Ensaio imunoenzimático e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima - Journal of Investigative Dermatology

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31/01/2023 08:42 Ensaio imunoenzimático e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima - Journal of Investigative Dermatology
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Introdução
O imunoensaio enzimático (EIA) e o ensaio imunoenzimático (ELISA) são amplamente utilizados como ferramentas de diagnóstico na medicina e
como medidas de controle de qualidade em várias indústrias; eles também são usados como ferramentas analíticas em pesquisas biomédicas
para a detecção e quantificação de antígenos ou anticorpos específicos em uma determinada amostra. Esses dois procedimentos compartilham
princípios básicos semelhantes e são derivados do radioimunoensaio (RIA). A RIA foi descrita pela primeira vez por Berson e Yalow (Yalow e
Person, 1960), pelo qual Yalow recebeu o Prêmio Nobel em 1977, para medir a insulina plasmática endógena. A RIA foi então desenvolvida em
uma nova técnica para detectar e medir moléculas biológicas presentes em quantidades muito pequenas, abrindo caminho para a análise e
detecção de inúmeras outras moléculas biológicas, incluindo hormônios, peptídeos e proteínas. Devido à preocupação de segurança em relação
ao uso de radioatividade, os ensaios RIA foram modificados pela substituição do radioisótopo por uma enzima, criando assim os modernos EIA e
ELISA.
Princípios gerais
O EIA/ELISA usa o conceito básico de imunologia de ligação de um antígeno a seu anticorpo específico, o que permite a detecção de quantidades
muito pequenas de antígenos, como proteínas, peptídeos, hormônios ou anticorpos em uma amostra de fluido. EIA e ELISA utilizam antígenos e
anticorpos marcados com enzimas para detectar as moléculas biológicas, sendo as enzimas mais comumente usadas a fosfatase alcalina (EC
3.1.3.1) e glicose oxidase (EC 1.1.3.4). O antígeno na fase fluida é imobilizado, geralmente em placas de microtitulação de 96 poços. O antígeno
pode se ligar a um anticorpo específico, que é posteriormente detectado por um anticorpo secundário acoplado a uma enzima. Um substrato
cromogênico para a enzima produz uma mudança de cor visível ou fluorescência, indicando a presença do antígeno. Medidas quantitativas ou
qualitativas podem ser avaliadas com base nessa leitura colorimétrica. Os substratos fluorogênicos têm maior sensibilidade e podem medir com
precisão os níveis de concentração de antígeno na amostra. O procedimento geral para ELISA é descrito emFigura 1 .
Figura 1 Técnica de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) usada para detectar um antígeno em uma determinada amostra. O antígeno (em fase líquida) é
adicionado aos poços, onde adere às paredes. O anticorpo primário se liga especificamente ao antígeno. É adicionado um anticorpo secundário ligado a enzima que reage com um
cromógeno, produzindo uma mudança de cor para detectar quantitativa ou qualitativamente o antígeno.
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Ensaio imunoenzimático e ensaio imunoenzimático
Stephanie D. Gan   •Kruti R. Patel Arquivo Aberto • DOI: https://doi.org/10.1038/jid.2013.287
TÉCNICAS DE PESQUISA SIMPLIFICADAS | VOLUME 133, EDIÇÃO 9, P1-3,SETEMBRO DE 2013
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Vários tipos de ELISAs foram empregados com modificações nas etapas básicas descritas na Figura 1. A etapa chave no ensaio ELISA é a
detecção direta ou indireta do antígeno, aderindo ou imobilizando o antígeno ou o anticorpo de captura específico do antígeno, respectivamente,
diretamente na superfície do poço. Para medições sensíveis e robustas, o antígeno pode ser especificamente selecionado de uma amostra de
antígenos mistos por meio de um anticorpo de “captura”. O antígeno é assim “sanduichado” entre tal anticorpo de captura e um anticorpo de
detecção. Se o antígeno a ser medido for pequeno em tamanho ou tiver apenas um epítopo para a ligação do anticorpo, um método competitivo é
usado no qual o antígeno é marcado e compete pela formação do complexo antígeno-anticorpo não marcado ou o anticorpo é marcado e compete
pela antígeno ligado e antígeno na amostra. Cada uma dessas técnicas modificadas de ELISA pode ser usada para fins qualitativos e
quantitativos.
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Tipos de ELISA
ELISA indireto
Uma amostra que deve ser analisada para um antígeno específico é aderida aos poços de uma placa de microtitulação, seguida de uma solução
de proteína não reativa, como albumina sérica bovina, para bloquear quaisquer áreas dos poços não revestidas com o antígeno. O anticorpo
primário, que se liga especificamente ao antígeno, é então adicionado, seguido por um anticorpo secundário conjugado com enzima. Um substrato
para a enzima é introduzido para quantificar o anticorpo primário por meio de uma mudança de cor. A concentração de anticorpo primário presente
no soro está diretamente correlacionada com a intensidade da cor. Uma aplicação do método ELISA indireto é demonstrada porHaapakoski et al.,
2013, que investigaram o papel da ativação do receptor Toll-like durante a sensibilização cutânea a alérgenos usando ovalbumina (OVA) na
modulação da asma alérgica. Em um experimento, a exposição dérmica a ligantes de receptores semelhantes a Toll (lipopolissacarídeo, Pam 
Cys, P(I:C)) demonstrou diminuir a regulação de anticorpos IgE específicos de OVA no soro, conforme medido pela técnica indireta de ELISA (
Figura 2 ).
Figura 2 Ensaio imunoenzimático indireto (ELISA). A exposição dérmica a ligantes de receptores semelhantes a Toll (lipopolissacarídeo, Pam Cys, P(I:C)) demonstrou
diminuir a regulação de anticorpos IgE específicos de ovalbumina no soro, conforme medido pela técnica indireta de ELISA.
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Reimpresso de Haapakoski et al. (2013).
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A principal desvantagem do ELISA indireto é que o método de imobilização do antígeno não é específico. Quando o soro é usado como antígeno
de teste, todas as proteínas da amostra podem aderir aos poços de uma placa de microtitulação. Essa limitação, no entanto, pode ser superada
usando um anticorpo de captura exclusivo para o antígeno de teste específico para selecioná-lo do soro, conforme ilustrado na técnica de
sanduíche abaixo.
Sanduíche ELISA
A técnica de sanduíche é usada para identificar um antígeno de amostra específico. A superfície do poço é preparada com uma quantidade
conhecida de anticorpo ligado para capturar o antígeno desejado. Depois que os sítios de ligação inespecíficos são bloqueados com albumina de
soro bovino, a amostra contendo o antígeno é aplicada à placa. Um anticorpo primário específico é então adicionado para “sanduíches” do
antígeno. São aplicados anticorpos secundários ligados a enzimas que se ligam ao anticorpo primário.Os conjugados anticorpo-enzima não
ligados são lavados. O substrato é adicionado e é enzimaticamente convertido em uma cor que pode ser posteriormente quantificada.Canady e
outros, 2013analisaram soros de pacientes usando o método sanduíche para detectar níveis aumentados de fator de crescimento de
queratinócitos (KGF) nos soros de pacientes com queloide e esclerodermia em comparação com controles saudáveis para quantificar o KGF
humano ( Figura 3 ).
Figura 3 Ensaio de imunoabsorção enzimática sanduíche (ELISA). O método “sanduíche” foi usado para detectar níveis aumentados de fator de crescimento de
queratinócitos (KGF) no soro de pacientes com queloide e esclerodermia em comparação com controles saudáveis para quantificar o KGF humano.
Reimpresso de Canady et al. (2013).
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Uma vantagem de usar um anticorpo específico purificado para capturar o antígeno é que ele elimina a necessidade de purificar o antígeno de
uma mistura de outros antígenos, simplificando assim o ensaio e aumentando sua especificidade e sensibilidade.
ELISA competitivo
O evento chave do ELISA competitivo é o processo de reação competitiva entre o antígeno da amostra e o antígeno ligado aos poços de uma
placa de microtitulação com o anticorpo primário. Primeiro, o anticorpo primário é incubado com o antígeno da amostra e os complexos anticorpo-
antígeno resultantes são adicionados aos poços que foram revestidos com o mesmo antígeno. Após um período de incubação, qualquer anticorpo
não ligado é lavado. Quanto mais antígeno houver na amostra, mais anticorpo primário será ligado ao antígeno da amostra. Portanto, haverá uma
quantidade menor de anticorpo primário disponível para se ligar ao antígeno revestido no poço. O anticorpo secundário conjugado a uma enzima
é adicionado, seguido por um substrato para induzir um sinal cromogênico ou fluorescente. A ausência de cor indica a presença de antígeno na
amostra.
A principal vantagem do ELISA de competição é sua alta sensibilidade a diferenças de composição em misturas complexas de antígenos, mesmo
quando o anticorpo de detecção específico está presente em quantidades relativamente pequenas.Dobrovolskaia et al., 2006). Este método pode
ser usado para determinar a potência de extratos de alérgenos padronizados nos EUA (Dobrovolskaia et al., 2006) e para medir os anticorpos
totais para o polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b em soros humanos de indivíduos vacinados (Mariani e outros, 1998). O
ELISA competitivo é freqüentemente usado para detectar anticorpos de HIV no soro de pacientes. O antígeno do HIV é revestido na superfície dos
poços da placa de microtitulação, e são aplicados dois anticorpos específicos: um conjugado com enzima e outro do soro do paciente. A
competição cumulativa ocorre entre os dois anticorpos pelo mesmo antígeno. Se os anticorpos estiverem presentes no soro, ocorre a reação
antígeno-anticorpo, deixando para trás quantidades muito baixas de antígeno disponíveis para ligação com o anticorpo marcado com enzima. A
maioria dos anticorpos marcados com enzimas não ligados são lavados, produzindo mínima ou nenhuma mudança de cor. A ausência de cor é
indicativa de uma amostra HIV positiva.
ELISA múltiplo e portátil
O ELISA múltiplo e portátil é uma nova técnica que utiliza um dispositivo multicatcher com 8 ou 12 pinos salientes imunossorventes em um bastão
central que pode ser imerso em uma amostra coletada. As lavagens e a incubação com antígenos conjugados com enzimas e cromogênios são
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realizadas mergulhando os pinos em micropoços pré-preenchidos com reagentes. A principal vantagem desses kits de laboratório prontos para
uso é que eles são relativamente baratos, podem ser usados para triagem de grandes populações e não requerem pessoal qualificado ou
equipamento de laboratório, tornando-os uma ferramenta ideal para configurações de poucos recursos (Balsam et al., 2013). As aplicações
clínicas incluem detecção no local de atendimento de doenças infecciosas, toxinas bacterianas, marcadores oncológicos e triagem de drogas.
Resumo
O EIA/ELISA é um método poderoso não apenas para pesquisa biomédica geral, mas também como uma ferramenta de diagnóstico. Permite a
detecção de todos os tipos de moléculas biológicas em concentrações e quantidades muito baixas. Embora tenha suas limitações, o EIA/ELISA
continua sendo uma ferramenta importante tanto na pesquisa clínica e básica quanto no diagnóstico clínico.
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Investigação abrangente sobre o papel da enzima conjugadora de ubiquitina E2S no desenvolvimento do melanoma
Wang et ai.
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Reimpresso de Haapakoski et al. (2013).
Figura 3 Ensaio de imunoabsorção en…
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089 A regulação positiva da enzima da via do mevalonato HMGCS1 em queratinócitos contribui para a psoríase ao promover a expressão de IL-23
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