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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV 
Laboratório de Sistemática Vegetal (LSV) - DBAA 
Herbarium JABOTI (JABU) 
 
PROTOCOLOS 
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PROTOCOLO 011 
 
 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 
 
 
PCR básica 
Proc.: Sambrook & Russell (2001) 
Data: 21/02/2014 
 
Antes de começar a trabalhar é importante limpar bem a bancada e procurar gelo para 
manter os reagentes frios. A DNA polimerase deve se manter a -20 °C até o momento 
de adicionar na reação. 
Usar tubos de 0,5 mL estéreis e novos. Para se realizar várias reações com a mesma 
composição (exceto pelo DNA), fazer a solução de reação num tubo de 1,5 mL, 
empregando X vezes o número de reações mais 10% do volume total. Depois de fazer a 
mistura, aliquotar em tubos de 0,5 mL previamente rotulados. Depois, adicionar o DNA, 
e levar ao termociclador. 
A reação de PCR básica é de volume total de 25 µL, mas pode se ajustar a um volume 
maior ou menor, segundo a necessidade (preferencialmente entre 10-50 µL). A reação 
de 25 µL deve conter os seguintes reagentes: 
 
Reagente Volume FINAL 
Buffer de amplificação 10X 2,5 µL 
dNTPs 20 mM 0,5 µL (200-250 µM) 
Primer foward 20 mM 1,25 µL (0,1-0,5 µM) 
Primer reverse 20 mM 1,25 µL 
DNA polimerase 1-5 U 0,5 µL (0,5-1U/25 µL) 
Agua 18 µL (Completar o volume) 
DNA templado 10ng/µL 1 µL (1-100 ng/µL) 
Total 25 µL 
 
 
Concentrações padrão na reação de PCR. 
 
Mg2+ KCl dNTPs Primers DNA polimerase DNA template 
1,5 mM 50 mM 200 µM 1 µM 1-5 U 1 pg – 1 µg 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV 
Laboratório de Sistemática Vegetal (LSV) - DBAA 
Herbarium JABOTI (JABU) 
 
PROTOCOLOS 
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Reação de PCR para amplificação de marcadores cloroplasticos e nucleares 
 
Proc.: LSVP (Miranda, Menezes & Silva) 
Data: 21/02/2014 
 
Reagente Volume 
Buffer de amplificação 10X 2,5 µL 
dNTPs 100 mM 0,2-0,4 µL 
Primer foward 0,6-10µM 2 ou 1,5µL 
Primer reverse 0,6-10µM 2 ou 1,5µL 
DNA polimerase 5 U 0,2-0,5 µL 
Água Completar para 25µL 
DNA template 1-100ng/µL 2 µL 
Total 25 µL 
 
Para amplificar ITS e evitar bandas inespecíficas testar adicionando DMSO (2-10%) 
e/ou BSA (1%). (para detalhes ver Miranda et al., 2010) 
 
 
Perfil térmico (programa de PCR) 
 
Proc.: Sambrook & Russell (2001) 
Data: 21/02/2014 
 
O programa de PCR empregado no termociclador devera se ajustar as caraterísticas da 
sequência alvo; ou seja, dos possíveis amplicons e dos primers. Então, deve possuir 
temperaturas e tempos para realizar a desnaturação de DNA, anelamento e extensão em 
repetidos ciclos que podem variar entre 25 e 35 ciclos. 
A temperatura de desnaturação padrão é 94 °C, num tempo de 30 seg (temperaturas 
superiores e/ou tempos mais longos podem comprometer a DNA Taq polimerase). 
A temperatura do anelamento depende do Tm dos primers, empregando uma 
temperatura média entre o foward e o reverse ± 5 °C; e o tempo padrão empregado é 30 
segundos, mas se pode estender a 45 seg. 
A extensão ou polimerização se faz a 72 °C e o tempo depende do tamanho do 
amplificado, calculando 30 seg por cada 500 pb (a velocidade média de polimerização 
do DNA é 1Kpb/min). Depois de finalizar os ciclos, se inclui uma extensão final a 72 
°C por 5 ou 10 min. Além disso, quando se realiza a PCR se programa um passo 
adicional a 4°C por tempo indefinido para se manterem conservadas as amostras antes 
de serem retiradas do aparelho. 
Finalmente, a amplificação se verifica em gel de agarose (entre 0,7 e 1,5% dependendo 
do tamanho de produto de PCR). 
 
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Laboratório de Sistemática Vegetal (LSV) - DBAA 
Herbarium JABOTI (JABU) 
 
PROTOCOLOS 
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Observação: Aconselha-se enfaticamente o iniciante em PCRs a consultar e estudar 
(muito!) a apostila “PCR and multiplex PCR guide” disponível online em: 
http://medicine.yale.edu/labs/henegariu/www/tavi/Guide.html 
 
 
 
Referências 
 
MIRANDA, V.F.O. DE, V.G. MARTINS, A. FURLAN, AND M. BACCI JR. 2010. Plant or 
Fungal Sequences ? An Alternative Optimized PCR Protocol to Avoid ITS ( 
nrDNA ) Misamplification. Genetics and Molecular Biology 53: 141–152. 
 
SAMBROOK, J., RUSSELL, D. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (3ra 
edición) Editorial Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York.