificabilidade - deve haver uma possibilidade de classificação dos dados coletados. Os métodos de identificação devem ser cientificamente sólidos, confiáveis, aplicáveis e capazes de serem implementados dentro de um período de tempo razoável. Todo processo de identificação envolve métodos primários e secundários de identificação humana. Os meios primários e mais confiáveis de identificação são papiloscopia (impressão digital), odontologia legal (arcada dentária) e genética forense (perfil genético/DNA). Números de série únicos de implantes médicos também podem ser identificadores confiáveis em termos de prova de identidade. Os meios secundários de identificação incluem descrição pessoal, achados médicos, tatuagens, bem como pertences e roupas encontradas com a vítima. Esses meios de identificação servem para apoiar identificação por outros meios e normalmente não são suficientes como único meio de identificação2. Torna-se importante diferenciar dois termos que são equivocadamente utilizados como sinônimos: reconhecimento e a identificação de um indivíduo. O processo pelo qual familiares ou amigos, utilizando-se apenas da observação direta ou indireta, imaginam conhecer a identidade de um indivíduo e indicam essa às autoridades, é chamado de reconhecimento. Apesar de ser um procedimento usualmente empregado, esse não deve ser empregado como um método confiável de identificação humana, pois é subjetivo, não é baseado em conhecimento técnico-científico e não pode ser reprodutível3. Como visto, os meios primários e mais confiáveis de identificação são impressão digital, a arcada dentária e o perfil genético (DNA). A identificação pela odontologia legal é realizada por meio da comparação entre as características dentárias e esqueléticas observadas nos restos mortais com o registro dessas mesmas características quando a vítima estava viva. O exame odontolegal comumente depende do registro sob a forma de exames radiográficos, fotográficos e modelos. Apesar de conferir grande confiabilidade e dos aspectos positivos da técnica, alguns pontos continuam a constituir grandes dificuldades à sua realização, tal como que sejam encontrados os cirurgiões-dentistas responsáveis pelos tratamentos dessas quando em vida e que esses profissionais tenham a guarda dos registros clínicos (prontuários, fotografias ou radiografias) e os disponibilizem para comparação3. A papiloscopia, por sua vez, é uma técnica amplamente utilizada e que atende adequadamente muitos casos. Entretanto também possui suas limitações: • Inviável em casos de amputações; • Inviável na identificação de corpos carbonizados ou altamente deteriorados; • Inviável em caso de condições congênitas (ex: síndrome de Nagali); • Dificuldade na identificação de vítimas estrangeiras; • Para fins criminais, nem sempre a impressão digital é encontrada no local de crime; • A definição da digital pode sofrer variações entre indivíduos, de forma natural ou em decorrência do atrito ou contato frequente com substâncias químicas. A identificação genética, por sua vez, supera todas estas dificuldades, uma vez que de qualquer parte do corpo humano (mesmo de pequenos fragmentos) é possível recuperar DNA. Por outro lado, em locais de crime, é muito comum a coleta de material biológico. Atualmente, tendo em vista a sensibilidade das técnicas laboratoriais de genética forense, é possível obter perfis genéticos de qualidade inclusive do chamado “DNA de toque”, ou seja, do DNA deixado sobre superfícies que tiveram contato com a pele humana (decorrente de descamação epidérmica e de secreções naturais da pele). Além disto, a análise do perfil genético de um indivíduo, como método de identificação, resguarda as seguintes características já mencionadas previamente: • Imutabilidade: o DNA está presente em todo o corpo humano, não se alterando a depender do tecido analisado, e não muda através do tempo; • Praticabilidade: a coleta é fácil (suabe bucal) e sua análise vem tendo o custo cada vez mais baixo (em torno de R$ 100,00 – R$ 200,00 por amostra); • Classificabilidade: os dados podem ser resumidos em um código alfa- numérico, facilmente armazenada em bancos de dados. O QUE É DNA? A estrutura dos organismos vivos Com exceção dos vírus, todos os seres vivos são formados por células. Célula é a menor parte com forma definida que constitui um ser vivo e é dotada de capacidade de auto-duplicação (pode se dividir sozinha). São as unidades estruturais e funcionais dos organismos vivos. Podem ser comparadas aos tijolos de uma casa. As células, em geral, possuem tamanho tão pequeno que só podem ser vistas por meio de microscópio. Dentro delas ocorrem inúmeros processo que são fundamentais para manter a vida. Os seres humanos possuem aproximadamente 100 trilhões de células; um tamanho de célula típico é o de 10 µm (1 µm = 0,000001m); uma massa típica da célula é 1 nanograma (1ng = 0,000000001g). A nível básico, as células eucarióticas podem ser descritas como contendo três regiões sub-celulares distintas; nomeadamente a membrana , o citosol e o núcleo. Suas características são citadas a seguir: • Membranas celulares: apesar de terem apenas nanômetros de largura, são altamente enriquecidas em receptores de sinalização, proteínas transmembranares, bombas e canais, permitindo absorver substâncias e interagir com outros células à sua volta. • Citosol: abriga organelas celulares, incluindo o complexo de Golgi, o retículo endoplasmático (RE), ribossomos e numerosas vesículas e vacúolos. Podem existir proteínas solúveis nesta região. • Núcleo: abriga o material genético e todos os componentes relacionados à sua expressão e regulação. As células não são uma mistura amorfa de proteínas, lipídios e outras moléculas. Em vez disso, todas as células são constituídas por compartimentos bem definidos, cada um especializado em uma função particular. Em muitos casos, os processos subcelulares podem ser descritos com base na ocorrência na membrana plasmática , no citosol ou dentro de organelas ligadas à membrana, como o núcleo, o aparelho de Golgi ou mesmo os componentes vesiculares do sistema de tráfico de membrana , como os lisossomos e os endossomas. Figura: Estrutura celular. O DNA é uma molécula que contém as informações genéticas dos organismos e está presente nas células. Praticamente qualquer material biológico contém DNA, seja ele mucosa oral (células epiteliais), sangue, sêmen, músculo, órgãos, ossos, dentes, saliva, urina, fezes, pelo, etc. As moléculas de DNA nuclear são compostas de dois filamentos enrolados na forma de espiral formando uma hélice, semelhante a uma escada retorcida cujos degraus são feito de pares de moléculas menores (monômeros) chamadas bases. No DNA quatro tipos de bases estão presentes: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Cada base só pode ser unida com uma base complementar específica: A com T e G com C. A união de duas bases complementares formaum degrau da escada chamado par de bases. O exame de DNA foi um avanço tecnológico relativamente recente no campo das ciências forenses. Tal tecnologia tem um notável poder de discernir as diferenças genéticas, ao ponto de individualização. Juntamente com o desenvolvimento de métodos cada vez mais sensíveis, o teste de DNA é agora uma parte essencial do arsenal pericial objetivando a investigação de crimes. A identificação de indivíduos através do DNA (também chamada de tipagem do DNA ou genotipagem) foi introduzida na ciência forense em meados da década de 1980, decorrente de descobertas feitas em pesquisas biomédicas. Ray White, um geneticista americano da Universidade de Utah, identificou regiões de DNA que não codificavam proteínas, mas eram altamente variáveis entre os indivíduos. Figura: Estrutura química do DNA Cada indivíduo representa uma combinação do DNA de seus pais, sendo que a metade do DNA é herdada da mãe, e a outra metade, do pai. Todas as células de um indivíduo contém a mesma informação genética (mesmo DNA), o que se traduz em 3,2 bilhões de pares de bases. As exceções são os gametas (que possuem apenas metade da informação genética) e as células anucleadas, como as hemácias (que não possuem tal material genético). Contudo, a fita de DNA é muito longa e isso com certeza poderia atrapalhar na hora da divisão celular (quando o DNA também tem que se dividir, indo cada uma das cópias para uma das células filha). Por isso o DNA se condensa, formando as estruturas que chamamos de cromossomos. Eles nada mais são do que o DNA altamente condensado. Porém, a totalidade do DNA de uma célula não se concentra em um único cromossomo. Cada espécie tem um número determinado de cromossomos. A espécie humana, por exemplo, tem um conjunto de 46 cromossomos, presentes nos núcleos de cada célula. Na verdade temos dois cromossomos de cada tipo, ou seja, eles formam duplas. As células chamadas diplóides possuem os cromossomos em pares; dizemos que são cromossomos homólogos. Nosso organismo possui em sua maioria células diplóides; nossas únicas células haplóides são os gametas (óvulos e espermatozóides). Quando os gametas se encontram (na fecundação) o material genético de ambos se une e o número diplóide volta a se reestabelecer. Como vimos, o DNA humano é organizado em 23 pares de cromossomos. Dentro de todo esse DNA, existe uma parte codificante e uma parte não codificante. A parte codificante é aquela que está relacionada à produção de proteína, a qual pode estar relacionada a alguma característica humana. Um elevadíssimo percentual do DNA, mesmo o codificante, é comum a todos os indivíduos, porque nosso corpo funciona da mesma forma, nossos órgãos são os mesmos, ou seja, a forma de funcionamento do corpo é igual. Apenas um pequeno percentual da DNA nos diferencia, indivíduo a indivíduo, gerando diferenças na cor dos olhos, na cor da pele, na altura, no formato do rosto etc. Uma região codificante tem que ser mais ou menos igual, senão nós seríamos muito diferentes em termos de funcionamento do organismo. A região não codificante que, na verdade, não influencia nas características físicas e comportamentais das pessoas, ela sim tem interesse científico, porque varia muito de pessoa para pessoa permitindo sua individualização e sem, contudo, variar o funcionamento do nosso corpo. HISTÓRICO DO EXAME DE DNA A grande variabilidade genética existente torna o DNA uma ferramenta poderosa de identificação humana, pois permite a individualização de pessoas, da mesma maneira que o faz as impressões digitais. Assim, o DNA coletado em um local de crime pode tanto ligar um indivíduo ao vestígio como eliminar um suspeito da cena do crime, evitando uma condenação equivocada. É importante ressaltar que apesar do DNA humano possuir bilhões de pares de base, no exame para a obtenção do perfil genético são analisadas de 5.000 a 20.000 pares de bases em regiões não-codificantes. Ou seja, em um exame de DNA (obtenção de perfil genético) é analisado menos de 0,0007% do genoma humano, em regiões que não guardam relação com traços somáticos ou comportamentais das pessoas. A identificação de indivíduos através do DNA foi introduzida na ciência forense em meados da década de 1980, decorrente de descobertas feitas em pesquisas biomédicas. Ray White, um geneticista americano da Universidade de Utah, identificou regiões de DNA que não codificavam proteínas, mas eram altamente variáveis entre os indivíduos. Figura: Dr Ray White em seu laboratório na Universidade de Utah. A pesquisa inicial incluiu o uso de enzimas de restrição para cortar filamentos de DNA em locais específicos e produzir fragmentos de DNA de comprimentos definidos. Figura: Enzima de restrição cortando o DNA em um ponto específico. Cada enzima de restrição reconhece uma sequência própria e divide o DNA naquele ponto. White separou os fragmentos com base no tamanho, sendo as variações chamadas de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms – polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição). Em 1980, White e colaboradores descreveram o primeiro marcador RFLP polimórfico e propuseram métodos para mapear o genoma humano com base na tecnologia RFLP. Figura: Como era realizado o exame de DNA baseado na análise RFLP. As primeiras aplicações da técnica na área forense surgiram do trabalho de Alec Jeffreys, que descobriu que a tecnologia RFLP poderia ser usada para desenvolver padrões de DNA, mais ou menos específicos para cada indivíduo5, e a descoberta a potencialidade de regiões do DNA não codificantes na individualização de pessoas. Na época, seu trabalho se concentrava no teste de paternidade. Dado o impacto dessa descoberta, Dr Jeffreys foi instado a usar pela primeira vez tal ferramenta em um caso forense (https://www.dnalc.org/view/15107-The- Ghana-Immigration-case-Alec-Jeffreys.html). Embora não criminal, a investigação tratava do esclarecimento de uma situação de imigração, um caso de vínculo materno, onde se queria confirmar um vínculo genético entre uma suposta mãe e seu suposto filho. Esse caso foi muito impactante para a época. Dada a eficácia do exame de DNA na identificação do vínculo genético (maternidade), foi pensado, https://www.dnalc.org/view/15107-The-Ghana-Immigration-case-Alec-Jeffreys.html https://www.dnalc.org/view/15107-The-Ghana-Immigration-case-Alec-Jeffreys.html pela primeira vez, que esse exame de DNA seria útil também em casos forenses criminais. Figura – Manchete de jornal da época, relatando o primeiro caso de uso forense do exame de DNA. Na mesma época duas meninas, Lynda Mann e Dawn Ashworth, haviam sido estupradas e assassinadas em Leicester, Reino Unido, em locais de crime diferentes. Naquela época não existia o exame de DNA na área de segurança pública. Porém existia um suspeito, Richard Buckland, cujo tipo sanguíneo (na época, era o único exame usado) era compatível com o sangue encontrado nas duas cenas de crime. Tal suspeito havia confessado um dos crimes, porém não confessava ser o autor de ambos. Investigando o modus operandi, a polícia tinha evidências de que se tratava de um mesmo autor, e estava confiante de que tinha encontrado a pessoa certa. Contudo, tendo em vista a dificuldade em se concluir o caso, e tendo em vista a reverberação do uso anterior do exame de DNA, o investigador responsável fez contato com o Alec Jeffreys e pediu que ele atuasse nesse caso. Figura – Lynda Mann e Dawn Ashworth, foram estupradas e assassinadas em Leicester, Reino Unido, na década de 80. Jeffreys concordou em fazer exames no sangue de Buckland e no sêmen retirado dos corpos das garotas mortas. Ao final do exame ele constatou que as garotas haviam sido estupradas pelo mesmo homem, como indicava a polícia. Contudo o perfil genético de Buckland era completamente diferente, logo ele não era o criminoso.A polícia ficou atônita e inicialmente relutou em acreditar no que estava ouvindo. Porém o teste foi repetido mais duas vezes e reproduziu o mesmo resultado. Richard Buckland foi considerado inocente e liberado em seguida, após mais de três meses de custódia. A polícia voltou então a buscar o assassino das duas meninas. No mês seguinte, os detetives decidiram que a tecnologia que havia libertado Buckland deveria ser usada para capturar o assassino. Cartas foram enviadas para todos os homens nascidos entre 1953 e 1970, que viveram ou trabalharam na área de Narborough nos últimos anos, pedindo-lhes que concordassem em fornecer uma amostra de sangue. Após oito meses, 5.511 homens forneceram amostras de sangue, porém não houve correspondência com as amostras de sêmen. A polícia continuou a investigação e meses depois chegou a Colin Pitchfork, um padeiro de 27 anos e pai de dois filhos pequenos. Ele confessou os crimes e o teste de DNA confirmou-o como o culpado pelos assassinatos. Pitchfork foi condenado à prisão perpétua pela Corte do Reino Unido. Figura – Manchete de jornal da época, relatando a prisão de Colin Pitchfork, com base em exames de DNA. A partir deste caso, o potencial investigativo do exame de DNA foi rapidamente reconhecido e adotado pelas forças policiais em todo o mundo. Nos últimos 30 anos, segundo algumas estimativas, mais de 50 milhões de pessoas tiveram seu DNA testado durante investigações criminais. Tal medida assegurou as condenações de incontáveis criminosos, a exclusão de vários suspeitos inocentes (como Buckland) e a anulação de erros judiciais. Figura: Dr Alec Jeffreys em seu laboratório na Universidade de Leicester. Os fragmentos de DNA cortados pelas enzimas de restrição contêm genes e DNA não codificante. O DNA não codificante inclui regiões que consistem em repetições diretas da mesma sequência de bases, referidas como repetições em série (ou repetições em tandem). O número de repetições da sequência é determinado geneticamente e, considerando que a sequência é suficientemente longa e repetida um número de vezes suficiente, afetará o comprimento do fragmento de restrição. Estas regiões são denominadas VNTR (Variable Number of Tandem Repeats - Número Variável de Repetições em Tandem). Figura: Uso das regiões VNTR na identificação de pessoas Apesar de altamente discriminatória a análise RFLP de VNTRs apresentam problemas como: 1. processo trabalhoso e demorado; 2. utilizam sondas radioativas, as quais apresentam riscos à saúde e no descarte; 3. necessidade de grande quantidade de amostra; 4. necessidade de DNA não degradado e com alto peso molecular; 5. necessita utilizar géis de separação. Por estes motivos, tal técnica ainda apresentava vários empecilhos que dificultavam sua aplicação constante em casos forenses. Em 1983, Kary Mullis desenvolveu a técnica conhecida como PCR (Polymerase Chain Reaction - Reação em Cadeia da Polimerase), que revolucionou a biologia molecular, incluindo a análise de DNA forense. Através da PCR, a análise de DNA forense tornou-se essencialmente mais rápida e sensível. Problemas anteriormente citados, como o tempo de análise, a utilização de materiais radioativos, a grande quantidade de amostra, a presença de DNA não degradado de alto peso molecular e a necessidade de lidar com variações de tamanho foram todos resolvidos pelas várias técnicas de PCR. Figura: Dr Kary Mullis recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1993 pela invenção da técnica de PCR. Um dos primeiros testes PCR foi baseado na identificação do antígeno leucocitário humano (HLA), cujos marcadores são proteínas de sequencia conhecida e a codificação para cada antígeno pode ser identificada, tendo sido desenvolvido um teste simples para um dos loci do HLA, chamado DQ-Alpha. Este apresenta quatro principais alelos, os quais têm subtipos, contudo, alguns alelos não conseguiam ser bem distinguidos. O teste foi aprimorado para incorporar outros loci concomitantemente com o DQ-Alpha, chamado Polymarker, o que tornou o teste mais sensível e simples, mas mesmo assim não apresentava o poder de discriminação do RFLP. Figura: Como é realizada a técnica de PCR. A próxima fase no desenvolvimento do DNA para uso na ciência forense retornou ao conceito de VNTRs. Algumas regiões VNTR são relativamente curtas e podem ser amplificadas por PCR. Algumas vezes denominadas AmpFLPs (Amplified Fragment Polymorphisms – Polimorfismos de Fragmentos Amplificados). AmpFLPs não tiveram o poder de discriminação de RFLP ou a simplicidade de DQ-Alpha / Polymarker e não foram amplamente utilizados. Mais tarde, na década de 1990, análises de STR (Short Tandem Repeat – Repetições Curtas em Tandem) surgiram nos exames de DNA forense. De acordo com o nome, os STRs são regiões semelhantes ao VNTR que possuem sequências muito curtas, variando aproximadamente 2 a 6 pares de bases (pb). Embora as regiões STR individuais não sejam tão discriminatórios quanto os marcadores RFLP, o tamanho curto e o número de STRs disponíveis permitiram aos cientistas amplificar e analisar várias regiões STR simultaneamente (análise multiplex). Figura: O uso do STR na individualização de pessoas. OBTENÇÃO DO PERFIL GENÉTICO Em genética forense, o exame que visa à identificação genética é baseado na análise de regiões não-codificantes do DNA, sendo assim, não permite a determinação de características físicas ou comportamentais individuais, exceto gênero sexual. A análise de STR é o método de escolha atual para os exames de DNA em laboratórios forenses e produz resultados que são praticamente equivalentes à individualização. As chaves para o sucesso da genotipagem por STR são a análise simultânea de várias regiões e a capacidade de marcar nucleotídeos com substâncias fluorescentes. Os marcadores genéticos são altamente polimórficos (variam bastante de indivíduo para indivíduo), conferindo grande poder de discriminação, o que os torna ideais na individualização humana. Desta forma, o perfil genético de um indivíduo corresponde às informações obtidas (alelos) em cada um dos marcadores analisados. Atualmente, a análise de DNA forense usa a seguinte sequência de etapas: Figura: Etapas da análise de uma amostra biológica em um laboratório de genética forense: da amostragem à separação dos fragmentos amplificados de DNA. Figura: Etapas da análise de uma amostra biológica em um laboratório de genética forense: análise e interpretação utilizando bancos de dados de perfis genéticos. Como são expressos os resultados do exame de DNA forense? Quem já leu um laudo de genética forense deve ter percebido que os resultados são expressos de duas formas: • Numericamente: expresso em Razão de Verossimilhança (LR ou Likelihood Rate), com base em duas hipóteses; • Textualmente: utiliza-se uma escala verbal, que traduz o resultado de acordo com o valor de LR obtido. Daí pode surgir a pergunta: Mas por que não se responde apenas que sim ou que não? Isso não é possível pois os resultados genéticos são expressos com base em cálculos bioestatísticos que se utilizam de dados de genética populacional. As tecnologias e os insumos de genética forense têm avançado muito nos últimos anos. No início do uso dos perfis genéticos como forma de identificação, algumas poucas regiões do DNA eram analisadas, o que gerava uma certa limitação em seu uso. Atualmente a maioria dos kits analisam mais de vinte regiões do DNA simultaneamente (multiplex), o que aumenta a confiabilidade da técnica e, consequentemente, o valor estatístico do resultado obtido. Isto é estudado em pesquisas de frequência populacional. No Brasil, existem algumas tabelas de frequência alélica publicadas para a nossa população, e que são utilizadas nos cálculos bioestatísticos que subsidiarão os resultados dos exames genéticos.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1FRANÇA, GENIVAL VELOSO. Medicina Legal, 6ª ed, Editora Guanabara Koogan, 2001. 2INTERPOL. Disaster Victim Identification Guide (Proposed Amendments: March, 2014), (2014). Disponível em https://www.interpol.int/How-we- work/Forensics/Disaster-Victim-Identification-DVI 3PICOLI, F. F., ALVES, A. M.; MUNDIM, M. B. V.; MENDES, S. D. S. C.; SILVA, R. F. A Fragilidade da Análise Facial como Único Método de Identificação Humana. Brazilian Journal of Forensic Sciences, Medical Law and Bioethics 3(4):281-302 (2014). 4DECANINE, D. O papel de marcadores moleculares na genética forense. Rev. Bras. Crimin. 5(2), 18-27, 2016 5 LODISH H, BERK A, ZIPURSKY SL, MATSUDAIRA P, BALTIMORE D, DARNELL J. Análise genética em biologia molecular. In: Nader HB, editor. Biologia celular e molecular. Rio de Janeiro: Revinter; 2002. p.255-93. 6 BUTLER. Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology. Elsevier 2012. https://www.interpol.int/How-we-work/Forensics/Disaster-Victim-Identification-DVI https://www.interpol.int/How-we-work/Forensics/Disaster-Victim-Identification-DVI
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