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CONCEITOS DE BIOLOGIA MOLECULAR Jorge Mondego Biologia Molecular The “OME”-Era Genome Transcriptome The “OME”-Era Proteome Metabolome - Entendimento da fisiologia e reprodução de microorganismos - Entendimento dos mecanismos de replicação, transcrição e tradução - Enzimas de restrição - Plasmídeos - Purificação de proteínas e Enzimologia - Polymerase Chain Reaction (PCR) - Transcriptase reversa e RT-PCR - Sequenciamento - Fluoróforos - Automação Cromossomo bacteriano Plasmídeos Plasmídeos DNA extracromossômico capaz de se replicar independe ntemente da replicação cromossomal - Resistência a antibióticos - Produção de toxinas - Conjugação (transmissão de material genético entre as bactérias) - Origem de replicação própria Conjugação Transmissão de material genético entre as bactérias Transferência horizontal de genes Transferência de material genético entre reinos Agrobacterium tumefaciens Transformação Competência – Habilidade de uma célula receber DNA extracelular vindo do meio ambiente. -Natural: Bactérias adquirem DNA do meio para nutrição, reprodução e reparo de seu DNA, através de reparo de seu DNA, através de mecanismo de transporte membranar. - Artificial: Uso de procedimentos de laboratório que tornam as células passíveis de serem transformadas. Transdução Fagos – vírus que infectam bactérias Daniel Nathans, Werner Arber, Hamilton Smith - 1978 Enzimas de restrição (endonucleases) Sistema de modificação - restrição - Enzimas bacterianas que reconhecem e clivam DNA in vasor - Reconhecimento de seqüência palindrômica de DNA exó geno - Seqüências bacterianas equivalentes são metiladas 5'-GTATAC-3' |||||| 3'-CATATG-5'Seqüência palindrômica - Seqüências bacterianas equivalentes são metiladas Pontas coesivas Pontas “cegas”Pontas coesivas Cohesive ends Pontas “cegas” Blunt ends Manipulação dos plasmídeos e a tecnologia do DNA recombinante Sítio de Resistência a antibióticos Origem de replicação clonagem -Plasmídeo é digerido com enzimas -Gene específico é ligado no plasmídeo, replicado em diversas cópias “Clonagem” em vetores Transformação Choque térmico Choque osmótico Shuttle vectors Plasmídeos que se propagam em duas espécies -Transformação de plantas, leveduras, fungos filamen tosos e células animais Bacteriófagos Fagos como vetor Vetores Tamanho do inserto Plasmídeos de alta cópia 0–10 kb Bacteriófago λ (inserção) 0–10 kb Bacteriophage λ (substituição) 9–23 kb Cosmídeos 30–44 kb Bacteriófago P1 70–100 kb BAC (cromossomos artificiais de bactérias) até 300 k b YAC (cromossomos artificiais de leveduras) 0.2–2.0 M b PCR - A REVOLUÇÃO DA TAQ Kari Mullis – 1985 Premio Nobel de química -1993 PCR 1 95°°°°C Tm 72°°°°C PCR 2 n Ciclos de PCR - Concentração dos reagentes Tris-HCl pH 8,8 (20 mM) KCl (10-50 mM) MgCl 2 (1 a 4 mM) – Menos Mg – mais especificidade Glicerol (menos que 5%) dNTPs (200 a 10 µM – Menos dNTP - mais especificidade) Taq (1 unidade) PCR – Otimização da reação Taq (1 unidade) -Condições dos ciclos Etapa de denaturação inicial (1-3 min a 95°C) Etapa de denaturação (30 seg a 2 min a 95°C) Etapa de anelamento Etapa de extensão (30 seg a 1min e 30 seg a 70-75°C) - Desenhos dos primers Características desejáveis em um Primer ● Temperatura de melting (Tm) na faixa de 50 ºC a 65 ºC. ● Tamanho de 15 a 28 pares de bases ● Ausência da capacidade de dimerização. ● Ausência significativa da formação de grampos (>3 bp) ● Inexistência de sítios secundários de anelamento dos primers. ● Temperaturas de anelamento de primers formando um par devem ser próximas Comprimento - Quanto maior o comprimento do primer, maior a possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma que maiores serão as temperaturas de melting e anelamento. - De uma forma geral, o comprimento do primer não deve ser inferior a 15 bases para assegurar a unicidade. inferior a 15 bases para assegurar a unicidade. - A existência desta faixa está baseada no fato de se buscar unique primers que apresentem temperatura de anelamento dentro da faixa considerada como a mais adequada. Temperatura de Melting (TM) - É a temperatura na qual metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metade na forma de dupla hélice. - Tm é dependente da composição do DNA, de modo que aumento do conteúdo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo maior número de ligações de H.ligações de H. Temperatura de Anelamento – É a temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm . T anneal = Tm_primer – 4°C Estringência no Anelamento do Primer - A estringência determina a especificidade no produto de DNA a ser amplificado. - T anneal é o fator mais significante que afeta a estringência no anelamento do primer. -T anneal : Muito baixa = menor estringência = primer pareia em qualquer lugar. muito alta = maior estringência = primer pode não parear. Estrutura interna do primer - Evitar essas estruturas... ..Pode-se utilizar primers com estas estruturas se estas forem formadas a uma temperatura em torno de 30°C menor que a Tm Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) atgatagaggctctcgaag ctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaa ·M··I··E··A··L··E··A··E··V··T··R··R··T··L··E··F··D· ·T··C··K· gtcgt cgctctcccaatggtataa ·V··V··A··L··P··M··V··*· 5´- atgatagaggctctcgaag – 3´ 5´- ttataccattgggagagcg – 3 ´ 5´- atgatagaggctctcgaag ctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaagtcgtcgctc tcccaatg 3´- tactatctccgagagcttcgactccactggtcctcttgcgagctcaaa ctgtgcacatttcagcagcgagagggttac gtataa – 3´ catatt – 5´ RNA DNA TRANSCRIPTASE REVERSA e A QUEBRA DO PARADIGMA RNA Proteína Quebra do paradigma RT “REVOLUTION” PRIMERS UTILIZADOS Oligo(dT)15-25 -“Somente mRNA” Hexâmeros randômicosHexâmeros randômicos - Anelamento em regiões aleatórias Primer específico do gene - Amplificação somente do gene alvo Bibliotecas Expressed Sequence Tags (ESTs) Extrair RNA de diferentes tecidos/condições cDNA Bibliotecas 3’ EST5’ EST Clonar em vetor Full-Lenght cDNA Controle Tratado Extração de RNA e síntese de cDNA Northern Eletrônico sequenciamento sequenciamento clusterização Sequência consenso controle tratado = 2x Adaptors Driver Driver and Tester Driver Tester 1-cDNA synthesis 2-cDNA digestion with 4 cutter enzyme 3-Adaptor ligation to tester sample Control Treated RNA Pools Biblioteca subtrativa Driver Driver and Tester Tester No amplificated Exponential Amplification Linear Amplification EliminatedEliminated Enriched Tester 4-Tester/ driver hybridization 5-PCR with primers that anneal specifically to adaptor previously ligated to tester sample 6-Enrichment of cDNA library in genes preferentially expressed in tester sample Fluoróforos e “molecular beacons” Cianinas Emissão fluorescente - 570 nm (região do verde do espectro de luz) Emissão fluorescente - 670 nm Emissão fluorescente - 670 nm (região do verde do espectro de luz) SYBR GREEN Emissão fluorescente - 522 nm (região do verde do espectro de luz) “molecular beacons” Loop – complementar a seqüência alvo Análise Qualitativa Visa detectar a presença ou não do gene Análise Quantitativa Visa detectar a quantidade (expressão) do gene na amostra PCR – Quantidade X Qualidade amostra Difícil diferenciar 10 cópias de 50 cópias em gel de agarose Detecção do PCR tradicional Detecção do Real Time PCR SYBR green assay SYBR se liga a DNA dupla fita e fluoresce. Durante o processo de amplificação, a fluorescência vai aumentando, tornando mais fácil aumentando, tornando mais fácil a quantificação de DNA Taq Man® Sonda anela no gene alvo Polimerase desloca repórter liberação de fluorescência verde Polimerase desloca quencher www.appliedbiosystems.com TTGTTCGAAGACTGGAAaCAACAGGTCGTCAGGCAGCAT AACGAGTACAGGGCCCGTTATGGTGCACCCAACCTGTCC TGGAGCGATGCTCTGTACCCGGATACTGCTCGATATGCC GGACAGTGCAA GTTCcAACACAGGTATGACACGTCGTTGGTTCGTCGACATGTA AGGGTACTGACGACACATTCAAAG Desenho de primers real time Junção éxon - íntron GTTCGTCGACATGTA AGGGTACTGACGACACATTCAAAG CAACAGTGGCGGCAAGTACGGCGAAAACTTGGCTGCTG GTACTGGAAACGCCTATGGTTTCTCGAGCGGCTTGAAGT CGTGGATGGATGAAGCTTGTATGTCTAC http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/primer_gensc ript.cgi Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb (shotgun) DNA genômico reads Clonagem de genomas clonar em vetor sequenciamento reads Sequência consenso (DNA original) Reconstrução do DNA original a partir do fragmentos (clusterização) A reconstrução é feita a partir de sobreposição dos fragmentos Quebrar em pedaços Quebrar em pedaços Quebrar em pedaços Quebrar em pedaços aleatoriamente desde aleatoriamente desde aleatoriamente desde aleatoriamente desde 50Kpb até 300Kpb50Kpb até 300Kpb50Kpb até 300Kpb50Kpb até 300Kpb DNA genômicoDNA genômicoDNA genômicoDNA genômico Clonar em BAC’s e Shotgun de pedaços do genoma ~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaços de 2000pb Clonar em BAC’s e sequenciar apenas as pontas de cada fragmento clonar em vetor e sequenciar os fragmentos Primer Walking Clone to sequenceVector Primer Sequence New Primer Sequence Repeat Sempre desenhar o primer de forma que a sequência amplificada tenha sobreposição com a anterior (tipicamente 100 pb de sobreposição) anelamento dos primers denaturação TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC 0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ... O programa PHRED lê o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequência : - A identificação dos picos é feita através de uma transformada de fourier do sinal - A nota é ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a altura do background Região de qualidade alta Analisando o cromatograma • Picos bem definidos e grandes. • Linha de base boa. • Distância entre picos anterior e posterior constante. Região de qualidade média – poucas ambigüidades • Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio. • Linha de base boa a razoável. • Distância entre picos anterior e posterior razoável. Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade • Picos mal definidos e de tamanho pequeno. • Linha de base confusa. • Distância entre picos anterior e posterior inconstante. http://www.454.com/ Pirosequenciamento Roche (454) GS FLX sequencer Fita simples Câmera de CCD Reação de degradação Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb (shotgun) DNA genômico Shotgun do genoma inteiro Ligação do adaptador e separação em fita simples - O adaptador permite que o DNA se ligue em grânulos minúsculos (diâmetro de 28 mm). Apenas um DNA é ligado em cada grânulo - Os grânulos são envolvidos em gotas de óleo que contêm todos os reagentes necessários para amplificar o DNA - Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada para- Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada para evitar contaminação e consegue produzir 10 milhões de cópias numa reação de pirosequenciamento - Um pmol de DNA numa reação de pirosequenciamento produz 1011 moléculas de ATP gerando mais de 109 fótons, num comprimento de onda de 560 nm, e num período de 3-4 segundos. Facilmente detectado por uma câmera de CCD O sequenciador 454 Câmera de CCD Bombeamento de fluídos Câmara de fluxo contendo as amostras e as fibras ópticas (1,6 milhões/slide) Computador Pirograma Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt Illumina/Solexa Genome Analyzer Sequenciamento por síntese + clustering PCR http://www.illumina.com/ - O adaptador permite que o DNA se ligue a uma placa na superfície dos canais de fluxo - PCR em fase sólida permite que as moléculas resultantes de uma PCR fiquem próximas. Ciclo é repetido várias vezes - Adição de polimerase, primers e de nucleotídeos,- Adição de polimerase, primers e de nucleotídeos, marcados por fluoróforos, com o 3’OH inativado – adição de um nucleotídeo por vez. Após incorporação, há a detecção do fluoróforo, reverte-se a inativação do 3’OH e e retira-se o fluoróforo. Ciclo se repete. Applied Biosystems SOLiD TM Sequencer http://www.appliedbiosystems.com.br/site/abhome.jsp - O adaptador ligado ao DNA e a grânulos magnéticos. Ocorre PCR em emulsão e as fitas de DNA são depositadas numa placa - Ligação de primer universal n ao adaptador e de óligos degenerados (7 bases) marcados contendo duas primeiras bases fixas. - Ocorre detecção do sinal, clivagem das duas últimas bases e adição de novos óligos - Ao fim de n rounds, a fita resultante é liberada e há a ligação de um novo primer universal, (agora n-1). Ciclo se repete mais três vezes (até n-4). SANGER Novas tecnologias • Depende de clonagem em bactéria (2 semanas de trabalho) • Não há clonagem • Reads de ~700 bp • Reads de 200 a 25 pb • Clones de fita dupla Sanger vs Novas tecnologias • Milhões de bp em menos de 4 horas • 1 milhão de pb em 24 horas • Clones de fita dupla permitem seqüenciamento em ambas direções (facilita orientação e montagem) • Fragmentos fita simples não permitem seqüenciamento em ambas direções. Aplicação da técnica de paired-end • 6 meses de sequenciamento, 24 horas por dia, para sequenciar o genoma de um fungo • 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo Conclusão : a união faz a força 454 Solexa SoliD Sequencing chemistry Pyrosequencing Polymerase-based sequencing- by-synthesis Ligation-based sequencing Amplification approach Emulsion PCR Bridge amplification Emulsion PCR Paired ends/separation Yes/3 kb Yes/200 bp Yes/3 kb Novas Tecnologias ends/separation Yes/3 kb Yes/200 bp Yes/3 kb Mb/run 100 Mb 1300 Mb 3000 Mb Time/run (paired ends) 7 h 4 days 5 days Read length 250 bp 32–40 bp 35 bp Cost per run (total direct a) $8439 $8950 $17 447 Cost per Mb $84.39 $5.97 $5.81
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