Apostila Biotecnologia de Plantas 2022 1_NHZ1078-15

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UFABC

Carolline Lima

28/02/2023

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Biotecnologia Vegetal

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DANHZ1078-15

Biotecnologia de Plantas

APOSTILA DE LABORATÓRIO

2022.1

Responsáveis: Profa. Dra. Hana Paula Masuda
Prof. Dr. Wagner Rodrigo de Souza

ÍNDICE
CRONOGRAMA ...................................................................................................... 4
SEGURANÇA E NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO ................... 5
BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 6
CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO ............................................................................... 7
PRÁTICA 1: Cultura de tecidos vegetais: indução e isolamento de calos
embriogênicos de Setaria viridis .............................................................................. 9
PRÁTICA 2: Transformação genética de Setaria viridis ....................................... 17
PRÁTICA 3: Bioinformática .................................................................................. 27
PRÁTICA 4: Extração de DNA genômico ............................................................. 35
PRÁTICA 5: Caracterização molecular de plantas transgênicas: reação em cadeia
da polimerase (PCR) ............................................................................................... 39
PRÁTICA 6: Eletroforese em gel de agarose ......................................................... 45
PRÁTICA 7: Extração de RNA .............................................................................. 50

ÍNDICE DE ILUSTRAÇÕES

FIGURAS

Figura 1. Passo-a-passo da retirada da palha e da casca de Setaria viridis, a seta indica o lado em
que a semente deve ser colocada em contato com o meio de indução de calos (CIM). ............... 13
Figura 2. a. Calo embriogênico após 4-5 semanas em meio de indução. b. Calo embriogênico
translúcido (tecido adequado para transformação – setas). .......................................................... 15
Figura 3. Etapas de indução de calos embriogênicos e regeneração de plântulas de Setaria viridis
após transformação genética. ........................................................................................................ 26
Figura 4. Plataforma Phytozome ................................................................................................... 28
Figura 5. Busca por genes, famílias e sequências. ........................................................................ 29
Figura 6. Sequência de peptídeos .................................................................................................. 29
Figura 7. Clustal Omega para alinhamento de sequências múltiplas ............................................ 31
Figura 8. Ferramenta online Pfam ................................................................................................ 32
Figura 9. Local onde inserir a sequência de aminoácidos no Pfam .............................................. 32
Figura 10. Ferramenta online ProDom ......................................................................................... 33
Figura 11. Local onde inserir a sequência de aminoácidos no ProDom ....................................... 34
Figura 12. Demonstração esquemática da programação dos ciclos da PCR com temperatura e
tempos de desnaturação, de anelamento e de extensão. ................................................................ 43
Figura 13. Comparação entre as moléculas de RNA (fita simples) e DNA (fita dupla)............... 51
Figura 14. O dogma central da biologia........................................................................................ 51

TABELAS

Tabela 1. Meio de indução de calos .............................................................................................. 14
Tabela 2. Meio de co-inoculação CIM líquido. Obs.: Este meio NÃO tem adição de CuSO4. .... 24
Tabela 3. Meio de regeneração (MRS) ......................................................................................... 25
Tabela 4. Preparo do master mix para PCR. Obs.: Complete a tabela com a quantidade
equivalente de reagentes de acordo com o número de amostras a serem analisadas. ................... 43
Tabela 5. Limites de eficiência da separação de DNA em diferentes concentrações de agarose. 47
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file:///C:/Users/USUARIO/Downloads/NHZ1078-15_Apostila%20Biotecnologia%20de%20Plantas%202022.1_Hana%20e%20Wagner%20-%20Formatada.doc%23_Toc94801169
file:///C:/Users/USUARIO/Downloads/NHZ1078-15_Apostila%20Biotecnologia%20de%20Plantas%202022.1_Hana%20e%20Wagner%20-%20Formatada.doc%23_Toc94801170
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CRONOGRAMA

SEMANA ATIVIDADES
1 (18/02)
Apresentação da disciplina, dos critérios e das datas de avaliação e das
disposições gerais do curso experimental.
TEORIA 1*: Aplicações biotecnológicas em plantas
LABORATÓRIO: Apresentação da disciplina (presencial)
Prof. Wagner de Souza
2 (25/02)
TEORIA 2: Cultura de tecidos
PRÁTICA 1: Indução e isolamento de calos embriogênicos de S. viridis.
Prof. Wagner de Souza
3 (04/03)
TEORIA 3: Métodos de transformação genética de plantas
PRÁTICA 2: Transformação genética de S. viridis
Prof. Wagner de Souza
4 (11/03)
TEORIA 4: Prospecção de genes para melhoramento genético
PRÁTICA 3: Bioinformática
Prof. Wagner de Souza
5 (18/03)
TEORIA 5: Dogma central da biologia molecular (revisão)
PRÁTICA 4: Extração de DNA genômico
Prof. Hana Masuda
6 (25/03)
TEORIA 6: Tecnologia do DNA recombinante
PRÁTICA 5: Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Prof. Hana Masuda
7 (01/04)
TEORIA 7: Técnicas moleculares e técnicas de edição gênica
PRÁTICA 6: Eletroforese em gel de agarose e discussão de resultados
Prof. Hana Masuda
8 (08/04) FERIADO: Municipal
9 (15/04) FERIADO: Paixão de Cristo
10 (22/04) FERIADO: Tiradentes (emenda)
11 (29/04)
TEORIA 8: Biossegurança e marcos regulatórios
PRÁTICA 7: Extração de RNA
Prof. Hana Masuda
12 (06/05)
AVALIAÇÃO FINAL
NÃO HAVERÁ AULA DE LABORATÓRIO
13 (13/05) REPOSIÇÃO FERIADO
14 (16/05) REPOSIÇÃO FERIADO - SUB/EXAME
15 (19/05) REPOSIÇÃO FERIADO

* As aulas teóricas serão REMOTAS, disponibilizadas na Plataforma Moodle.

SEGURANÇA E NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO

Leia integralmente o Guia de Segurança, Experimentos e Atividades (3ªed.) da disciplina de
Base Experimental das Ciências Naturais. Destacam-se:

Segurança
• Conheça a localização dos chuveiros de emergência, extintores e lavadores de olhos.

• Use sempre avental, mantenha os cabelos presos e use calçados fechados, mesmo na
aula reservada para o preparo da prática seguinte;

• Os óculos são obrigatórios!
• Usar a capela sempre que possível;
• Nunca pipete com a boca, não cheire, nem experimente os produtos químicos;
• Comes e bebes, só fora do laboratório;
• Consulte o professor cada vez que notar algo anormal ou imprevisto;
• Comunique qualquer acidente, por menor que seja ao professor;
• Se utilizar chama, mantenha longe de qualquer reagente!
• Nunca brinque no laboratório;
• Evite o contato de qualquer substância com a pele;

• Nunca aqueça o tubo de ensaio, apontando a extremidadeaberta para um colega ou para
si mesmo.

• Cuidado ao aquecer vidro em chama: o vidro quente tem exatamente a mesma
aparência do frio.

Procedimentos gerais
• Siga rigorosamente as instruções fornecidas pelo professor.
• Pesquise sempre a toxicidade dos reagentes antes das práticas.
• Nunca abra um recipiente de reagente antes de ler o rótulo.
• Evite contaminar reagentes, nunca retorne o excedente aos frascos de origem.
• Adicione sempre ácidos à água, nunca água a ácidos.
• Não coloque nenhum material sólido dentro da pia ou nos ralos.
• Não coloque resíduos de solventes na pia ou ralo; há recipientes apropriados para isso.

• Não atire vidro quebrado no lixo comum. Deve haver um recipiente específico para
fragmentos de vidro.
• Verifique se as conexões e ligações estão seguras antes de iniciar uma reação/destilação
• Ao terminar a prática, lave o material utilizado e deixe-o em ordem.

BIBLIOGRAFIA

BUCHANAN, B.B., WILHEIM, G., JONES R.L. 2015. Biochemistry and Molecular Biology of
Plants, 2nd Edition. Willey Blackwell. 1280 pp.
FALEIRO, F.G., ANDRADE, S.R.M., REIS-JUNIOR, F.B. 2011. Biotecnologia: Estado da Arte e
Aplicações na Agropecuária. Embrapa Cerrados. 730 pp.
LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de bioquímica. 4ed. SP: Sarvier,
2006. 1202p.
NEUMANN, K.-H., KUMAR, A., IMANI, J. 2009. Plant Cell and Tissue Culture: a Tool in
Biotechnology. Ed. Springer. 333 pp.
SLATER, A., SCOTT, N.W., FOWLER, M.R. 2008. Plant Biotechnology: The Genetic
Manipulation of Plants, 2nd Edition. Oxford Press. 400 pp.
STEWART, C.N. 2016. Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and
Applications, 2nd Edition. Ed. Wiley. 432 pp.
TAIZ, L. e ZEIGER, E. 2013. Fisiologia Vegetal. Ed. Artmed. 954 pp.
UMESHA, S. 2017. Plant Biotechnology. The Energy and Resources Institute. 383 pp.

Informações técnicas (propriedades físicas, toxicidade, preço, nomenclatura)
1. CRC Handbook of Chemistry and Physics
2. Sigma-Aldrich - www.sigmaaldrich.com
3. IUPAC Gold Book - http://goldbook.iupac.org/
4. Merck Index

Bases de Dados/Referências
1. The Web of Science (www.isiknowledge.com)
2. SciELO - Scientific Electronic Library Online (www.scielo.org)

http://www.scielo.org)/
7

CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO

Os conceitos a serem atribuídos ao longo da disciplina estarão de acordo com os
critérios contidos no Sistema de Avaliação do Processo de Ensino e Aprendizagem,
parte do Projeto Pedagógico do BC&T.
Conceito Desempenho

A
Desempenho excepcional, demonstrando excelente compreensão da disciplina e do
uso do conteúdo.
B Bom desempenho, demonstrando boa capacidade de uso dos conceitos da
disciplina.

C
Desempenho mínimo satisfatório, demonstrando capacidade de uso adequados dos
conceitos da disciplina, habilidade para enfrentar problemas relativamente simples
e prosseguir em estudos avançados.

D
Aproveitamento mínimo não satisfatório dos conceitos da disciplina, com
familiaridade parcial do assunto e alguma capacidade para resolver problemas
simples, mas demonstrando de deficiências que exigem trabalho adicional para
prosseguir em estudos avançados. Nesse caso, o aluno é aprovado na expectativa
de que obtenha um conceito melhor em outra disciplina, para compensar o
conceito D no cálculo do CR. Havendo vaga, o aluno poderá cursar esta disciplina
novamente.
E Reprovado. A disciplina deve ser cursada novamente para obtenção de crédito.
O Reprovado por falta. A disciplina deve ser cursada novamente para obtenção de
crédito.

Determinação do conceito final na disciplina

O conceito final da disciplina será determinado após a avaliação final, que será
disponibilizada na Plataforma Moodle.
Atenção: para cada avaliação não realizada será atribuído conceito “F”. Em
caso de falta justificada, o aluno realizará uma prova escrita substitutiva com o mesmo
conteúdo da avaliação não realizada (Resolução ConsEPE UFABC n. 181, de
23/10/14).
Para ser considerado aprovado na disciplina, o aluno deverá cumprir,
simultaneamente, as seguintes condições:
8

1) ter comparecido, no mínimo, a 75% do total das aulas da disciplina (teoria e
laboratório);
2) obter, no mínimo, o conceito final “D” na disciplina.

Recuperação

A avaliação de recuperação (exame) será realizada em data, local e horário
a serem combinados com o(a) professor(a) (Resolução ConsEPE n.182 a qual
regulamenta a aplicação de mecanismos de recuperação nos cursos de graduação da
UFABC).
A avaliação de recuperação (exame) poderá envolver todos os conhecimentos
explorados na disciplina (aulas teóricas e de laboratório) e é destinado ao discente que
for aprovado com Conceito Final D ou reprovado com Conceito Final F. O(A) aluno(a)
que obtiver conceito final D e tiver interesse em realizar o exame de recuperação deverá
informar o(a) professor(a) com antecedência.

PRÁTICA 1: Cultura de tecidos vegetais: indução e isolamento de
calos embriogênicos de Setaria viridis

Atenção
Não recarregar o celular no laboratório.
Não retirar aparelhos da tomada. Em caso de dúvidas, consultar o(a) professor(a)
e/ou os técnicos no laboratório.

CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
INTRODUÇÃO

A cultura de tecidos é definida como a cultura asséptica in vitro de células,
tecidos, órgãos e seus componentes sob condições físicas e químicas estritamente
controladas. Constitui-se de uma importante ferramenta biotecnológica para estudos
básicos de fisiologia, bioquímica, fatores responsáveis pelo crescimento e metabolismo,
diferenciação celular, entre outras. Por outro lado, a cultura de tecidos também possui
ampla aplicação prática para a agricultura, envolvendo micropropagação, produção de
compostos secundários (produtos naturais), transformação genética, manutenção do
germoplasma e limpeza clonal.
As condições de cultivo in vitro também envolvem um ambiente físico (luz,
temperatura) e químico (composição do meio de cultivo) rigidamente controlados. Na
base de toda a cultura de tecidos estão a totipotência e a competência celular, que
permitem que uma célula vegetal se transforme em uma planta intacta, desde que
aplicados os estímulos corretos para tal. A competência celular garante a capacidade das
células totipotentes de reagirem aos estímulos, para desenvolverem todo seu potencial
genético.
Existem duas categorias de cultura de tecidos, que envolvem basicamente a rota
morfogenética adquira pelas células:
(i) Cultivos com crescimento organizado: cultura de meristemas, cultura de ápices
caulinares ou gemas, cultura de segmentos nodais (gemas laterais dos nós +
pequeno pedaço de tecido), cultura de raízes isoladas e cultura de embriões.
(ii) Cultivos com crescimento não organizado: cultura de calos (massa de células
desorganizada), células em suspensão (meio de cultura líquido), cultura de
protoplastos (células sem a parede celular), cultura de anteras e pólen
10

Os processos de desenvolvimento da planta regenerada podem ocorrer por meio
de duas maneiras, dependendo do tipo de explante, estádio fisiológico da planta e o
ambiente físico e químico do meio de cultura.
(i) Organogênese: Processo de formação de uma nova plântula a partir de um
explante;
(ii) Embriogênese somática: Formação de embriões a partir de células somáticas,
sem fecundação zigótica.
Tanto a organogênese quanto a embriogênese somática podem ocorrer de
maneira direta ou indireta. A organogênese ou embriogênese direta ocorre quando
plântulas ou embriões, respectivamente, surgem a partir de meristemas já existentes nos
explantes. Na via indireta, os processos ocorrem primeiramente através da formação de
calos, seguida da formação de meristemas para depois formarem-se plântulas ouembriões. A rota morfogenética depende de vários fatores, tais como tipo de explante,
tipo de espécie, propósito da aplicação da cultura de tecidos etc.

FATORES QUE INFLUENCIAM A CULTURA DE TECIDOS

1. Explantes
A seleção dos explantes, ou seja, a parte da planta que será excisada para dar
origem às plântulas, deve ser criteriosa e depende altamente da espécie a ser propagada.
Geralmente, são utilizados tecidos jovens, que possuem crescimento ativo, devendo os
mesmos estarem livres de estresse e ataque de pragas e patógenos. Os explantes mais
utilizados são meristemas, ápices caulinares e gemas axilares.

2. Desinfestação
Se possível, tratamentos de desinfestação devem ser realizados já na planta
matriz, aquela que dará origem ao explante. Após a excisão do explante, o mesmo
também deve passar por tratamentos físicos ou químicos para desinfestação antes de ser
transferido para o meio de cultivo. Usualmente os explantes são tratados com
hipoclorito de sódio e uma gota de detergente (Tween 20) para diminuir a tensão
superficial e aumentar o contato do explante com o agente químico. Todos os materiais
de manipulação também devem ser esterilizados, geralmente em autoclave a 120oC por
30 minutos. Antes de serem utilizados, os materiais de manipulação devem ser imersos
em etanol 96% e flambados.
11

3. Oxidação
É muito comum durante o estabelecimento da cultura de tecidos a oxidação
fenólica, que pode ser desencadeada pelo estresse causado durante a excisão do explante
ou pelas condições do meio de cultura. A oxidação é altamente dependente do genótipo
e da espécie a ser cultivada. Alguns fatores que influenciam a oxidação são a idade e o
tipo do explante, além da época do ano em que foi extraído. Para se minimizar a
oxidação fenólica, procura-se diminuir os danos físicos causados pela remoção do
explante da planta matriz, bem como a redução dos danos químicos causados na
desinfestação. Além disso, adiciona-se ao meio de cultura compostos antioxidantes tais
quais cisteína e ácido ascórbico.

4. Meios de cultura
O meio de cultura para micropropagação deve ser cuidadosamente estudado e
implementado de acordo com o tipo de explante, genótipo e espécie que estão sendo
manipulados. De maneira geral, todos os meios de cultura contêm macronutrientes (Ca,
N, P, K, S, Mg e Si), micronutrientes (Fe, Na, Cl, Zn, Mo, Cu, B, Mn e Ni), fontes de
vitaminas (tiamina, piridoxina), carbono (sacarose) e nitrogênio orgânico (glicina,
inositol), além de reguladores de crescimento (auxinas, citocininas, ácido giberélico) e
agente gelatinoso (ágar, fitagel).

5. Fitohormônios e reguladores de crescimento
Os fitohormônios são compostos biologicamente ativos que regulam diversos
aspectos do desenvolvimento vegetal, sendo produzidos em concentrações muito baixas
e atuando geralmente em locais diferentes daqueles onde foram produzidos. Os
reguladores de crescimento são compostos sintéticos utilizados para mimetizar o efeito
dos fitohormônios. Os fitohormônios mais utilizados na cultura de tecido são:
(i) Auxinas: Induzem desenvolvimento de nós, a formação de calos e raízes.
Dentre as auxinas podemos citar o ácido indol-acético (AIA), ácido
naftalenoacético (ANA) e o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D).
(ii) Citocininas: Responsáveis pela divisão celular, formação de brotos e inibição
do crescimento radicular. Dentre as citocininas, podemos citar a kinetina (Kin),
zeatina e a 6-benzilaminopurina (BAP ou 6-BA).
12

(iii) Giberelinas: São promotores de crescimento e induzem o crescimento de nós,
gemas e meristemas e auxiliam o rompimento da dormência de embriões
isolados. O ácido giberélico (GA3) é um exemplo de giberelina.
O uso dos reguladores de crescimento depende de vários fatores:
(i) tipo de morfogênese desejada;
(ii) nível endógeno do fitohormônio no explante;
(iii) capacidade do tecido em sintetizar determinado fitohormônio durante a cultura;
(iv) possível interação entre os reguladores.
Portanto, o balanço hormonal do meio de cultura é fator primordial para o sucesso da
cultura de tecidos, uma vez que regulam aspectos importantes do desenvolvimento e
crescimento vegetal.

PARTE PRÁTICA
Objetivo: Indução e isolamento de calos embriogênicos de Setaria viridis a partir de
sementes.

CORPO TÉCNICO: Favor separar os materiais listados abaixo:

Material
- Água destilada autoclavada
- Papel filtro autoclavado
- Pinças de ponta fina autoclavadas
- Bisturis
- Capela de fluxo laminar
- Solução de hipoclorito de sódio 12%
- Tween 20
- Pipetas automáticas (1 jogo por grupo)
- Lixa para descascar sementes
- Placas de Petri estéreis
- Lamparinas ou Bico de Bunsen
- Álcool 70%
- Lupas

PARTE 1: Introdução de sementes para indução de calos embriogênicos

ATENÇÃO: O docente responsável pela disciplina fornecerá as placas contendo meio
CIM, nem os alunos nem o corpo técnico precisarão preparar estas placas! O
procedimento para tal está descrito na Apostila apenas para conhecimento.

Procedimento
***Preparar 250 mL do meio de indução de calos (CIM) apresentado na Tabela 1 e
autoclavar antes de iniciar o experimento! Distribuir 25 mL do meio autoclavado em
placas de Petri estéreis.

1. Seleção de sementes de Setaria viridis WT genótipo A10.1: As sementes coletadas
devem ser criteriosamente selecionadas, separando-se as sementes viáveis
(escurecidas, Fig. 1) das sementes “vazias” (inviáveis).

2. Remoção da camada externa da semente (palha e casca), com cuidado para não
danificar o embrião (Figura 1);

Figura 1. Passo-a-passo da retirada da palha e da casca de Setaria viridis, a seta indica o
lado em que a semente deve ser colocada em contato com o meio de indução de calos
(CIM).

3. Esterilização da semente em câmara de fluxo: Em tubo eppendorf de 2 mL contendo
as sementes adicionar 1 mL de solução de hipoclorito de sódio 10-12%, acrescido
de 1 gota de Tween 20 e incubar sob agitação manual ocasionalmente durante 5
14

minutos. Descartar com pipeta a solução desinfetante e enxaguar por 5 vezes com
água destilada autoclavada;

4. Transferir as sementes esterilizadas para papel filtro, secar e transferir as sementes
viradas com o embrião para baixo, aproximadamente 30 sementes para cada placa
contendo meio de indução CIM (Tabela 1).

5. Incubar as placas a 25 ± 2ºC no escuro por 3 a 4 semanas sem fazer subcultivos.

Tabela 1. Meio de indução de calos

Reagente Concentração final Para 250 mL Para 500 mL
Sais MS (Sigma) 4,3 g/L 1,075 g 2,15 g
Vitaminas Setaria/CIM 1000X* 1x 250 µL 500 µL
D-Biotina [0,5 mg/mL]** 1 mg/L 500 µL 1 mL
Sacarose 30 g/L 7,5 g 15 g
Inositol 100 mg/L 0,025 g 50 mg
Fitagel 2 g/L 1 g 2 g
Solução CuSO4.5H2O 1000X*** 0,92 mg/L 250 µL 500 µL
Solução de 2,4-D [1 mg/mL]**** 2 mg/L 500 µL 1 mL
Kinetina (1mg/mL)# 0,5 mg/L 125 µL 250 µL
Ajustar pH 5,8 com NaOH 1 M e autoclavar

Reagentes estoques:
* Vitaminas para Setaria/CIM 1000X: Pesar 25 mg de tiamina-HCl (0,1 mg/L-1), 125
mg de pirodoxina-HCl (0,5 mg/L-1), 125 mg de ácido nicotínico (0,5 mg/L-1). Dissolver
em 200 mL de H2O MilliQ autoclavada, homogeneizar bem, aliquotar para tubos
eppendorf e estocar a -20ºC.
** D-Biotina [0,5 mg/mL]: Pesar 25 mg de d-Biotina, dissolver em NaOH 1M e
completar o volume para 50 mL com H2O MilliQ autoclavada, homogeneizar bem,
alíquotar para tubos eppendorf e estocar a -20ºC.
***CuSO4.5H2O [249,5 g/mol] 1000X: Pesar 92 mg de CuSO4.5H2O, dissolver e
completar o volume final de 100 mL com H2O MilliQ autoclavada. Estocar a 4ºC.
**** 2,4-D 1 mg/mL: Pesar 30 mg de 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, dissolver com 3
mL NaOH 1M e completar o volume final de 30mL com H2O MilliQ autoclavada.
Estocar a 4ºC.
15

# Kinetina (1 mg/L): Pesar 10 mg de Kinetina, dissolver em NaOH 1 M e completar o
volume final de 10 mL com H2O MilliQ autoclavada. Alíquotar em tubos eppendorf e
estocar a -20ºC.

PARTE 2: Isolamento dos calos embriogênicos

Após a indução dos calos embriogênicos realizados na Parte 1, os mesmos
devem ser selecionados e isolados para a transformação genética. Os calos aptos para a
transformação precisam estar em boas condições assépticas e com a morfologia
apresentada na Figura 2. Os calos embriogênicos devem ser separados da massa amorfa
e gelatinosa e colocados em nova placa de Petri contendo meio CIM fresco, sendo
mantidos assim por mais sete dias antes da transformação.

Figura 2. a. Calo embriogênico após 4-5 semanas em meio de indução. b. Calo
embriogênico translúcido (tecido adequado para transformação – setas).

Objetivo: Isolar os calos embriogênicos e transferi-los para novo meio de indução CIM.

Procedimento
1. Selecionar e transferir, usando lupa, os calos embriogênicos para as placas contendo
CIM e incubar a 25oC por uma semana.

BIBLIOGRAFIA

1. Faleiro, FG, Andrade, SRM., Reis-Junior, FB (2011). Biotecnologia: Estado da Arte
e Aplicações na Agropecuária. Embrapa Cerrados. 730 pp.
2. Neumann, K-H, Kumar, A, Imani, J (2009). Plant Cell and Tissue Culture: a Tool in
Biotechnology. Ed. Springer. 333 pp.
16

3. Stewart, CN (2016). Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and
Applications, 2nd Edition. Ed. Wiley. 432 pp.

PRÁTICA 2: Transformação genética de Setaria viridis

INTRODUÇÃO
A transformação genética de plantas refere-se à introdução de DNA exógeno nas
células vegetais, gerando um organismo geneticamente modificado (OGM). Um dos
objetivos principais da transformação é a integração deste DNA exógeno no genoma da
planta, para a expressão do gene de interesse. Assim, a transformação genética pode
estar inserida no contexto de melhoramento vegetal, dependendo dos objetivos que se
pretende alcançar. Atualmente, existem dois métodos principais pelos quais as plantas
podem ser geneticamente transformadas: o método biológico e o método físico. O
método de transformação biológico faz uso de bactérias do gênero Agrobacterium, que
possuem a maquinaria necessária para transferir parte do DNA contido em suas células
para as células vegetais. O método físico envolve o bombardeamento de tecidos
vegetais com micropartículas envolvidas no DNA que se pretende transformar.
A transformação genética, como descrito acima, pode estar inserida no contexto
do melhoramento vegetal. A diferença básica entre as duas técnicas consiste no fato de
que no melhoramento convencional vários ciclos de seleção e recombinação são
necessários para a geração de uma nova variedade, que possuirá o genoma alterado em
diversos alelos, com múltiplos genes sendo alterados devido à hibridação sexual. No
melhoramento por transformação genética, a expressão de um ou poucos genes é
alterada para que se alcance uma característica desejada, como por exemplo tolerância à
seca e resistência a pragas e doenças.
O conceito básico da transformação genética é simples: a introdução de um gene
exógeno em uma única célula para a regeneração de uma planta inteira a partir desta
célula, planta esta contendo a característica que a expressão do gene exógeno
proporciona. A nova planta deve ser exatamente igual à planta-mãe, com apenas a
característica desejada alterada. Para tal, o gene alvo deve ser inserido no genoma
cromossômico das células vegetais para que possa ser expresso e transferido para as
suas células-filhas. A seguir, os métodos para atingir estes objetivos serão discutidos.

A introdução do DNA na célula vegetal
Para que ocorra a expressão do gene alvo, o DNA correspondente deve ter a
capacidade de penetração nas células vegetais até atingir o núcleo, local da expressão
gênica. A célula vegetal contém uma barreira bastante rígida denominada parede
18

celular, composta por polissacarídeos complexos. Além da parede celular, o DNA deve
penetrar também a membrana plasmática, e tais penetrações devem ocorrer com o
mínimo dano possível à célula, para que a mesma possa se regenerar.
Além disso, as células vegetais geralmente se apresentam em meio hipertônico,
para manutenção da turgescência, o que torna as células vegetais ainda mais rígidas.
Este problema pode ser contornado diminuindo-se a osmolaridade do meio em que as
células se encontram, sendo que isto pode ser feito com a adição de açúcares no meio
reacional.
Na grande maioria dos casos, o núcleo celular é o destino final do DNA. O
método físico de transformação (bombardeamento) provoca um espalhamento
desordenado do DNA no interior celular, com algumas partículas alcançando os
arredores do núcleo e outras (poucas) adentrando a organela. Uma vez dentro do núcleo,
o DNA pode integrar-se no genoma ou ser utilizado pela maquinaria genética para a
expressão do respectivo gene. No método biológico de transferência, a integração do
DNA no genoma ocorre de forma mais controlada, uma vez que a penetração no núcleo
é auxiliada pelas proteínas produzidas pela Agrobacterium. De maneira geral, para que
o DNA represente a correta expressão do respectivo gene e produção da proteína
correspondente, o mesmo deve ser precisamente configurado, sendo utilizada para tal a
tecnologia do DNA recombinante.

Tecidos alvo para transformação genética
Existem algumas características básicas que devem compor os tecidos que serão
utilizados como matéria-prima para transformação genética:
(i) os tecidos devem ser fisicamente acessíveis ao DNA;
(ii) os tecidos devem ter divisão celular acelerada e ativa;
(iii) devem ser totipotentes, ou seja, possuírem a capacidade de se regenerar em uma
planta intacta em resposta ao estímulo adequado;
(iv) devem possuir a parede celular e a membrana plasmática resilientes aos
métodos para introdução do DNA, que pode danificar estas estruturas.
Os tecidos mais utilizados para a transformação genética atualmente são calos
embriogênicos, embriões, pólen e meristemas. A escolha sempre dependerá de vários
fatores, dentre eles a espécie escolhida, genótipo e o método de transformação.

Seleção e regeneração dos transformantes
Como já discutido anteriormente, os métodos de transferência do DNA não
permitem que a eficiência de integração do mesmo no núcleo celular seja muito alta.
Sendo assim, como saber quais plantas foram transformadas? A primeira análise
realizada para a confirmação dos transgênicos é a seleção por meio de um agente
químico, por exemplo. Geralmente, as plantas são transformadas com genes cuja
expressão confere resistência a antibióticos ou herbicidas, além do gene alvo
obviamente. Assim, o tecido alvo da transformação é colocado em um meio contendo o
agente seletivo, e apenas as plantas transformadas poderão crescer e se desenvolver
normalmente no meio contendo o produto tóxico.
Os genes de resistência mais utilizados para seleção são:
(i) neomicina fosfotransferase (npt): confere resistência ao antibiótico
kanamicina;
(ii) higromicina fosfotransferase (hpt): resistência ao antibiótico
higromicina;
(iii) fosfinotricina acetil transferase (bar): inativa os herbicidas glufosinato e
bialaphos.
Além do uso dos agentes químicos, a seleção pode ser realizada também
utilizando-se alguns genes denominados de gene repórter, ou seja, quando expressos
fornecem uma determinada coloração às células transformadas ou brilham sob luz
ultravioleta, por exemplo. É o caso do gene da beta-glucuronidase (GUS), que quando
produzida degrada um substrato específico (X-Gluc) que fornece coloração azul aos
tecidos e da proteína verdefluorescente (green fluorescent protein, GFP), que confere
um brilho específico aos tecidos quando os mesmos são colocados sob luz UV. Pouco
menos utilizada em plantas é a seleção por nutrientes, onde as células são transformadas
com um gene cuja expressão permite metabolizar alguns compostos que outrora não
eram capazes de fazê-lo. Assim, adiciona-se ao meio de cultura este composto, que
permitirá o desenvolvimento apenas das células transformadas.

MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
Existem diversos métodos utilizados para a transformação genética de plantas.
Dentre eles, os mais utilizados são o bombardeamento de partículas que carregam o
DNA (gene) alvo e a transfecção de tecidos por Agrobacterium tumefaciens. Será
20

descrito em detalhes nesta apostila o método que utilizaremos para transformação em
Setaria viridis, ou seja, o método da Agrobacterium.

Método de transformação genética pela Agrobacterium tumefaciens
O método de transformação genética de plantas que demonstrou ser o mais
eficiente até os dias atuais é aquele realizado com auxílio de uma bactéria denominada
Agrobacterium tumefaciens. Naturalmente, esta espécie é encontrada em solos, sendo
responsável pela colonização das células vegetais, causando a doença comumente
chamada de galha de coroa. Devido ao mecanismo biológico de infecção pela
Agrobacterium, a mesma é amplamente usada para a transferência de DNA exógeno
para o genoma das plantas. O mecanismo natural da infecção por Agrobacterium
consiste na transferência do seu DNA para o núcleo das células vegetais. Este DNA,
denominado de DNA de transferência (T-DNA), é introduzido nas células por um
sistema de sinalização complexo existente na relação patógeno-hospedeiro.
As células de Agrobacterium patogênicas contêm um plasmídeo, denominado
plasmídeo Ti (do inglês tumor inducing) que possui duas regiões: uma contendo os
genes que serão transferidos ao genoma vegetal (região do T-DNA ou região-T) e outra
região responsável pelos fatores de virulência da bactéria (região vir). A região do
plasmídeo responsável pelos genes que são transferidos às plantas (T-DNA) está
compreendida entre o que se convencionou chamar de borda direita e borda esquerda do
plasmídeo Ti. A região vir contém genes envolvidos na síntese de proteínas
responsáveis pelo processo de transferência da região-T. No ambiente natural, as plantas
enviam sinais para a Agrobacterium, que ativa então a expressão dos genes de
virulência (vir), responsáveis pela produção de proteínas que vão carrear o T-DNA até o
núcleo das células vegetais para sua incorporação no genoma. Os genes que
compreendem o T-DNA são geralmente compostos por genes para produção de
hormônios vegetais tais como citocininas e auxinas, além de opinas, que são proteínas
responsáveis pelo catabolismo de compostos ricos em nitrogênio que servem de fonte
nutricional para as bactérias.
Assim, a agrobactéria faz uso da maquinaria genética das plantas para se
reproduzir e crescer. Devido à alta produção de citocininas e auxinas, as células vegetais
se reproduzem indiscriminadamente, produzindo tumores, o que caracteriza a doença
galha-de-coroa.
21

Partindo do princípio de infecção nativo da Agrobacterium, os cientistas fazem
uso da mesma para a transformação genética de plantas. Em primeiro lugar, as bactérias
para transformação devem ser alteradas geneticamente por meio da tecnologia do DNA
recombinante. O plasmídeo Ti é modificado para que as bactérias não produzam opinas
e hormônios, sendo que os genes responsáveis pela produção destes compostos são
substituídos pelos genes a serem inseridos na planta. O gene alvo passa a ocupar, assim,
a região do T-DNA. Os genes de virulência, responsáveis pela integração do T-DNA no
genoma vegetal são mantidos, porém usualmente são também modificados, para que a
bactéria apresente um nível maior ou menor de patogenicidade, dependendo da espécie
vegetal a ser transformada. Os vetores utilizados para transformação genética de plantas
por Agrobacterium são chamados de vetores binários de expressão, por apresentarem
elementos do T-DNA e da região vir do plasmídeo Ti nativo. A manipulação genética
da Agrobacterium constitui atualmente fator imprescindível para o sucesso da
transformação genética mediada por esta bactéria. De maneira geral, a bactéria infecta
plantas dicotiledôneas, mas atualmente diversas estirpes foram manipuladas para a
infecção de monocotiledôneas.
A sinalização que ocorre entre planta-bactéria envolve alguns compostos
fenólicos, geralmente ativadores dos genes de virulência nas bactérias. Assim, um
composto regularmente utilizado para o aumento da eficiência de transformação por
agrobactéria é a acetoseringona, um composto fenólico que, quando utilizado em
concentrações adequadas favorece o processo de transferência do DNA da agrobactéria
para as células vegetais.
Outro fator que pode aumentar a eficiência da transformação é a adesão da
bactéria nas células vegetais. Pequenos ferimentos nos tecidos a serem infectados
geralmente aumentam o contato das células bacterianas às células vegetais aumentando,
assim, a eficiência do processo de transformação.
Além disso, a bactéria também deve vencer as barreiras impostas pelo sistema
de defesa natural das plantas. Uma das primeiras respostas ao ataque patogênico é a
produção de compostos altamente oxidantes, responsáveis por destruir as células dos
patógenos. Dessa forma, é comum acrescentar ao meio de transformação agentes
antioxidantes, que impedem as reações de defesa natural das plantas. Uma outra
estratégia de defesa vegetal consiste na morte celular programada (MCP) das células
vizinhas ao sítio de infecção, e uma linha relativamente nova de pesquisa envolve
desvendar os mecanismos de MCP em plantas recalcitrantes à transformação por
22

Agrobacterium, a fim de vencer esta barreira e facilitar o processo de transformação
nestas espécies.

O método de transformação por Agrobacterium
Uma vez estabelecida a espécie vegetal a ser transformada e a estirpe da
agrobactéria a ser utilizada, o protocolo de transformação é geralmente bastante
simples. O gene alvo é introduzido em um vetor binário de expressão que é então
transformado em Agrobacterium. A bactéria contendo o vetor é crescida em meio de
cultura específico até atingir uma densidade ótica (D.O.) que represente a fase
exponencial de crescimento. Dependendo da espécie vegetal a ser transformada,
acetoseringona pode ser adicionada ao meio de cultura para induzir ainda mais a
expressão dos genes de virulência. O meio de cultura bacteriano é então misturado ao
tecido alvo, que pode ser embriões, calos embriogênicos, discos foliares, meristemas,
entre outros. A mistura tecido vegetal + cultura bacteriana é homogenizada por tempo
determinado e logo após o tecido é colocado em meio seletivo para regeneração.
Geralmente, este meio de regeneração contém algum antibiótico para
aniquilação das células remanescentes de Agrobacterium.
Em suma, o método de transformação pela Agrobacterium tem sido o mais
eficiente método de transformação genética em plantas. O protocolo é simples e o
método, por fazer parte de um sistema natural de transferência de DNA, é controlado,
integrando no genoma vegetal geralmente apenas uma cópia do gene alvo, o que
usualmente é desejado pelos cientistas.

Objetivo: Transformação genética de calos embriogênicos de Setaria viridis utilizando
o método da Agrobacterium tumefaciens.

Material
- Água destilada autoclavada
- Papel filtro autoclavado
- Pinças autoclavadas
- Capela de fluxo laminar
- Centrífuga para tubos de 15 ou 50 mL
- Synperonic (detergente)
- Pipetas automáticas (1 jogo por grupo)
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- Acetoseringona (100 mM)
- Placas de Petri estéreis
- Lamparina (fluxo)
- Álcool 70%
- Falcons de 15 e 50 mLProcedimento
PARTE 1: PREPARO DA CULTURA Agrobacterium tumefaciens

ATENÇÃO: Esta parte será realizada pelo docente responsável pela disciplina e
está na Apostila apenas para conhecimento.

1. Pré-inóculo: repicar uma colônia de A. tumefaciens EH105 transformada com o
vetor binário desejado, inocular em Falcon de 15 mL contendo 3 mL de YEB
acrescido de Rifampicina (50 mg/L) + antibiótico do vetor binário (Espectinomicina
100 mg/L), incubar overnight sob agitação 180 rpm, a 28ºC (se possível, manter o
tubo inclinado/deitado para melhor agitação);
2. No dia seguinte, transferir 2 mL do pré-inóculo para um erlenmeyer estéril de 150
mL, adicionar mais 18 mL de meio YEB, acrescentando os antibióticos de seleção
(Rifampicina 50 mg/L e Espectinomicina 100 mg/L) e 200 µM de acetoseringona,
incubar sob agitação a 28ºC, até atingir OD600 0.6 (no máximo);

ATENÇÃO: Os passos seguintes deverão ser realizados pelos alunos na aula
prática, COM EXCEÇÃO do meio CIM da Tabela 2, que deverá ser preparado
pelo docente.

3. Centrifugar a 3.500 rpm durante 15 minutos (temperatura ambiente). Em câmara de
fluxo laminar, descartar o sobrenadante e ressuspender suavemente o pellet em meio
CIM líquido (Tabela 2) e adicionar 200 µM de acetoseringona de forma a manter a
OD600 em 0.6;

Tabela 2. Meio de co-inoculação CIM líquido. Obs.: Este meio NÃO tem adição de
CuSO4.

Reagente Concentração
final
Para 100 mL Para 500 mL
Sais MS (Sigma) 4,3 g/L 430 mg 2,15 g
Vitaminas Setaria/CIM 1000X 1x 100 µL 500 µL
D-Biotina 500X [0,5 mg/mL] 1 mg/L 200 µL 1 mL
Sacarose 30 g/L 3 g 15 g
Inositol 100 mg/L 10 mg 50 mg
Solução de 2,4-D [1 mg/mL] 2 mg/L 200 µL 1 mL
Kinetina (1 mg/mL) 0,5 mg/L 50 µL 250 µL
Acetoseringona (100 mM) 200 µM 200 µL 1 mL
Ajustar pH 5,8 com NaOH 1 M e autoclavar

PARTE 2: Transformação genética de calos embriogênicos de S. viridis

4. Transferir 50 calos para tubo Falcon de 50 mL estéril, em seguida adicionar 10 mL
da suspensão bacteriana;
5. Em seguida adicionar 10 µL Synperonic (Poloxamer 188 solution - P5556 Sigma)
para cada 1 mL de cultura bacteriana;
6. Homogeneizar suavemente e incubar por 5 minutos com agitação suave;
7. Descartar a cultura bacteriana, secar o excesso em papel filtro e transferir os calos
para placas contendo meio de co-inoculação CIM sólido (Tabela 2) acrescido de 200
µM de acetoseringona;
8. Incubar as placas a 22ºC no escuro por 3 dias;

OBSERVAÇÃO: Os passos a seguir são necessários para a obtenção de plantas
regeneradas, porém estes procedimentos NÃO SERÃO REALIZADOS EM NOSSA
DISCIPLINA, pois nos falta tempo e infraestrutura para tal. Estes passos serão
explicados pelo docente, que levará aos alunos plantas regeneradas para que possam
verificar o processo (Figura 3).

9. Transferir os calos para meio CIM acrescido de 150 mg/L de Timentin e 30 mg/L de
higromicina, incubar as placas a 25 ± 2ºC no escuro por mais 7 dias;
10. Transferir os calos para meio MRS (Tabela 3) acrescido de 150 mg/L de Timentin e
30 mg/L de higromicina; Incubar as placas a 26 ± 2°C em luz 150 µmol m-2s-1 com
fotoperíodo de 16 horas luz/8 horas escuro.
25

11. Observar os explantes em regeneração após 30 dias.

Tabela 3. Meio de regeneração (MRS)

Reagente Concentração
final
Para 100 mL Para 500 mL
Sais MS (Sigma) 4,3 g/L 430 mg 2,15 g
Vitaminas Setaria/CIM2 1000X 1x 100 µL 500 µL
D-Biotina [0,5 mg/mL] 1 mg/L 200 µL 1 mL
Sacarose 20 g/L 2 g 10 g
Inositol 100 mg/L 10 mg 50 mg
Kinetina (1mg/mL) 2 mg/L 200 µL 1 mL
Fitagel 2 g/L 200 mg 1 g
Ajustar pH 5,8 com NaOH 1 M e autoclavar
Timentin [300 mg/mL] 150 mg/L 50 µL 250 µL
Higromicina [50 mg/mL] 30 mg/L 60 µL 300 µL

APÓS 30 DIAS
12. Transferir os candidatos a eventos em fase inicial de regeneração (brotinhos com
raízes), para meio de desenvolvimento (Tabela 4) em Magenta contendo os agentes
seletivos.
Tabela 4 - Meio de Desenvolvimento para Setaria viridis:
Reagente Concentração final Para 100 mL Para 500 mL
Sais MS (Sigma) 2,15 g/L 215 mg 1,07 g
Vitaminas MS 1000X 1x 100 µL 500 µL
Sacarose 15 g/L 1,5 g 7,5 g
Inositol 100 mg/L 10 mg 50 mg
Fitagel 2 g/L 200 mg 1 g
Ajustar pH 5,8 com NaOH 1M e autoclavar
Timentin [300 mg/mL] 150 mg/L 50 µL 250 µL
Higromicina [50 mg/mL] 30 mg/L 60 µL 300 µL

APÓS 30 DIAS
13. Os explantes permanecem em Magenta em meio de desenvolvimento (Tabela 4), em
média por 20 a 30 dias, até desenvolvimento das raízes e parte aérea suficiente para
posterior aclimatação.
14. A aclimatação é realizada no Fitotron, utilizando Substrato + vermiculita (3:1), em
copos descartáveis de 200 mL, as plantas ficam em estufa de aclimatação apropriada
(câmara úmida) por pelo menos 5 dias. Posteriormente é retirada a câmara úmida, e
as plantas são mantidas sob 16/8 horas (luz/escuro) com intensidade de luz de 500
µmol m-2s-1, temperatura de 26 + 2°C e umidade relativa de 65%.
26

15. Aguardar a senescência das plantas de cada evento, coletar as sementes
individualmente, identificar corretamente e acondicionar em saco de papel,
estocando a temperatura ambiente;
Selecionar 100 sementes maduras e proceder à análise de segregação de cada evento
T1.

Figura 3. Etapas de indução de calos embriogênicos e regeneração de plântulas de
Setaria viridis após transformação genética. a-c: crescimento de calos embriogênicos
a partir de sementes. d: início da regeneração de plântulas em meio contendo agente
seletivo. e: etapa de enraizamento em meio contendo agente seletivo. f: aclimatação em
substrato.

BIBLIOGRAFIA
1. Faleiro, FG, Andrade, SRM., Reis-Junior, FB (2011). Biotecnologia: Estado da
Arte e Aplicações na Agropecuária. Embrapa Cerrados. 730 pp.
2. Martins PK, Ribeiro AP, Da Cunha BADB, Kobayashi AK, Molinari HBC
(2015). A simple and highly efficient Agrobacterium mediated transformation protocol
for Setaria viridis. Biotechnology Reports 6: 41–44.

PRÁTICA 3: Bioinformática

INTRODUÇÃO
FAMÍLIAS GÊNICAS: Identificação de genes utilizando ferramentas de
Bioinformática
Diversos genes são membros de famílias gênicas. Estes genes codificam
proteínas bastante similares que podem possuir funções diversas ou redundantes,
podendo ainda ter divergido durante o período evolutivo para serem produzidas de
diferentes maneiras, dependendo das condições fisiológicas das plantas. Para que se
possa entender a função de determinado ou gene ou mesmo modificar sua função em
plantas transgênicas, é necessária a caracterização de toda a família gênica do qual o
gene alvo é membro.
Por exemplo, em gramíneas como o milho, o arroz e a cana-de-açúcar, são
encontrados genes responsáveis pela produção de aciltransferases, proteínas que
promovem a modificação da parede celular vegetal. Em Setaria viridis, uma gramínea
utilizada como planta modelo, foram encontrados 10 membros destes genes,
denominados genes BAHD (BAHD01-BAHD10). A expressão de cada um destes genes
é variável, dependendo da fase de desenvolvimento e do tecido da planta (de Souza et
al., 2018).
Nesta aula, aprenderemos a identificar os genes BAHD em Setaria viridis,
baseando-se em ferramentas de Bioinformática.

Objetivos: Identificar os membros da família gênica BAHD aciltransferases em S.
viridis, utilizando banco de dados públicos. Além disso, as sequências nucleotídicas e
de aminoácidos identificadas serão alinhadas para a verificação das regiões conservadas
destes genes, o que nos proporciona uma poderosa ferramenta para testar o perfil de
expressão dos genes BAHD em gramíneas.

Procedimento:

PARTE 1. Identificação dos genes BAHD em Setaria viridis

1. Identifique os IDs dos genes BAHD previamente publicados em de Souza et al.,
2018 (Fig. 1; verificar bibliografia ao final deste tópico).
2. Para iniciar, visite a homepage https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#,clique
em Tools e então clique em Keyword Search.
3. Na próxima página digite, um a um, os códigos identificadores dos genes BAHD em
Setaria, nomeados como Sevir.XGNNNNNN na Fig. 1 do artigo. Comece pelo gene
BAHD01 (Sevir.4G238000) e prossiga sucessivamente. Marque a espécie desejada
do lado esquerdo da tela (Setaria viridis v.1.1) e clique em Go.
Figura 4. Plataforma Phytozome
https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html
29

Figura 5. Busca por genes, famílias e sequências.

4. Clique no ícone “G” (Go to Gene View) e então clique em Sequences.
5. Após, clique em Genomic Sequence, Transcript Sequence e CDS Sequence.
Compare cada uma das sequencias genômica, do transcrito e CDS. Discuta com seu
colega qual é a maior, qual é a menor, qual é a diferença entre elas. Qual delas foi
usada para a obtenção da sequencia peptídica (Peptide sequence)?
6. “Peptide sequence” deverá mostrar a sequência de aminoácidos correspondentes à
proteína codificada por este gene. O ícone CDS sequence refere-se à sequência de
nucleotídeos que compõem a região codificante do gene (iniciando-se sempre por
ATG).

Figura 6. Sequência de peptídeos

7. Copie e cole a sequência de aminoácidos no Bloco de Notas, nomeando cada um
dos genes BAHD da seguinte forma:
> BAHD01
M................(sequência)
> BAHD02
M.............(sequência)
Faça isso no mesmo arquivo do Bloco de notas para os 10 membros da família e salve o
arquivo como SvBAHD FASTA. O símbolo > designa os arquivos FASTA, que são
lidos desta forma pelos algoritmos dos softwares para alinhamento de sequências.

PARTE 2: Alinhamento das sequências das proteínas BAHD e identificação de
regiões conservadas

As sequências FASTA contidas no seu arquivo do Bloco de Notas serão
utilizadas para alinhar as sequências de aminoácidos dos 10 membros da família gênica
BAHD. Para tal, utilizaremos a ferramenta online ClustalW, encontrado na página
https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/. Você pode fazer o upload do arquivo
contendo as sequências no formato FASTA diretamente ou copiar e colar as sequências
desejadas na página. Após, clicar em SUBMIT, deixando o STEP 2 como se encontra
(default). Note que você está alinhando sequências de aminoácidos, portanto a primeira
caixa deve estar marcada como PROTEIN. Após alinhamento, copie os resultados e
identifique as regiões conservadas das proteínas, marcadas com asteriscos (***) abaixo
dos aminoácidos (uma região conservada satisfatória deve conter no mínimo 5
aminoácidos).
https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
31

Figura 7. Clustal Omega para alinhamento de sequências múltiplas

PARTE 3: Procura por domínios nas sequências de aminoácidos de BAHD.

Se temos pouca ou nenhuma informação sobre a função de uma determinada
proteína, uma alternativa é tentar identificar se a mesma pertence a alguma família de
proteínas já descrita ou procurar por domínios protéicos presentes na sua proteína. Para
isso, existem programas que podem auxiliar nessa identificação. Pfam e ProDom são
alguns deles.

A. Pfam
Pfam: é um banco de dados de famílias de proteínas que inclui sua anotação e
alinhamento de sequências múltiplas. A versão atual é o Pfam versão 32.0 que usa um
banco de dados de sequencias baseado no UniProt release 2018_04.
Ferramenta online – não é necessário baixar ou instalar softwares.
32

1. Para começar, visite a página https://pfam.xfam.org/ .Selecione “Sequence search”
no Menu.

2. Acesse seu arquivo .txt ou .doc onde você colou as sequencias das BAHDs de S.
viridis. Copie somente a sequencia de aminoácidos (sem o nome d sequencia) e cole
no local indicado para colar a sua sequencia. Clique em “ Go”.
Figura 8. Ferramenta online Pfam
Figura 9. Local onde inserir a sequência de aminoácidos no Pfam
https://pfam.xfam.org/
33

3. Analise o resultado da sua busca. Para armazenar essa informação, copie e cole em
um arquivo do word, powerpoint ou similar explicando qual foi a busca que você
fez: quem usou como query (anote a código de acesso e coloque o nome do arquivo
de onde você retirou essa sequencia), qual foi o programa que usou, a data em que a
busca foi realizada e de preferencia, qual foi a versão do banco de dados que usou.

B. ProDom
Uma outra ferramenta que pode ser utilizada para busca de domínios protéicos é
o ProDom. Neste exercício, vamos comparar a nossa sequência com o Prodom.
ProDom: é um banco de dados de famílias de domínios protéicos gerados
automaticamente do UniProt Knowledgebase (UniProtKB). O UniProtKB é um hub
central para a coleção de informação funcional de proteínas com uma anotação rica,
consistente e acurada.

1. Para utilizar o ProDom, acesse o endereço:
http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php .Clique na aba “Main form”.

Figura 10. Ferramenta online ProDom
http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php
34

2. Copie e cole a sua sequência de aminoácidos na caixa indicada (usar blast-p se usar
sequencia de aminoácidos ou blastx se DNA - usar CDS).

BIBLIOGRAFIA
DE SOUZA, W.R. et al. (2018). Suppression of a single BAHD gene in Setaria viridis
causes large, stable decreases in cell wall feruloylation and increases biomass
digestibility. New Phytologist 218: 81-93. DOI: 10.1111/nph.14970.

Figura 11. Local onde inserir a sequência de aminoácidos no ProDom
35

PRÁTICA 4: Extração de DNA genômico

INTRODUÇÃO
A extração e a purificação de ácidos nucléicos a partir de diversas amostras
experimentais (bactérias, fungos, tecidos vegetais e tecidos animais) é uma etapa
fundamental para se obter alta eficiência de amplificação nos protocolos que usam a
reação em cadeia da polimerase (PCR). Essa técnica tem sido amplamente empregada
em estudos moleculares, em razão da facilidade relativa com que é possível amplificar
in vitro regiões específicas do genoma de qualquer organismo. A PCR possibilita a
amplificação de sequências de DNA que estejam presentes em misturas complexas e
permite estudos de natureza variada, tais como desenvolvimento de métodos de
diagnóstico altamente sensíveis e específicos, obtenção de grandes quantidades de DNA
para sequenciamento e análises sobre a diversidade genética de populações, bem como a
caracterização molecular de plantas geneticamente modificadas.
Apesar da facilidade de amplificação de DNA possibilitada pela técnica de PCR,
existe a necessidade da adequada padronização dos protocolos a serem utilizados em
todas as fases dos procedimentos, desde a obtenção do ácido nucléico até a reação de
amplificação propriamente dita. O DNA, em sua forma original de dupla fita, apresenta
alta estabilidade e é muito resistente e se mantém inalterado em várias condições de
meio. No entanto, alguns cuidados são aconselháveis, para que seja evitada a
degradação das amostras obtidas em laboratório. A extração de DNA inclui basicamente
dois procedimentos principais: a lise das células presentes na amostra e a purificação do
DNA. Após a lise das células, o DNA deve ser separado dos restos celulares e das
proteínas, precipitado e suspenso em volume adequado de água ultrapura ou soluções-
tampão adequadas. As amostras de DNA podem também ser submetidas a processos de
concentração e de purificação, com a finalidade de se obter melhores resultados nas
amplificações.
Para cada tipo de amostra, vários protocolos podem ser testados, adaptados e
otimizados,de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade.
As amostras perecíveis devem ser acondicionadas de forma adequada até o
momento de serem submetidas à extração do DNA. Amostras de sangue e de outros
tecidos animais devem ser refrigeradas até chegarem ao laboratório. Amostras de
tecidos vegetais também devem ser cuidadosamente colhidas, armazenadas e
refrigeradas. As partes da planta devem ser lavadas e enxaguadas com água destilada ou
36

submetidas a processo de esterilização superficial, de acordo com o objetivo dos estudos
a serem realizados. Para melhor conservação, as amostras devem ser mantidas em
temperatura de –20°C a –80°C, dependendo do tempo de armazenamento.
Para utilização de amostras conservadas em estoque, é interessante o
fracionamento em pequenas alíquotas, para que o material não sofra descongelamentos
sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidação do tecido e para a degradação do
DNA. O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas,
para que uma parte dos ácidos nucléicos não sejam degradados por nucleases, enzimas
que normalmente estão presentes nos fluidos corporais liberados principalmente nas
mãos das pessoas.

Objetivo: Realizar a extração do DNA genômico de Setaria viridis utilizando-se o
protocolo de extração por CTAB.

Material
- Balança analítica (1/lab)
- Centrífuga para microtubos
- N2 líquido
- Jogo de pipetas automáticas (P20, 200, 1000)
- Cadinho e pistilo
- Freezer -20oC
- Eppendorfs de 2 mL (4/aluno)*
- Banho de gelo (1/aluno)
- Banho-Maria a 65oC (1/lab)
- Termobloco a 37oC (1/lab)
- Tampão de extração CTAB (40 mL é suficiente para 40 alunos)
- Clorofórmio : álcool isoamílico (24:1) (80 mL é suficiente para 40 alunos)
- Isopropanol gelado (25 mL é suficiente para 40 alunos)
- Álcool 70% (MB grade) gelado (50 mL)
- Etanol 95% (MB grade) gelado (50 ml)
- Tampão TE (10mL)
- RNase (10 mg/mL)
- Ponteiras para P20, 200 e 1000*

* Tubos e ponteiras devem ser autoclavados e preferencialmente novos.

Procedimento:

1. Pesar 100 mg do tecido vegetal (a quantidade de tecido vegetal pode chegar a até 3
g).
2. Macerar com auxílio de nitrogênio líquido, até que a amostra esteja pulverizada.
3. Colocar a amostra em microtubo de 2 mL e adicionar 700 µL de solução-tampão de
extração vegetal e homogeneizar durante dez minutos por inversão.
4. Incubar as amostras em banho-maria a 65ºC por uma 45 minutos, homogeneizando
algumas vezes.
5. Retirar do banho-maria e deixar a temperatura da amostra se igualar à temperatura
ambiente.
6. Adicionar 700 µL de solução de clorofórmio e de álcool isoamílico (24:1), e
homogeneizar suavemente.
7. Centrifugar a 5.000 g por dez minutos em temperatura ambiente, para separar a fase
orgânica e a fase aquosa.
8. Remover a fase aquosa (superior) para um novo micro tubo, evitando tocar a
interface com a ponta da ponteira.
9. Repetir a extração com solução de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1) mais uma
ou duas vezes, considerando que maior número de extrações pode purificar mais o
DNA, porém com alguma perda.
10. Após a remoção final do sobrenadante, adicionar 500 µL de isopropanol (gelado),
equivalente a aproximadamente 2/3 do volume coletado. Homogeneizar suavemente.
11. Manter a –20ºC por dois minutos (para evitar a precipitação de polissacarídeos).
12. Centrifugar a 8.600 g por dez minutos.
13. Descartar o sobrenadante.
14. Lavar o pellet uma vez com etanol a 70%.
15. Lavar novamente o pellet com etanol a 95%.
16. Deixar secar por uma hora.
17. Ressuspender em 50 a 100 µL de tampão TE (pode-se adicionar RNAse A na
concentração final de 10 μg/mL de amostra).
18. Incubar a 37ºC por uma hora.
19. Manter a -20ºC.
38

BIBLIOGRAFIA

1. Marcia Cristina de Sena Oliveira et al. (2007). Fundamentos teórico-práticos e
protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio de reação em cadeia de
polimerase. São Carlos: Embrapa Pecuária Sudeste. Acesso:
www.cppse.embrapa.br/servicos/publicacaogratuita/e-books/LVFundDNA.pdf

PRÁTICA 5: Caracterização molecular de plantas transgênicas:
reação em cadeia da polimerase (PCR)

INTRODUÇÃO

Como já mencionado anteriormente, a reação em cadeia da polimerase (PCR, do
inglês polymerase chain reaction) tem sido amplamente empregada em estudos
moleculares, em razão da facilidade relativa com que é possível amplificar in vitro
regiões específicas do genoma de qualquer organismo. A PCR apresenta ampla gama de
aplicações em vários ramos da pesquisa científica. Essa reação possibilita que
determinada região do genoma de qualquer organismo seja multiplicada em milhões de
cópias, o que facilita a análise genética e permite o desenvolvimento de técnicas de
diagnóstico muito mais sensíveis e mais específicas do que as tradicionalmente
utilizadas. A alta sensibilidade, a especificidade, a facilidade de execução e a análise de
grande número de amostras simultaneamente fazem dessa técnica uma opção atrativa
para a caracterização molecular de um grande número de eventos de plantas
transgênicas. Os elementos envolvidos nessa reação são basicamente os mesmos
componentes do processo de replicação que ocorre nas células vivas. A solução em que
ocorre a reação (master mix), é preparada em banho de gelo e colocada em microtubos
de plástico esterilizados. São componentes da PCR:
a) Amostra de DNA que contém o segmento a ser amplificado, também chamado de
DNA molde (do inglês, template DNA) que pode ser DNA genômico, DNA
plasmidial ou DNA complementar (cDNA).
b) Mistura que contenha os nucleotídeos (dNTPs: dATPs, dTTPs, dCTPs e dGTPs)
necessários para a síntese das novas fitas de DNA.
c) Enzima DNA-polimerase, que é responsável pela síntese das novas fitas de DNA
(Taq-DNA-polimerase) em solução-tampão.
d) Cloreto de magnésio, co-fator da enzima DNA polimerase.
e) Dois iniciadores ou primers, que são pequenas seqüências conhecidas de DNA
(oligonucleotídeos, usualmente de 18 a 25 nucleotídeos), que delimitam e são
complementares à região-alvo de amplificação. Os primers são sintetizados em
laboratórios especializados, sob encomenda, e após a sua diluição são mantidos a -
20°C.
40

A PCR pode ser feita em tubos de 0,5 mL ou de 0,2 mL ou em placas,
empregando-se volume total de 25 µL, sendo 20 µL de master mix e 5 µL da amostra de
DNA a ser analisada. Outras variações de volume têm sido utilizadas em diferentes
trabalhos científicos, como por exemplo 10 µL de master mix e 2,5 µL de DNA. O
volume das reações pode ser reduzido ou aumentado, desde que as concentrações
adequadas de todos os componentes da reação sejam mantidas.
Para que ocorra a amplificação, com a síntese de novas fitas de DNA, as
amostras devem ser submetidas à combinação adequada de temperatura e de tempo.
Cada ciclo da PCR apresenta três fases fundamentais, que são: desnaturação,
anelamento e extensão. Essas fases ocorrem em temperaturas diferentes e são
programadas no aparelho chamado termociclador, onde as amostras são incubadas. Na
hora de preparar o programa para a amplificação, devem estar estabelecidos a
temperatura e o tempo exato de cada uma dessas fases e também o número de repetições
dos ciclos:
a) Desnaturação: é a fase na qual o DNA perde sua estrutura de dupla hélice por meio
da elevação da temperatura (para cerca de 94°C a 95°C)“quebrando” as pontes de
hidrogênio entre as duas fitas anti-paralelas do DNA fazendo com que a molécula de
DNA fique na forma de fita simples. Isso permite que os primers tenham acesso à
região complementar à sua seqüência na amostra de DNA molde. A desnaturação
mais longa (hot start) no primeiro ciclo pode ser utilizada com a finalidade de
otimizar essa fase, permitindo o melhor anelamento dos primers. O DNA genômico
permanece desnaturado por todos os ciclos subseqüentes, porque as fitas
complementares estão em concentrações muito baixas, o que impede a sua reunião.
Os oligonucleotídeos ou primers, por sua vez, estão em concentrações muito altas
no master mix, fato que facilita o encontro das regiões complementares
(anelamento). Além disso, o tamanho das fitas de DNA molde são muito grandes
dificultando muito o reanelamento com a sua fita complementar. Já os primers são
muito menores o que facilita o encontro e anelamento com regiões complementares.

b) Anelamento: Uma vez desnaturado o DNA, a temperatura da reação é reduzida
para uma temperatura ótima, que varia para cada par de primer. Dessa forma, cada
primer se “encaixa” nas respectivas seqüências complementares à região-alvo da
amplificação. A determinação da temperatura de anelamento para um par ou
41

conjunto de primers pode ser feita com o auxílio de programas de computador
específicos para essa finalidade. A temperatura de anelamento depende, entre outros
fatores, do tamanho do primer e de sua seqüência de nucleotídeos (incluindo a
quantidade de GC na sequência). O Tm do primer (do inglês, melting temperature) é
a temperatura onde 50% das moléculas do primer estão como fita simples (ou seja,
desnaturadas) e 50% estão como fita dupla. Em última análise, o Tm do primer
indica a estabilidade daquele duplex de DNA em particular. Ou seja, cada primer
possui um Tm específico e, portanto, o Tm dos dois primers a serem utilizados em
uma reação de PCR devem ser próximos. Para a escolha da temperatura de
anelamento da reação de PCR, também chamada de Ta (do inglês, annealing
temperature), usualmente se usa uma temperatura 5-7oC abaixo do primer com o
menor Tm.

c) Extensão: A temperatura é elevada até cerca de 72°C, para que a enzima DNA
polimerase (Taq DNA polimerase) se posicione junto aos primers que se anelaram
anteriormente e, com o auxílio de íons de magnésio (Mg2+), seja iniciada a síntese
da nova fita. A síntese da nova fita de DNA se inicia a partir dos primers ou
iniciadores, onde os nucleotídeos (dNTPs) adicionados ao tampão são incorporados
ao primer formando a fita nascente, sempre complementares à fita-molde. Dessa
maneira, são formadas novas fitas de DNA de dupla hélice, correspondente a região-
alvo de amplificação (delimitada pelos primers). O Mg2+ atua como co-fator da
DNA polimerase além de facilitar a formação do complexo entre primers e DNA
molde, estabilizando as cargas negativas dos grupos fosfato. Dessa forma, quanto
maior a quantidade de Mg na reação, mais fácil será a formação do complexo
primer-DNA molde e portanto, mais eficiente será a polimerização da nova fita. Por
outro lado, altas concentrações de Mg2+ acabam diminuindo a especificidade de
ligação do primer ao DNA molde propiciando amplificações inespecíficas do DNA.
Usualmente, usa-se entre 1-4 mM de Mg2+ na reações, mas a concentração ótima
varia para cada reação de PCR.

Após o término de um ciclo (desnaturação, anelamento e extensão), todo o
processo é repetido várias vezes (em geral de 30 a 40, usualmente 35 vezes), até que se
obtenha grande quantidade da região alvo do DNA a ser amplificado. A cada ciclo de
42

amplificação, o número de cópias da seqüência-alvo é duplicado e, com a progressão
dos ciclos durante a reação, ocorre aumento exponencial do número dessas seqüências.

Objetivos: Realizar a caracterização molecular das plantas transgênicas através da
técnica de PCR.

Material
- Termociclador (1 com capacidade para pelo menos 40 tubos)
- Microtubos de 200 µL e estantes para suporte (1 tubo/aluno)*
- Reagentes para PCR (Ítem 5 do procedimento)
- Banho de gelo (1/aluno)-
- Álcool 70%
- Luvas descartáveis
- Jogo de pipetas automáticas (P2 e P10)
- Ponteiras para P2 e P10 autoclavadas e secas*
- DNA (preparado na prática anterior)
- Água ultrapura autoclavada (aliquotar 5 mL/bancada)
- caneta marcadora de ponta fina
* Tubos e ponteiras devem ser novos, autoclavados e secos.

Procedimento

PARTE 1: Reação em cadeia da polimerase (PCR)
1) Separar as amostras de DNA, preparar banho de gelo para os microtubos e
retirar os reagentes do master mix do congelador. As amostras de DNA não devem
ter contato com os reagentes do master mix.
2) Limpar a bancada com álcool.
3) Lavar as mãos e colocar luvas novas.
4) Marcar os microtubos para PCR (microtubo de 0,2 mL).
5) Preparo do master mix para PCR:

Tabela 4. Preparo do master mix para PCR. Obs.: Complete a tabela com a quantidade
equivalente de reagentes de acordo com o número de amostras a serem analisadas.

Reagentes Conc. Final/ tubo 1 x
s/ Mg
1 x
c/ Mg
1x
c/ ++Mg
nX
H2O ultrapura - ____µL ____µL ____µL
Tampão 10x
sem Mg
Concentração final 1x 1,25 µL 1,25 µL 1,25 µL
50 mM MgCl2 1-5 mM (em geral 1,5 mM) - 0,375 µL 1,25 µL
10 mM dNTP 0,2 mM 0,25 µL 0,25 µL 0,25 µL
10 µM Primer
Fwd
0,05-1µM (em geral 0,1 a 0,6
µM)
0,5 µL 0,5 µL 0,5 µL
10 µM Primer
Rev
0,05-1µM (em geral 0,1 a 0,6
µM)
0,5 µL 0,5 µL 0,5 µL
Taq Pol (5U/µL) 0,5-3,5 U/50µL (em geral
1,25U/50µL)
0,15 µL 0,15 µL 0,15 µL
Vol Total 12,5 µL 12,5 µL 12,5 µL

6) Distribuir 10 µL do master mix por microtubo de 0,2 mL (PCR).
7) Adicionar 2,5 µL de DNA por tubo com o master mix (em local isolado, para
evitar contaminações).
8) Preparar o programa no termociclador, indicando as temperaturas de
desnaturação, de anelamento e de extensão, e incubar as amostras, de acordo com o
esquema da Fig. 13.

Figura 12. Demonstração esquemática da programação dos ciclos da PCR com
temperatura e tempos de desnaturação, de anelamento e de extensão.

BIBLIOGRAFIA
Marcia Cristina de Sena Oliveira et al. (2007). Fundamentos teórico-práticos e
protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio de reação em cadeia de
polimerase. São Carlos: Embrapa Pecuária Sudeste.
Acesso: www.cppse.embrapa.br/servicos/publicacaogratuita/e-books/LVFundDNA.pdf

http://www.cppse.embrapa.br/servicos/publicacaogratuita/e-books/LVFundDNA.pdf
45

PRÁTICA 6: Eletroforese em gel de agarose

INTRODUÇÃO

Eletroforese é um método simples e muito eficiente para separar, para identificar
e para purificar fragmentos de DNA e de proteínas. Ela consiste na separação de
moléculas ionizadas (aminoácidos, peptídeos, proteínas - incluindo lipoproteínas e
glicoproteínas -, nucleotídeos, ácidos carboxílicos e outras substâncias de relevância
biológica), de acordo com sua carga elétrica e seu peso molecular. Moléculas com carga
negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram
para o pólo negativo (cátodo). Para haver migração, é preciso desequilibrar
eletricamente duas regiões extremas de um meio que contenha eletrólitos, no qual esteja
dissolvida ou dispersa uma substância com potencial para migrar.
Para tanto, é estabelecida a diferença de potencial entre dois eletrodos ligados
aos terminais de uma fonte de corrente contínua e dispostos em dois compartimentos,
catódico e anódico; ambos os compartimentos contém, em geral, uma solução-tampão.
O meio físico de separação,igualmente tamponado, se comunica através de suas
extremidades com as soluções-tampão dos eletrodos, fechando assim o circuito elétrico.
A corrente elétrica, ao passar pelo meio, conduzida pelos pequenos íons
presentes na solução, dá ensejo ao deslocamento, por exemplo, de partículas protéicas
carregadas para determinado polo. Pelo fato de as proteínas serem substâncias anfóteras,
ou seja, capazes de adquirirem carga positiva ou negativa de acordo com o pH, é
indispensável manter constante o pH do meio durante a eletroforese, por meio do uso de
soluções-tampão.
Os ácidos nucléicos, por possuírem carga total negativa (em decorrência do
grupamento fosfato), migram sempre em direção ao polo positivo (ânodo). O sistema
tampão usado consiste em duas partes: o tampão usado na preparação do gel e o tampão
da cuba eletrolítica, na qual se encontram os eletrodos (ânodo e cátodo). Nos tampões
das cubas e do gel, a corrente elétrica é conduzida por íons, e nos eletrodos, por
elétrons. Na presença de um sistema tampão adequado, a hidrólise da água, que se dá na
superfície dos eletrodos, permite a troca entre elétrons e íons. O sistema tampão pode
ser contínuo (o mesmo tampão é utilizado no gel e nos eletrodos) ou descontínuo
46

(quando diferentes composições ou concentrações de tampão são utilizadas no gel e nos
eletrodos).
O principal fator a ser considerado na escolha do tampão é a sua capacidade de
tamponamento. Os dois tampões mais usados na separação eletroforética de moléculas
de DNA são TAE (tampão tris-acetato-EDTA) e TBE (tampão tris-borato- EDTA).
Esses dois tampões possuem efeito ligeiramente diferente na mobilidade do DNA.
Apesar de o TAE ser mais utilizado, ele é mais facilmente exaurido durante reações
longas ou com alta voltagem. O TBE tem melhor capacidade tamponante, mas deve ser
evitado para purificação de DNA de géis.
A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou
em diferentes meios de suporte, tais como papel-filtro, sílica-gel, membranas de acetato
de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida. O suporte deve ser química e
fisicamente inerte, de modo a não interferir na mobilidade das moléculas. Em relação
aos géis de agarose ou à poliacrilamida, a porosidade do gel determina o poder de
resolução das bandas e este geralmente é decorrente do grau de polimerização entre os
monômeros.

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
Quanto ao gel de agarose, o protocolo pode ser dividido em três estágios:
a) O gel é preparado com agarose na concentração adequada ao tamanho dos fragmentos
de DNA a serem separados.
b) As amostras de DNA são aplicadas nos pocinhos do gel. A voltagem e o tempo são
estabelecidos de modo a propiciar a separação ideal das amostras.
c) O gel é corado e, se o brometo de etídio tiver sido incorporado, as seqüências de DNA
serão visualizadas na presença de luz ultravioleta.
Três fatores principais afetam a migração do DNA através do gel de agarose: a
concentração de agarose (Tabela 5), a conformação do DNA e a intensidade da corrente
elétrica aplicada.

Tabela 5. Limites de eficiência da separação de DNA em diferentes concentrações de
agarose.

Objetivos: Analisar os resultados da reação de PCR em gel de agarose.

Material
- Cuba e fonte para eletroforese (2/laboratório)
- Amostras das reações de PCR realizadas na prática 5
- Marcador de peso molecular de DNA 1 Kb
- Estantes para suporte
- Agarose e material para pesagem da agarose (balança, espátula, etc /laboratório)
- Brometo de etídio (10 mg/mL) ou outro agente marcador de DNA (GelRed,
SYBRSafe ou similar)
- Erlenmeyer de 250 mL (2/laboratório)
- Tampão TBE 1X (volume vai depender do tamanho da cuba)
- Luvas
- Loading buffer para DNA
- Jogo de pipetas automáticas (P20)
- Microondas
- Fotodocumentador
- Água ultrapura autoclavada
- Tubos eppendorf 1,5 mL autoclavdos (1/aluno) e pedaço de parafilme (parafilm
mesmo - não serve filme de PVC tipo magipack
48

- Transiluminador

Procedimento

Para a análise dos produtos de PCR em géis de agarose, a concentração do gel
deve ser escolhida de acordo com o tamanho do produto amplificado (Tabela 5).
Gel a 1%: 0,3 g de agarose para 30 mL de gel, que deve ser preparado com tampão tris-
borato-EDTA 1 X. Para isso, aplicar 5 µL de produto de amplificação + 1 µL de
loading buffer (tampão de corrida).

1. Pesar 0,3 g de agarose.
2. Colocá-la em um erlenmeyer que contenha o volume necessário de tampão TBE
1X.
3. Aquecer no forno de microondas, até iniciar a ebulição (aproximadamente trinta
segundos em potência média para gel de 30 mL). Agitar o frasco e retornar ao forno
de microondas por mais alguns segundos.
4. Aguardar a redução da temperatura para aproximadamente 60°C e adicionar
brometo de etídio, na quantidade indicada para cada gel. Pode ser necessário
acrescentar água destilada, para repor aquela perdida por evaporação.
5. Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes.
6. Após a solidificação, colocar o gel na cuba de eletroforese e cobrir com tampão
TBE 1X.
7. Aplicar as amostras acrescidas de tampão de corrida e estabelecer a corrente de
acordo com o tamanho do gel.
8. A eletroforese deve ser realizada em TBE 1 X, em voltagem constante, na faixa
de 2 a 5 V/cm (considerando a distância entre os eletrodos). Caso o fundo do gel
esteja muito corado, pode-se lavar o excesso de brometo por submersão em TBE 1X
por cinco a dez minutos.
9. Após ~ 30 min, observador o gel em um transiluminador.

CUIDADOS
O brometo de etídio é um potente agente mutagênico. Usar luvas e máscara para
preparar a solução de estoque e para manipular os géis.
49

A luz ultravioleta produz queimaduras severas. Usar máscara e óculos de
proteção adequados.

BIBLIOGRAFIA
Joseph Sambrook; David Russell (2000). Molecular Cloning: a Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press.

PRÁTICA 7: Extração de RNA

INTRODUÇÃO

As moléculas de ácido ribonucleico (RNA) são polímeros basicamente
constituídos por quatro tipos de nucleotídeos que diferem quanto às bases nitrogenadas.
Quando comparado ao DNA, o RNA apresenta duas diferenças básicas no que se refere
à composição química: (i) enquanto o açúcar do DNA é a desoxirribose, no RNA o
açúcar presente é a ribose, que possui um grupo hidroxila (OH) adicional; (ii) a base
pirimídica uracila (U) está presente no lugar da timina (T).
O RNA é basicamente uma molécula de fita simples onde os nucleotídeos estão
covalentemente ligados entre si através de ligações fosfodiéster 3’- 5’. Entretanto,
quando em solução, o RNA pode apresentar uma arquitetura tridimensional definida e
complexa, determinada pelo dobramento da molécula sobre si mesma, formando regiões
de dupla hélice em locais onde há sequências de bases complementares. Essa
propriedade de formar regiões de dupla-hélice por meio de dobramentos é fundamental
para uma série de atividades biológicas executadas pelas moléculas de RNA. A Figura
13 representa uma comparação entre as moléculas de RNA e DNA.
No final de 1953, os pesquisadores adotaram como hipótese de trabalho a idéia
de que o DNA atuaria como molde para a síntese do RNA, cujas moléculas, nos
eucariontes, migrariam para o citoplasma onde iriam determinar o arranjo dos
aminoácidos nas proteínas. Este esquema (Figura 14) para o fluxo de informação
genética foi denominado dogma central da Biologia, por Francis Crick em 1956.
51

Figura 13. Comparação entre as moléculas de RNA (fita simples) e DNA (fita dupla).

Figura 14. O dogma central da biologia. A informação genética é perpetuada por
meio da replicação do DNA. Essa informação é expressa em um processo de dois
estágios: 1. A transcrição origina