prática 6 - RELATÓRIO DE BIOQUIMICA

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO 
 CURSO DE GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA 
 
 
 
 
LAIANE DEVESA ARAÚJO 
 
 
 
 
 
 
AULA PRÁTICA DEMONSTRATIVA 
Curva de Calibração por Espectrofotometria 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PETROLINA 
2022 
 
 
LAIANE DEVESA ARAÚJO 
 
 
 
 
 
AULA PRÁTICA DEMONSTRATIVA 
 
Curva de Calibração por Espectrofotometria 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PETROLINA 
2022 
 
 
 
 
OBJETIVO(S): 
 
 Determinar o espectro de absorção de soluções de azul de bromofenol (ABF) e de alaranjado de metila (AM). 
 Caracterizar o comprimento de onda no qual ocorre absorção máxima. 
 Determinar o espectro de absorção de uma mistura de ABF e AM. 
 Construir uma curva padrão para cada um dos corantes nos λ determinados. 
 Encontrar uma concentração desconhecida. 
 
INTRODUÇÃO 
 
A espectrofotometria é um método utilizado para medir o quanto uma substância química absorve 
a luz, medindo a intensidade quando um feixe de luz passa através da solução da amostra. 
O princípio básico é que cada composto absorve ou transmite luz em uma certa amplitude de 
comprimento de onda. Assim, a medida também pode ser usada para medir a quantidade de uma 
substância química conhecida. 
O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração 
de compostos presentes em solução. Todo composto químico absorve, transmite ou reflete luz 
(radiação eletromagnética) em uma certa amplitude de comprimento de onda. 
Por meio da espectrofotometria é realizada a medição da intensidade da luz em comprimentos de onda, 
sendo que os componentes de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos 
ao ultravioleta, visível ou infravermelho. 
A técnica utiliza a propriedade das soluções de absorver ou transmitir a luz para quantificar reações. Na 
prática, a quantidade de luz absorvida ou transmitida é proporcional à concentração da substância em 
solução. Como uma impressão digital, saber exatamente a cor absorvida, nos permite identificar e 
quantificar materiais diferentes. 
Quanto mais concentrada for a solução, maior será a absorção de luz. Por outro lado, a cor da solução 
é determinada pela cor da luz transmitida. 
A luz é uma forma de radiação eletromagnética que possui características de onda e de partícula (fóton). 
Os diferentes elementos absorvem energia em comprimentos de onda específicos. 
A cor de uma solução está relacionada ao comprimento de onda complementar ao apresentado. 
Portanto, uma solução aparece como branca porque transmite luzes de todas as cores. Quando absorve 
 
luzes de todas as cores, a solução é preta. Finalmente, a solução é verde quando absorve luz vermelha 
e transmite luz verde (amarelo + azul), denominada de cor complementar. 
As radiações eletromagnéticas com comprimento de onda entre 380 e 780 nm são visíveis ao olho 
humano. Abaixo de 380 nm é denominada ultravioleta (UV) e acima de 780 nm correspondem à zona 
infravermelha. 
O espectrofotômetro é o equipamento utilizado para determinar os valores de transmitância (luz 
transmitida) e absorbância (luz absorvida) de uma solução em um ou mais comprimentos de onda. 
Ele mede a quantidade de fótons (a intensidade da luz) absorvida depois de passar pela amostra. A 
quantidade de uma substância química conhecida (concentração) também pode ser determinada. 
Componentes do espectrofotômetro 
Alguns componentes são comuns a todos os espectrofotômetros. A luz, fornecida por uma lâmpada, é 
fracionada pelo prisma (monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes 
monocromáticas). 
O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida em uma cubeta. Parte da luz é 
absorvida e parte é transmitida. A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector (célula 
fotelétrica) porque o sinal elétrico de saída do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre 
ele. 
O sinal elétrico é lido como uma absorbância e é proporcional à concentração da substância absorvente 
existente na cubeta. 
Princípios e aplicações 
 A espectrofotometria pode ser utilizada identificar e quantificar substâncias químicas a partir da medição 
da absorção e transmissão de luz que passa através da amostra. 
Vamos supor que você olhe para duas soluções da mesma substância, uma com maior intensidade de 
cor que a outra. O senso comum diz que o mais escuro é o mais concentrado. Assim, tal como a cor da 
solução se intensifica, sua concentração também aumenta. Esta é uma analogia com o princípio da 
espectrofotometria: a intensidade da cor é a medida da quantidade de um material em solução. 
Um segundo princípio é que cada substância absorve ou transmite certos comprimentos de onda, mas 
não outros. Por exemplo, a cor de uma folha está relacionada com comprimento de onda de luz. Cada 
cor tem um comprimento de onda diferente, então quando a luz atinge um objeto, alguns comprimentos 
de onda são absorvidos e outros refletidos de volta. A clorofila absorve luz vermelha e violeta, enquanto 
 
que transmite amarela, verde e azul. Os comprimentos de onda transmitidos e refletidos nos fazem 
perceber a cor verde. 
É esse mesmo princípio de cor e comprimento de onda em que um espectrofotômetro se baseia. Esse 
equipamento mede e compara a quantidade de luz que uma substância absorve. Dessa forma é possível 
realizar uma análise quantitativa e qualitativa, identificando e determinando a concentração das 
substâncias conforme a interação com a luz. 
Espectrofotometria é uma ferramenta importante e versátil amplamente utilizada para a análise em 
diversas áreas como química, física, biologia, bioquímica, materiais, engenharia química e aplicações 
clínicas e industriais. 
Dentre as diversas aplicações o espectrofotômetro é usado para medir determinados ingredientes em 
uma droga, medir o crescimento bacteriano, ou diagnosticar um paciente com base na quantidade de 
ácido úrico presente em sua urina. Sendo que as análises podem ser quantitativas (identificação da 
concentração da substância) e qualitativas (identificação de uma substância desconhecida), já que cada 
substância irá refletir e absorver a luz de forma diferente. 
Lei de Lambert Beer 
A lei de Beer-Lambert, também conhecida como lei de Beer ou lei de Beer-Lambert-Bouguer é uma 
relação empírica que, na Óptica, relaciona a absorção de luz com as propriedades do material 
atravessado por esta. 
Em resumo, a lei explica que há uma relação exponencial entre a transmissão de luz através de uma 
substância e a concentração da substância, assim como também entre a transmissão e a longitude do 
corpo que a luz atravessa. Se conhecemos l e α, a concentração da substância pode ser deduzida a 
partir da quantidade de luz transmitida. 
Lambert (1870) observou a relação entre a transmissão de luz e a espessura da camada do meio 
absorvente. Quando um feixe de luz monocromática, atravessava um meio transparente homogêneo, 
cada camada deste meio absorvia igual a fração de luz que atravessava, independentemente da 
intensidade da luz que incidia. A partir desta conclusão foi enunciada a seguinte lei: " A intensidade da 
luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta 
aritmeticamente ". 
Esta lei pode ser expressa pela seguinte equação: 
I = Io . 10-x1 
Onde: I = Intensidade da luz transmitida 
Io = Intensidade da luz incidente 
x = constante denominada coeficiente de absorção e que depende do meio absorvente empregado 
1 = Espessura do meio absorvente 
 
Beer em 1852 observou a relação existente entre a transmissão e a concentração do meio onde passa 
o feixe de luz. Uma certa solução absorve a luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto 
que nela encontra, isto é, " A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce 
exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumentaaritmeticamente ". 
Expressa pela equação: 
I = Io . 10-kc 
Onde: I = Intensidade da luz transmitida 
Io = Intensidade da luz incidente 
k = Constante denominada coeficiente de absorção 
c = Concentração do meio absorvente 
As leis de Lambert-Beer são o fundamento da espectrofotometria. Elas são tratadas simultaneamente, 
processo no qual a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma determinada solução depende 
da concentração do soluto e da espessura da solução. 
A lei de Lambert-Beer pode ser expressa matematicamente pela relação: T= e-a . 1 . C 
Onde: 
T= Transmitância 
e = Logaritmo Natural de Euler 
a= Constante 
1= Espessura da solução 
c = Concentração da solução (cor) 
Convertendo a equação para forma logarítmica: -lnT=a . l . c 
Utilizando-se logaritmo na base 10, o coeficiente de absorção é convertido no coeficiente de extinção K 
. 
assim: -log T=k. l . c em que: k = a/2.303 
As determinações das concentrações de compostos, o "1" (caminho óptico), são mantidas constantes e 
têm grande importância para os bioquímicos, portanto: 
 
-log T =k' . c 
em que: k'=k. l 
O -log (I/Io) foi denominado densidade óptica (DO) ou absorbância (A) ou extinção (E). Portanto, A = 
k' . c. A relação entre A e a concentração da solução é linear crescente. 
 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
 
 
 
 
 
 Solução de azul de bromofenol 10 µg 
 mL-1. 
 Solução de alaranjado de metila 10 
µg mL-1. 
 Água destilada 
 Cubeta de plástico 
 Espectrofotômetro na Região do 
Visível 
 Provetas 
 
 
Material 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Becker 
 Tubo de ensaios 
 Estante para tubos de ensaio 
 Pipeta Automática 
 Balão Volumétrico de 50 mL 
 Ponteiras 
 
 
 
 
Metodologia 
 
 
Determinação do Espectro de Absorção do ABF 
 
 
Com a solução de ABF, recém-preparada, varrer o espectro determinando as absorbâncias nos 
comprimentos de onda relacionados abaixo. Repetir a operação utilizando uma solução de ABF 
diluída duas vezes. Utilizar água como Branco, calibrando o aparelho em cada λ. 
a) Determinação do Espectro de Absorção do AM 
Com a solução de AM varrer o espectro determinando as absorbâncias nos comprimentos de 
onda relacionados abaixo. Repetir a operação utilizando uma solução de AM diluída duas vezes. 
Utilizar água como Branco, calibrando o aparelho em cada λ. Plote os dados. 
b) Determinação do Espectro de Absorção da mistura ABF + AM 
 
Misturar os volumes iguais das soluções de ABF e AM e determinar as absorbâncias nos 
comprimentos em vários λ. Plote os dados. 
c) Selecionar qual o melhor comprimento de onda (λ) de absorção de cada corante 
 
 
 
 
 
 
Construção da Curva Padrão 
 
a) Seguir o protocolo adiante utilizando soluções de ABF ou AM, conforme a equipe. 
 
b) Ler as absorbâncias de cada tubo no λ anteriormente selecionado para cada corante, 
utilizando o tubo B como branco da reação. 
c) Preparar um tubo desconhecido com quantidades arbitrárias de corante e água e efetuar 
a leitura no mesmo comprimento de onda usado. 
d) Fazer um gráfico cujas coordenadas sejam absorbância concentração de corante e analisar 
os resultados. Calcule da equação da reta e r2 
e) Lançar em gráfico as leituras de absorbância x comprimento de onda e selecionar o λ adequado 
para construção de cada curva padrão. Determinar a equação de cada reta e seu respectivo r2. 
Pode ser por métodos estatísticos ou via “software” Excel. 
f) Ler as absorbâncias de cada tubo no λ anteriormente selecionado para cada corante, 
utilizando o tubo B como branco da reação. 
g) Preparar um tubo desconhecido com quantidades arbitrárias de corante e água e efetuar 
a leitura no mesmo comprimento de onda usado. 
h) Fazer um gráfico cujas coordenadas sejam absorbância concentração de corante e 
analisar os resultados. Calcule da equação da reta e r2. 
 Lançar em gráfico as leituras de absorbância x comprimento de onda e selecionar o λ 
adequado para construção de cada curva padrão. Determinar a equação de cada reta e 
seu respectivo r2. Pode ser por métodos estatísticos ou via “software” Excel. 
 
 
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E 
DISCUSSÃO: 
 
a) Determinação do Espectro de Absorção do ABF 
 
λ (nm) 52
0 
53
5 
55
0 
58
0 
61
0 
64
0 
Abs. ABF 
0,468 0,573 0,612 1,245 0,813 0,157 
Abs. ABF 
(1:2) 
0,213 0,259 0,309 0,683 0,415 0,061 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
b) Determinação do Espectro de Absorção do AM 
 
λ (nm) 41
5 
44
5 
46
0 
49
0 
52
0 
53
5 
Abs. AM 
0,512 0,871 1,356 0,978 0,589 0,311 
Abs. AM 
(1:2) 
0,237 0,412 0,604 0,395 0,279 0,141 
 
 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
520 540 560 580 600 620 640
A
b
so
rb
ân
ci
a
λ (nm) 
Espectro de Absorção do ABF 
 
 
 
 
 
 
c) Determinação do Espectro de Absorção da mistura ABF + AM (Diluídas). 
 
Λ (nm) 415 445 460 490 520 535 550 580 610 640 
Abs. ABF + 
AM 
0,248 0,431 0,618 0,361 0,219 0,119 0,202 0,331 0,397 0,068 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
415 435 455 475 495 515 535
A
b
so
rb
ân
ci
a 
λ (nm) 
Espectro de absorção do AM 
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
400 450 500 550 600 650
A
b
so
rb
ân
ci
a
Λ
Espectro ABF + AM
 
Construção da Curva Padrão 
 
Equipe 01 
TUBO ABF 
(mL) 
H2O 
(mL) 
Abs (580 nm) [µg mL-1] 
Branco 0,0 5,0 
 0,00 
 
1 1,0 4,0 
0,112 2,00 
2 2,0 3,0 
0,312 4,00 
 
3 3,0 2,0 
0,392 6,00 
4 4,0 1,0 
0,501 8,00 
5 5,0 0,0 
0,681 10,00 
Sol. 
Desconhecida 
5 
mL 
0,561 X= 8,43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Y= 0,0664x + 0,0015 
0,561= 0,0664+ 0,0015 
0,561- 0,0015= 0,0664x 
0,56= 0,0664x 
X= 0,0664/ 0,56 
X= 8,43 µg × mL-1] 
 
 
 
 
 
 
Equipe 02 
TUBO AM 
(mL) 
H2O 
(mL) 
Abs (460 nm) [µg mL-1] 
Branco 0,0 5,0 
0,138 0,00 
1 1,0 4,0 
0,359 2,00 
2 2,0 3,0 
0, 452 4,00 
3 3,0 2,0 
0,519 6,00 
4 4,0 1,0 
0,601 8,00 
5 5,0 0,0 
0,138 10,00 
Sol. 
Desconhecida 
5 
mL 
0,323 X= 4,33 
 
 
 
 
SOLUÇÃO DESCONHECIDA: 
Y= 0,0543+ 0,088 
0,323= 0,543x+ 0,088 
0,323- 0,088= 0,0543x 
0,24= 0,0543x 
X= 0,24/ 0,0543 
X= 4,33 µg × mL- 
 
 
 
Na determinação do espectro de absorção de ABF , pode se afirmar que o comprimento de onda do 
azul de bromofenol atingiu o máximo de absorção foi nos 580 e como pode se observar, os gráficos 
ficam diferentes e isso acontece devido a diluição. 
 
 
Na determinação do espectro de absorção de AM , pode se afirmar que o comprimento de onda do 
alaranjado de metila atingiu o máximo de absorção em 460. 
 
Na determinação do espectro de absorção de ABF + AM houve dois picos entre a absorção de ABF e 
AM, sendo assim, houve oscilação entre os picos, isso acontece devido a diluição em ambas 
substâncias. 
Na curva de calibração do ABF, descobriu- se o cálculo da solução desconhecida , sendo igual à X= 
8,43 e o experimento foi aceito estatisticamente, pois obedeceu a regra em que r2. > 0,96, logo o 
resultado foi r2 = 0,9788 considerado aceito. 
Na curva de calibração do AM, descobriu- se o cálculo da solução desconhecida , sendo igual à X= 
4,33 e o experimento não foi aceito, pois não obedeceu a regra, cujo resultado foi r2= 0,9313, 
considerado não aceito, portanto se faz necessário repetir o experimento. 
 
Conclusão 
 
Portanto, observa – se com os experimentos realizados, que na curva de calibração do ABF o 
experimento foi aceito, já na curva de calibração do AM o experimento não foi aceito e precisa ser 
refeito. 
 
 
 
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
(s.d.). Fonte: kasvi: https://kasvi.com.br/espectrofotometria-principios-
aplicacoes/#:~:text=Uso%20e%20aplica%C3%A7%C3%A3o%20da%20espectrofotometria&text=Dentre%
20as%20diversas%20aplica%C3%A7%C3%B5es%20o,%C3%BArico%20presente%20em%20sua%20urina. 
 
(s.d.). Fonte: UFRGS: https://www.ufrgs.br/leo/site_espec/conceito.html 
 
kasvi. (s.d.). Fonte: https://kasvi.com.br/espectrofotometria-analise-concentracao-
solucoes/#:~:text=A%20espectrofotometria%20%C3%A9%20um%20m%C3%A9todo,amplitude%20de%2
0comprimento%20de%20onda.Atividade 
 
1o) Pesquise a fórmula estrutura do Azul de Bromofenol e descreva os grupos 
funcionais nela presentes. 
 
 
 Fenol, Álcool, Éter, Cetona, Benzeno ( Hidrocarboneto), 
 
2o) Pesquise a fórmula estrutura do Alaranjado de Metila e descreva os grupos 
funcionais nela presentes. 
 
 Amina, Cetona, Benzeno 
(hidrocarboneto). 
 
 
3o) Diga qual a faixa de pH para o Azul de Bromofenol(ponto de viragem) e também qual a cor que 
prevalece tanto em pH ácido como em pH básico. 
O azul de bromofenol atua como inidicador de pH que vira entre o pH 3,0 e 4,6 de amarelo- azul 
para violeta, respectivamente: pH ácido prevalece a cor amarela e pH básico a cor púrpura. 
 
 
 
 
 
4o) Diga qual a faixa de pH para o Alaranjado de Metila (ponto de viragem) e também qual a cor que 
prevalece tanto em pH ácido como em pH básico 
 
 
Ponto de viragem entre pH 3,1 e 4,4, pH ácido prevalece a cor vermelha e pH básico a cor amarela 
prevalece.
 
 
	UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
	CURSO DE GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
	AULA PRÁTICA DEMONSTRATIVA
	PETROLINA 2022
	AULA PRÁTICA DEMONSTRATIVA (1)
	PETROLINA 2022 (1)
	OBJETIVO(S):
	INTRODUÇÃO
	MATERIAL E MÉTODOS
	Metodologia
	Determinação do Espectro de Absorção do ABF
	Construção da Curva Padrão
	RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO:
	Construção da Curva Padrão (1)