protocolo-purificacao-090617

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS DE JABOTICABAL 
MÉT. PURIF. ANÁL. PROTEÍNAS – CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – 1
o
 SEMESTRE, 2017 
DESENVOLVIMENTO DE PROJETO 
 
 
Purificação de Proteínas Recombinantes 
 
1. Remova o pellet de células do freezer, transferindo-o para o gelo. Adicione 500 μl de Tampão de 
Extração 1 (TE1) e ressuspenda as células totalmente. 
 
2. Transfira as células ressuspendidas para um tubo Eppendorf. Adicione 500 μl de Tampão de 
Extração 2 (TE2) e misture a amostra por inversão, cuidadosamente para evitar excesso de bolhas. 
Incube por 10 min no gelo com inversões periódicas a cada 1 min. 
 
3. Centrifugue o tubo a 4°C por 3 min a 13000 rpm. Remova 50 μl do sobrenadante (que representa a 
Fração Solúvel do extrato proteico) e transfira para um novo tubo Eppendorf no gelo. 
 
4. Na bancada a sua frente, há um tubo Eppendorf com 40 μl da resina Ni-NTA. NÃO INVERTA 
ESTE TUBO OU RESSUSPENDA A RESINA. Remova o sobrenadante do tubo com a resina e 
transfira o restante da Fração Solúvel (~1 ml) para o tubo com a resina. Misture bem por inversão, 
cuidadosamente para evitar excesso de bolhas. 
 
5. Incube por 30 min no gelo com inversões periódicas a cada 5 min. Remova o sobrenadante para 
um novo tubo Eppendorf no gelo. Este será chamado de Flow Through. 
 
6. À resina no gelo, adicione 1 ml do Tampão de Lavagem (TL) e misture bem por inversão. Incube 
por 7 min no gelo com inversões periódicas a cada 1 min. Remova o sobrenadante (que representa 
a fração Wash) e transfira para um novo tubo Eppendorf no gelo. 
 
7. À resina no gelo, adicione 500 μl do Tampão de Eluição 1 (Elu1) e misture bem por inversão. 
Incube por 7 min no gelo com inversões periódicas a cada 1 min. Remova o sobrenadante (que 
representa a fração Eluato 1) e transfira para um novo tubo Eppendorf no gelo. 
 
8. À resina no gelo, adicione 500 μl do Tampão de Eluição 2 (Elu2) e misture bem por inversão. 
Incube por 7 min no gelo com inversões periódicas a cada 1 min. Remova o sobrenadante (que 
representa a fração Eluato 2) e transfira para um novo tubo Eppendorf no gelo. 
 
9. À resina no gelo, adicione 500 μl do Tampão de Eluição 3 (Elu3) e misture bem por inversão. 
Incube por 7 min no gelo com inversões periódicas a cada 1 min. Remova o sobrenadante (que 
representa a fração Eluato 3) e transfira para um novo tubo Eppendorf no gelo. 
 
10. As frações Solúvel, Flow Through, Wash, Eluato 1, Eluato 2 e Eluato 3, obtidas hoje, em 
combinação com as frações Não-Induzida e Induzida, obtidas na aula passada, serão usadas na 
próxima etapa de preparação das amostras para o SDS-PAGE. 
Constituição dos Tampões: 
Tampão de Extração 1 – 50 mM Tris HCl pH 8.0 
200 mM NaCl 
0,1 mM EDTA pH 8.0 
30 mM imidazol 
0,05% Triton X-100 
Tampão de Extração 2 – 50 mM Tris HCl pH 8.0 
500 mM NaCl 
0,1 mM EDTA pH 8.0 
30 mM imidazol 
0,5% Triton X-100 
0,1% SDS 
Tampão de Lavagem – 50 mM Tris HCl pH 8.0 
500 mM NaCl 
0,1 mM EDTA pH 8.0 
30 mM imidazol 
0,05% Triton X-100 
Tampão de Eluição 1 – 50 mM Tris HCl pH 8.0 
500 mM NaCl 
0,1 mM EDTA pH 8.0 
100 mM imidazol 
0,05% Triton X-100 
Tampão de Eluição 2 – 50 mM Tris HCl pH 8.0 
500 mM NaCl 
0,1 mM EDTA pH 8.0 
250 mM imidazol 
0,05% Triton X-100 
Tampão de Eluição 3 – 50 mM Tris HCl pH 8.0 
500 mM NaCl 
0,1 mM EDTA pH 8.0 
500 mM imidazol 
0,05% Triton X-100 
 
________________________________________________________________________________ 
Preparação das Amostras para o SDS-PAGE 
 
1. Remova os tubos com as frações Não-Induzida e Induzida do freezer, transferindo-os para o 
gelo. Adicione 50 μl de Tampão de Extração 1 e ressuspenda as células totalmente. 
 
2. Prepare 9 tubos Eppendorf novos, numerando-os de 1 a 9. Adicione 10 μl de Tampão de Laemmli 
no fundo dos tubos 2 a 9. 
 
3. Adicione 5 μl do Marcador de Peso Molecular no tubo 1 e 10 μl de cada fração aos tubos 
numerados, de acordo com a tabela abaixo: 
 
Tubo Amostra Volume (μL) Tampão de Laemmli (μL) 
1 Marcador de Peso Molecular 5 - 
2 Fração Não-Induzida 10 10 
3 Fração Induzida 10 10 
4 Fração Solúvel 10 10 
5 Fração Flow Through 10 10 
6 Fração Wash 10 10 
7 Fração Eluato 1 10 10 
8 Fração Eluato 2 10 10 
9 Fração Eluato 3 10 10 
 
4. Feche bem os tubos e armazene em freezer -20°C até a próxima aula, quando então correremos um 
gel de SDS-poliacrilamida para analisar nossa estratégia de purificação.