Relatorio biologia molecular BRUNA finalizada (pdf.io)

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UNIVERSIDADE PAULISTA-UNIP
RELATORIO DE AULA PRÁTICA
CURSO: BIOMEDICINA
NOME: Bruna Regina Evangelista 
DISCIPLINA: Biologia Molecular Aplicada a Biomedicina
RA: 2016566 
AULA: 5 e 12 de novembro de 2022
POLO: Madeira 
1
INTRODUÇÃO 
Este relatório tem como objetivo sintetizar todo o aprendizado teórico/prático
adquirido nas duas aulas de biologia molecular que foram ministradas pelo professor
ao qual realizou partes da aula explanando o conteúdo teórico e prático, no qual
objetivou o embasamento teórico básico para excelência na execução. Partindo do
pressuposto que, com as aulas prática o aluno obteve pleno conhecimento da
importância e manuseio de pipetas que fazem diferenças constante no uso e no
decorrer dos experimentos, pois diversos problemas na prática são decorrentes a
erro de pipetarem ou até mesmo em quantidades. Isto posto, tivemos amplos
conhecimento em fazer conversões de quantidades e substâncias, que em seguida
na prática realizando essas conversões diretamente na pipeta. Além de saber
manusear o equipamento, também realizamos estudo para extração de DNA, onde
tivemos a oportunidade de extrair do morango e da E. coli, propiciando um
engajamento para depois utilizarmos softwares que atualmente facilitam essa
codificação genética e possibilita fácil acesso a vasto conhecimento da doença em
estudo. Portanto, é evidente que a disciplina de biologia molecular é de extrema
importância para a vivência biomédica, pois “permitem, entre outras ações, obter
cópias de segmentos de DNA, comparar sequências de DNA entre amostras e
detectar proteínas. Por analisar as mutações genéticas, a biologia molecular,
inclusive, tem sido cada vez mais utilizada para o diagnóstico e acompanhamento de
doenças” (CRBM-5, 2020). 
AULA 1 – ROTEIRO 1 – USO DE MICROPIPETADORES
OBJETIVO: Aprender a utilizar e reconhecer a importância dos micropipetadores.
RESULTADO: Nessa aula prática de laboratório, evidenciando a importância do uso
correto de pipetas, pois como já sabemos que quantidades pequenas para ensaios e
pesquisas são necessárias serem administradas com precisão, no qual um
experimento pode apresentar erros nos dados obtidos devido a problemas de
“pipetagem”. Sendo assim, foi fundamental as dicas e orientações passadas pelo
2
professor, sobre a importância de atentar-se as unidades de medidas, pois um
pequeno descuido podemos utilizar mais substância ou amostra do que desejado
para o experimento. É de extrema importância que seja executada com precisão,
onde “os instrumentos de medição são fundamentais em laboratórios que
necessitem de aferições exatas de volumes, o que garante a qualidade dos
resultados das análises. Portanto, também é necessário escolher a pipeta
adequada, pois há diversas pipetas e seus respectivos volumes. É imprescindível
que a pipeta esteja calibrada e seja de fácil manuseio, visando evitar imprecisão nos
experimentos e possíveis contaminações. Dessa forma, identificamos todas as
pipetas que tínhamos na bancada e verificamos seus volumes. (Béquer com águas
estavam na bancada disponível). Na bancada tínhamos a P.10 que correspondia de
0,5 a 10μL, a P.1000 que correspondia de 100 a 1000μL, e a P.5000 que
correspondia 1000 a 5000μL. Vale ressaltar, que após identificá-las em seus
volumes pertinentes, pipetamos as substâncias, para exercitar o manuseio e
pipetagem e a regulagem das quantidades, tomando todos os cuidados necessários,
pois temos que atentarmos as suas quantidades máximas para que não ultrapasse o
valor máximo e travamos a pipeta. Contudo, seguindo todas as dicas,
recomendações e com bastante cuidado conseguimos realizar a pipetagem com
êxito. (CÂMARA, 2014)
 Imagem 1. Pipeta P 10μL. Imagem 2. Pipeta P 1000μL Imagem 3. Pipeta P 5000μL
 
 
Atividades: 
Fonte: Imagens aula prática, 2022
Atividades:
Observe as pipetas disponíveis no laboratório e complete a tabela a seguir
identificando a pipeta e qual o intervalo de volume que pode ser coletado.
3
 Identificação da pipeta Intervalo de volume
 P10μL 0,5μL a 10μL
 P100μL 100μL a 1000μL
 P5000μL 1000μL a 5000μL
Escolha, dentre as pipetas disponíveis no laboratório, a pipeta adequada para
coletar os volumes a seguir. Anote, ao lado, a sua escolha.
 1,5 μL P10 1000 μL P1000
 12 μL P100 200 μL P200 ou P1000
 576μL P1000 1 mL P 1000
 0,001mL P10 0,5 mL P 1000
 0,02 mL P100 1 μL P 10
Faça a pipetagem dos volumes listados no exercício 2 e observe.Foram
observados as pipetagem conforme solicitado. Utilização de micropipetas com
volumes entre 1-20 µL. 
Procedimento: identifique os microtubos, marcando A, B e C. Prepare os tubos
conforme o quadro a seguir:
 Tubo Solução 1 Solução 2 Solução 3 Solução 4
A 5 µL 2,5 µL 2 µL 0,5 µL
B 5 µL 1,5 µL ----- 3,5 µL
C 5 µL ----- 1 µL 4 µL
Um total de 10 µL foi adicionado a cada tubo; para verificar se a pipetagem foi
correta, ajuste a pipeta P10 para 10 µL e, cuidadosamente, meça o volume de cada 
tubo. Usamos a pipeta P10, para esse experimento do tubo A. Seguimos com o 
resultado do tubo A.
4
Como estava preenchida a ponteira? A ponteira obteve ar
Algum espaço com ar? Sim
Ficou algum volume no tubo? Não
Houve alguma diferença? Sim
Qual explicação você daria? Pipetagem errada.
Resultado do tubo B e C, ambos tiveram o mesmo resultado.
Qual explicação você daria? Correta
Algum espaço com ar? Não
Ficou algum volume no tubo? Não
Houve alguma diferença? Não
Qual explicação você daria? Pipetagem correta.
Utilização de micropipetas com volumes entre 100-1000 µL. 
Procedimento: identifique os microtubos, marcando D, E e F. Prepare os tubos
conforme o quadro a seguir:
 TUBO Solução 1 Solução 2 Solução 3
 D 100 µL 400 µL 500 µL
 E 150 µL 250 µL 600 µL
 F 200 µL 350 µL 450 µL
Foi adicionado um total de 1000 µL a cada tudo, e obtivemos os seguintes 
resultados:
Tudo D, sobrou 1/5 µL.
Tudo E, ok
Tubo F, obteve ar.
Comparamos o experimento com outros grupos, e todos tiveram o mesmo 
erro de pipetagem. Concluímos que quanto maior o volume, menor serão as 
chances de erros.
5
AULA 2 – ROTEIRO 1 – EXTRAÇÃO DE DNA – PARTE 1
OBJETIVO: Os princípios da extração de DNA. Os morangos são plantas da espécie
fragaria e são incluídos como parte de seres vivos, possuem DNA que define suas
características.
RESULTADOS - Procedimento de Extração do DNA do Morango:
 Após ter exercitado a conversão de unidades e pipetagem, fizemos a
extração do DNA do morango, que inicialmente tiramos os cabinho dos morangos,
para facilitar no processo de maceração mecânica, no qual acrescentamos 15mL ao
morango macerado uma substancia química chamada “Lise” que contem detergente,
água (H2O) e Sal (NaCl), com o objetivo de emulsificar as gorduras da camada
celular, rompendo a célula e deixando exposto o DNA, após obter uma boa
maceração com a “Lise” passamos em um funil com gazes para realizar uma
espécie de filtragem, propiciando a obtenção apenas do extrato do morango com a
substancia. Em seguida colocamos esse extrato obtido no béquer, e acrescentamos
álcool absoluto gelado (2x a quantidade de extrato colocado no béquer), foi
orientado aguarda de 5 a 10 minutos para o acontecimento da reação, porém
imediatamente conseguimosvisualizar a reação de extração do DNA do morango,
onde o DNA começou a se aglomerar na superfície devido a ação da 
“Lise” e o álcool que por vezes podem agir como polares e apolares
(dependendo do ambiente que se encontra). Pois, “morangos maduros também
produzem pectinases e celulases, que são enzimas que degradam a pectina e a
celulose (respectivamente), presentes nas paredes celulares das células vegetais.
Além disso, os morangos possuem muito DNA: eles possuem 8 (oito) cópias de
cada conjunto de cromossomos que são octoplóides” (FIOCRUZ, 2003). 
Também fizemos a extração de DNA da E. coli que é bem parecido com o
processo mencionado acima, porém existe algumas particularidades como a
preparação de cultura da E. coli que foi realizada um dia antes pela equipe técnica
da universidade e deixada em overnight para que esteja pronta para nosso
experimento. O falcon com 10mL de E. coli foi levada para a centrifuga à 3400Rmp
por 8 minutos (colocamos incialmente 5 minutos e depois mais 3 minutos, pois como
a potência da centrifuga não é muito alta, foi necessário estender um pouco o tempo
6
de centrifugação), em seguida descartamos o meio de cultura, lembrando que após
a centrifugação, no fundo do falcon forma uma espécie de pellet. Depois
acrescentarmos 7mL de Dodecil sulfato de sódio que é um solvente orgânico
também conhecido como SDS (detergente), no qual posteriormente colocamos em
banho-maria por 10 minutos à 60°C e depois deixando por 5 minutos em
temperatura ambiente. Colocamos no falcon clorofórmio e homogeneizamos
bastante por alguns instantes, sendo necessário colocar novamente na centrífuga,
ao qual depois tiramos o líquido e colocamos em uma proveta, acrescentamos 2
vezes a quantidade do líquido transferido para a proveta de etanos resfriado, para
que ocorra a extração do DNA. No caso da E. coli o tempo de espera do processo
obter resultado é de 10 a 20 minutos, com grande probabilidade de erros, pois
podemos observar que esse é um processo complexo e mais preciso do que a
extração do DNA do morango. Porém, com aproximadamente 15 minutos podíamos
observar bem suavemente e quase imperceptível que houve realmente a separação
do DNA. Foi de extrema importância a presença do sal para neutralizar a amostra e
atenção especiais nos processos de centrifugações, temperatura do banho-maria e
volumes, por isso que “várias metodologias descritas para extração do DNA
bacteriano são normalmente demoradas e de alto custo” (BONATTO, BREVE, &
TEJADA, 2014). 
Imagens do processo de extração do DNA do morango:
 Imagem 4. Morango Imagem 5. Morango macerado Imagem 6. Filtragem 
 
7
 Imagem 7. Proveta de 50ml/ Extração do DNA Imagem 8. DNA morango
 
Fonte: Imagens aula prática, 2022
PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO DO DNA DA CEBOLA 
O procedimento é bem parecido com o processo mencionado acima. Pique a
cebola em pedaços bem pequenos para facilitar no processo de maceração
mecânica, coloque 10 ml de detergente e uma pitada de sal (1 colher de café), em
20 ml de água num copo, e misture bem até sua total dissolução. Vamos colocar a
cebola macerada no Becker com a solução de detergente e leve ao banho maria
por, exatamente, 15 minutos, a 60 ºC, passando os 15 minutos vamos retirada do
banho maria direto para um vasilhame com gelo por cerca de 5 minutos, mexendo
periodicamente, em um funil com filtro de papel. filtramos o experimento em uma
proveta de 50 ml, logo seguimos colocando lentamente e pela borda do Becker,
cerca de 20 ml de álcool etílico comercial gelado. Esperamos alguns minutos.
Bolhas foram se formar e o DNA precipitou, pegamos o bastão de vidro e colocamos
no experimento fazendo movimentos circulares cuidadosos. Não mexer muito as
camadas para não quebrar as moléculas de DNA, os “fios” esbranquiçados e
grudentos formados são aglomerados de muitas moléculas de DNA e ficarão presos
na ponta do bastão de vidro.
Imagens do processo de extração do DNA da cebola:
8
Imagem 9. Cebola macerada Imagem 10. Cebola em Banho-maria Imagem 11. Resfriamento
 
Imagem 12. Filtragem Imagem 13. DNA da cebola
 
Fonte: Imagens aula prática, 2022
Questões:
1. Por que é necessário macerar o morango e picar a cebola? 
R: Precisa ser macerado e picado para que os produtos químicos utilizados para a
extração cheguem mais facilmente em todas as suas células.
2. Em que etapa do procedimento ocorre o rompimento das membranas das
células do morango? Explique.
R: Na etapa 4. Os detergentes são normalmente empregados para dissolver
gorduras ou lipídios. Como a membrana celular tem em sua composição química
uma grande quantidade de lipídios, sob a ação do detergente, estes se tornam
solúveis e são extraídos junto com as proteínas que também fazem parte das
membranas. 
3. Qual é a função do sal de cozinha?
9
R: O sal de cozinha ou NaCl (cloreto de sódio) fornece íons que são necessários
para a fase de precipitação do DNA (veja complementação na resposta seguinte).
4. Qual é o papel do álcool? 
R: O DNA extraído das células do morango encontra-se na fase aquosa da mistura,
ou seja, dissolvido na água. Na presença de álcool e de concentrações
relativamente altas de Na+ (fornecidas pelo sal de cozinha) o DNA sai de solução,
isto é, ele é precipitado. O precipitado aparece na superfície da solução, isto é, na
interface entre a mistura aquosa e o etanol.
5. Por que você não pode ver a dupla do DNA extraído? 
R: A molécula de DNA pode ser extremamente longa, mas seu diâmetro é de
apenas 2 nanômetros, visível apenas em microscopia eletrônica. Assim sendo, o
que se vê após a precipitação é um emaranhado formado por milhares de moléculas
de DNA.
6. Considerando os procedimentos da extração do DNA genômico, você espera
obtê-lo sem as quebras mecânicas e/ou químicas?
R: O DNA genômico é formado por moléculas muito longas (lembre-se que cada
cromossomo é formado por uma única molécula de DNA). Por exemplo, o maior
cromossomo humano possui 263 milhões de pares de bases. Assim sendo, é
praticamente impossível extrair o DNA sem que inúmeras quebras mecânicas
ocorram durante os procedimentos de extração.
7. Qual é a função do detergente? 
R: A função do detergente é desestruturar as moléculas de lipídios presentes nas
membranas, causando sua ruptura e deixando todo o conteúdo celular, inclusive o
DNA fica disperso na solução. 
8. Qual é a função do sal? 
R: o sal contribui com íons positivos que neutralizam a carga negativa do DNA.
9. Qual é a importância da temperatura neste procedimento? 
10
R: Para desnaturar o DNA
10.Para que filtrar o extrato?
R: Para eliminar os pecados grandes e as impurezas
11.Qual é a função do álcool etílico? 
R: o álcool gelado impede a dissolução do DNA na solução. A adição de álcool
gelado faz com que o DNA seja precipitado, formando uma camada na superfície da
solução, pois o etanol é menos denso que a solução aquosa.
AULA 3 – ROTEIRO 1 – ELETOFORESE DE DNA
OBJETIVO: Realizar a preparação do gel de agarose; compreender o procedimento
de eletroforese e executá-lo.
RESULTADO: Eletroforese é o método utilizado para a separação de
macromoléculas, como fragmentos de ácidos nucleicos e proteínas, de acordo com
suas taxas específicas de migração em um campo elétrico e suas propriedades
físicas, como a massa. O processo é realizado em uma matriz porosa (gel de
agarose, poliacrilamida) de modo que a migração ocorra de acordo com as suas
propriedades físicas (BLOOM, Mark V. Et al. 1996).
Os fragmentos de DNA migram em direção ao pólo positivo, uma vez que têm
carga elétrica negativa, conferida pela ionização dos seus grupos fosfato. Após amigração eletroforética, todas as moléculas de DNA de mesmo tamanho ficam
agrupadas em uma determinada região do gel e são visualizadas como uma banda,
pois a matriz porosa funciona como um filtro inversamente proporcional ao tamanho
da amostra (BLOOM, Mark V. et al. 1996). 
A eletroforese é uma técnica bioquímica versátil, relativamente simples,
rápida e de grande poder informativo, vem sendo aplicada na análise de enzinas, de
proteína e ácido nucleicos, tem sido amplamente usada em estudos de taxonomia,
bioquímica, fisiologia e genética humana, de plantas, animais e de microrganismo.
Em virtude do seu acerto informativo, apresenta grande potencial para a
caracterização e identificação de fungos, bactérias, vírus, nematoides, cultivares e
linhagem de plantas resistentes a estresses bióticos e abióticos, além das inúmeras
áreas da genética médica e forenses. (ALFENAS, 1999. FERREIRA, 1998).
11
Atualmente, a eletroforese está sendo usada para determinação e
caracterização de moléculas de ácidos nucléicos, tanto DNA como RNA.
Recentes progressos na tecnologia do DNA recombinante, no mapeamento de
fragmentos e no sequenciamento de nucleotídeos, oriundos de fragmentos de
ácidos nucléicos, têm permitido avanços expressivos e maior precisão dos
resultados (ELDER E SOUTHERN, 1983; WALKER E RAPLEY, 1999).No
caso de moléculas de DNA ou de RNA, vários são os sistemas de revelação das
bandas. Estes são consequência dos corantes usados. Quando se usa o corante
brometo de etídio (comparação com a fluorescência de amostras de DNA
de concentração conhecida) no gel ou na amostra, detecção das bandas é
feita através da fluorescência, emitida por esse corante, em presença da luz
ultravioleta. A escolha é feita a partir do tipo de técnica que se deseja empregar ou
da conveniência e praticidade em cada laboratório (BRAMMER, 2001). Os
fragmentos de DNA são visualizados por coloração com brometo de etídio. Tais
condições permitem que o DNA seja retido na membrana no ponto de contato entre
o gel e a membrana. O DNA é covalentemente ligado a membrana usando se luz
ultravioleta. O DNA é corado com brometo de etídio, uma molécula que floresce
quando iluminada com luz Ultravioleta. (NASCIMENTO. 2003).
Após a eletroforese cora - se ao gel, mede se a distância percorrida por cada
proteína marcadora e calcula – se a razão entre as distancias percorrida pela
proteína sobre a distância total da corrida da eletroforese. Com esses dados constrói
– se uma curva Log Mr (massa de proteína marcadora) versos migração relativa (da
proteína marcadora) determina – se a distância percorrida pela proteína e calcula –
se pela proteína e calcula-se a sua migração relativa. Com esse dado, determina –
se a massa molecular utilizando – se a equação da reta obtida na curva padrão.
(WILSON E WALKER, 2010).
12
Imagem 14. Corante + AD azul de Bromoferol Imagem 15 e 16. Pipetagem do DNA. 
Imagem 17. Luz de Uv ou Led
 
Fonte: Imagens aula prática, 2022
AULA 4 – ROTEIRO 1 – DESENHO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES
(primers)
OBJETIVO: Introduzir os bancos de dados de anotações genômica e apresentar as
ferramentas de bioinformática, como o blast.
RESULTADO: Nesse segundo dia de aula prática utilizamos o laboratório de
informática, onde a professora novamente dividiu a aula prática em dois momentos,
iniciando com a parte de embasamento teórico, propiciando o conhecimento
13
necessário para em seguida aprofundar na prática os experimentos, partindo do que
foi aprendido. 
O Professor Alexandre, começou a parte teórica contextualizando-nos sobre a
reação em cadeia polimerase (PCR) que sintetiza a fita de DNA e de cópias de DNA
“in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA,
no qual primers (sequência de tricas), em sentido 5’ para 3’ desencadeiam ações de
início e codificações genéticas, propiciando acesso à informações do material
genético em estudo, onde o PCR são reações cíclicas em cadeia orientadas pelos
primers que são sequencias em tricas, no qual “é uma técnica da biologia molecular
para amplificar uma única ou poucas cópias de um pedaço de DNA e baseia-se no
processo de replicação do DNA” (ILLA, 2014). 
Esses métodos de estudo genético vem com o decorrer dos últimos tempos,
sendo mais popularizado na sociedade, devido aos acontecimentos biológicos em
massa como a pandemia, onde o PCR foi bastante enfatizado e explicado com
maiores detalhes, evidenciando a importância dessa metodologia para a descoberta
de diversas patologia e acompanhamentos genéticos, pois o PCR por intermédio da
enzima transcriptase reversas em vez de fazer a transcrição natural do DNA para o
RNA, faz o processo inverso, em que a cópia do RNA com a ajuda dessas enzimas
e de outras ações enzimáticas formam o DNA codificado a partir da fita de RNA, isto
é, realizar a síntese do DNA dispondo como molde o RNA, restaurando a parte
ausente da estrutura que salvaguarda nosso material genético. (ILLA, 2014) 
O PCR é constituído por elementos importantes que efetiva sua ação e
obtenção de dados mais fidedignos, por intermédio das fases de desnaturação que
ocorre entre os 90°C e 96°C, a hibridização ou anelamento entre os 45°C e 60°C e a
extensão na temperatura entre 60°C e 72°C. É evidente que dentre esse processo
de temperaturas, que DNA polimerase termostável precisava de uma enzima que
aguentasse altas temperaturas se ser degrada, para a desnaturação acontecesse
realmente. Sendo assim, foi descoberta na Thermus Aquaticulas conhecida como
enzima “Taq polimerase”, que possibilita altas temperaturas para desnaturação
(separação das fitas), com a quebra das pontes de hidrogênio, possibilitando a
inclusão dos primers. Também têm os nucleotídeos (Desoxirribonucleotídeos
Fosfatados dNTP), isto é, combinação de bases nitrogenadas para a polimerização.
Do mesmo modo, há elementos importantes nas fases do PCR, como a substância
14
tampão que visa manter o pH, com a presença de cátions de valência de Mg2+ e
cátions monovalentes de K+ (KCL). Esses elementos descritos acima são
imprescindíveis para o PCR entre as fases de desnaturação (esquentar para separar
as fitas), hibridização (resfriar propiciando a ligação de primers na sequência
complementar) e extensão (aumento de temperatura para ação da Taq polimerase e
sintetizar nova fita), pois “o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da
região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de
alguma outra maneira” (REECER, et al., 2011). 
Os oligonucleotídeos que iniciam essas sequências são chamados de
primers, que são fundamentais para a síntese de DNA in vitro, pois a projeção de
iniciadores apropriados é de extrema importante para a eficiência da reação de
PCR, em que o iniciador direto chamado de forward (fita principal ou líder) amplifica
fragmentos no mesmo sentido da transcrição, em contra partida o iniciador reverso
(conhecido como reverse) amplifica fragmentos em sentido inverso à transcrição.
Sendo assim, hodiernamente, estão disponíveis uma grande gama de softwares
para o desenho de primers, no qual é necessário algumas recomendações e
conhecimentos básicos biotecnológicos para seguir e a análise visual detalhada é
primordial para a escolha do par correto. Vale ressaltar, que até o presente momento
falamos do RT-PCR que tem como finalidade a transcriptase reversa, porém
também existe o PCRq que realiza o processo em tempo real, isto é, quantifica ao
mesmo tempo da replicação. (REECER, et al., 2011) 
O Professor Alexandre, também abordou suscintamente sobre a eletroforese
em gel agarose, que consisteem uma técnica de separar fragmentos do DNA
mediante a processos elétricos de cargas (e seus respectivos tamanhos). Portanto,
para bem exemplificar o processo e contextualizar aspectos importantes sobre essa
técnica, podemos afirmar que: 
O termo eletroforese é usado para descrever a migração de uma 
partícula carregada sob influência de um campo elétrico, permitindo a
separação dos diferentes tipos de proteínas séricas ou plasmáticas, 
determinando as proporções relativas. Sob condições de corrente 
elétrica constante, a força de deslocamento de uma partícula é 
resultado da carga efetiva, da molaridade do tampão e da resistência
do meio usado como suporte (ágar, acetato, gel capilar). Como as 
proteínas possuem cargas positivas e negativas, a mobilidade 
eletroforética é diretamente proporcional à carga da partícula e 
15
inversamente proporcional à viscosidade do meio. (OLIVEIRA, 
TRENTIN, CAMARGO, PINTO, & MARTINS, 2015, p. 1133) 
Questões:
1. A qual organismo pertence a sequência trabalhada? A que tipo de produto ela
corresponde? 
R: Sars cov 2, corresponde a um vírus
2. Qual seria melhor: um primer com o tamanho igual a 15 ou 23 b (considere as
condições ideais iguais para os demais parâmetros)? Justifique.
 R: 23, pois tende a ser mais específico
3. Por que é importante considerar a temperatura de pareamento na hora de 
confeccionar o primer?
 R: porque precisamos programar na pcr e no termociclador, também está 
relacionada com a proporção GC
4. Quais os parâmetros devem ser analisados na síntese de primers para o 
PCR? 
R: temperatura de melting, proporção gc, tamanho do primer.
AULA 4 – ROTEIRO 2 – BUSCA DE MUTAÇÕES E PROCURA DE GENES NO
PUBMED
OBJETIVO: Aprender a utilizar as ferramentas de bioinformática para análise de
genes e mutações
RESULTADO: Com o desenvolvimento tecnológico e com o avanço rápido e
continuo da biotecnologia, que a cada dia vem tomando espaço e contribuindo para
grandes descobertas científicas, principalmente mediante as calamidades de saúdes
mediante a pandemia que estamos enfrentando nos últimos tempos, a tecnologia
favorece as novas descobertas e possíveis prognósticos mais assertivos, Isto posto,
16
a professora nesse segundo momento da aula, solicitou que todos ligassem os
computadores, pois iriamos aprender manusear os softwares que de fato
colocaríamos em prática tudo o contexto passado na primeira parte da aula.
Iniciamos a nossas pesquisas no site do Nacional Center for Biotechnology
Information (NCBI) que constante mente busca atualizar e expandir seu banco de
dados propiciando conteúdo de fácil acesso e gratuitamente a informações
genômicas e biomédicas, auxiliando e guiando profissionais em suas pesquisas e
consultadas, com dados fidedignos conduzindo-os a excelência clínica. Como
estamos estudando primeiramente o COVID19, selecionando no primeiro filtro
genoma e na barra de procurar colocamos “sars cov 2”, no qual ao procurar
clicamos no “RefSeq” (Locus:NC-045512.2 = espécie de RG da informação gênica),
que corresponde a síndrome respiratória aguda grave corona vírus 2 isolado Wuhan-
Hu-1 (genoma completo), que contém 29903 pares de bases. Em seguida, copiamos
suas respectivas referências do genoma no NCBI e colamos no Prime-Blast-Tool,
para encontrar e desenhar sugestões de primers específicos. (GONÇALVES, s.d.) 
Também é possível realizar buscas de mutações e procurar genes no
software que é online chamado PUBMED, além de encontrar artigos ricos em
informações, que “é um excelente site para pesquisas que está disponível de forma
gratuita na internet. O PubMed® é o primeiro sistema de pesquisa para a informação
em saúde da U.S. Nacional Library of Medicine (NLM)” (BARROS, 2018). A princípio
iniciamos as nossas buscas no site pela mucopolissacaridose tipo 1 que é uma
doença genética considerada autossômica que impende a degradação de
glicosaminoglicanos (GAGs), no qual esses pacientes podem apresentar sintomas
mais severos, que é conhecida como síndrome de Hurler, com uma gradativa
disfunção esquelética, anomalias do tecido frágil e até mesmo disfunções
neurológica dependendo da fisiologia e graus de patologia do paciente. Portanto, ao
pesquisarmos “IDUA” identificamos que tem 6 transcritos (isoformas), 17521 pares
de bases e 2174RNA mensageiro. (BECK, 2011) 
Destarte, conforme proposto no final da aula e sugerido pelo roteiro, onde eu
deveria escolher no PubMed, um artigo que eu me interessasse. Sendo assim,
escolhi para minha pesquisa a doença genética fibrose cística que segundo dados
obtidos em diversas consultas online estão entre as 5 doenças mais comuns na
população é tem como herança recessiva. Essa é uma doença, em os genes são
17
transmitidos pelos pais, que por vezes não manifestam sintomas da doença, sendo
apenas portadores. Essa doença prejudica os sistemas digestivo e respiratório, bem
como a função das glândulas sudoríparas, ao qual podem ser identificadas pelo
teste do pezinho após o nascimento da criança. Segundo a Biblioteca Virtual em
Saúde afirma que a fibrose cística é: 
Um gene defeituoso e a proteína produzida por ele fazem com que o corpo
produza muco de 30 a 60 vezes mais espesso que o usual. O muco espesso leva ao
acúmulo de bactéria e germes nas vias respiratórias, podendo causar inchaço,
inflamações e infecções como pneumonia e bronquite, trazendo danos aos pulmões.
Esse muco também pode bloquear o trato digestório e o pâncreas, o que impede
que enzimas digestivas cheguem ao intestino. O corpo precisa dessas enzimas para
digerir e aproveitar os nutrientes dos alimentos, essencial para o desenvolvimento e
saúde do ser humano. Pessoas com fibrose cística frequentemente precisam repor
essas enzimas através de medicamentos tomados junto às refeições, como forma
de auxílio na digestão e nutrição apropriadas. (BIBLIOTECA VIRTUAL EM SAÚDE,
2018) 
Contudo, pesquisei no PubMed artigos referentes a patologia escolhida e
apresentada acima e encontrei um artigo que apresenta um pouco suas definições e
dificuldades em correlacionar seu genoma, tal qual o título do artigo é: “Terapia
gênica para fibrose cística: progresso e desafios da edição do genoma”, escrito
Giulia Maule, Daniele Aroiso e Anna Cereseto, que foi publicado no dia 30/05/2020.
Cujo o seu PMCIS é PMC7313467 e está disponível no DOI: 10. 3390/ijms21113903
ou https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32486152/. 
Tarefas a serem realizadas:
1. Entrar no site: www.pubmed.gov/. Na aba da esquerda, selecionar a palavra
“gene”;
2. Digite o nome do gene: IDUA e procure o seu código. Lembre-se que existem
vários tipos de IDUA e que queremos procurar o “humano”. Responda:
a) Qual é o nome do gene?
R: IDUA – Alpha – L – Iduronidase 
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http://www.pubmed.gov/
b) Qual é a identidade do gene?
R: ID =3425 
c) Qual é a localização desse gene e quantos éxons ele possui?
R: CHR4: 984860-1010.486, possui 14 Éxons.
d) Cite os três locais onde ele é mais expresso?
R: Baço, Estomago e Tecido gorduroso. 
e) Qual é o número da proteína?
R: NP-0001942
f) Quantos transcritos esse gene possui?
R: Possui 9 transcritos. 
g) Na aba NCBI Reference Sequences (RefSeq) clicar em GenBank. Qual é o 
tamanho do gene?
R: 24mil 533.
h) Voltar na página original e ir para a aba mRNA and Protein(s), clicar em 
NM_000203.5. Qual é o tamanho do mRNA?
 R: 2 mil 174 – Bp linear mRNA.
i) Clicar no CDS e, depois, em FASTA. Copiar o CDS para um arquivo de Word.
 R: Encontrar a primeira e a última trinca de bases.
3. Usando a sequência a seguir, siga os seguintes passos:
 1 agtgcagccc gaagccccgc agtccccgag cacgcgtggc catgcgtccc ctgcgccccc 
 61 gcgccgcgct gctggcgctc ctggcctcgc tcctggccgc gcccccggtg gccccggccg
 121 aggccccgca cctggtgcat gtggacgcgg cccgcgcgct gtggcccctg cggcgcttct 
181 ggaggagcac aggcttctgc cccccgctgc cacacagccaggctgaccag tacgtcctca 
241 gctgggacca gcagctcaac ctcgcctatg tgggcgccgt ccctcaccgc ggcatcaagc 
301 aggtccggac ccactggctg ctggagcttg tcaccaccag ggggtccact ggacggggcc 
361 tgagctacaa cttcacccac ctggacgggt acctggacct tctcagggag aaccagctcc 
421 tcccagggtt tgagctgatg ggcagcgcct cgggccactt cactgacttt gaggacaagc 
481 agcaggtgtt tgaatggaag gacttggtct ccagcctggc caggagatac atcggtaggt 
541 acggactggc gcatgtttcc aagtggaact tcgagacgtg gaatgagcca gaccaccacg 
601 actttgacaa cgtctccatg accatgcaag gcttcctgaa ctactacgat gcctgctcgg 
661 agggtctgcg cgccgccagc cccgccctgc ggctgggagg ccccggcgac tccttccaca
 721 ccccaccgcg atccccgctg agctggggcc tcctgcgcca ctgccacgac ggtaccaact 
781 tcttcactgg ggaggcgggc gtgcggctgg actacatctc cctccacagg aagggtgcgc 
841 gcagctccat ctccatcctg gagcaggaga aggtcgtcgc gcagcagatc cggcagctct
 901 tccccaagtt cgcggacacc cccatttaca acgacgaggc ggacccgctg gtgggctggt 
961 ccctgccaca gccgtggagg gcggacgtga cctacgcggc catggtggtg aaggtcatcg 
1021 cgcagcatca gaacctgcta ctggccaaca ccacctccgc cttcccctac gcgctcctga 
1081 gcaacgacaa tgccttcctg agctaccacc cgcacccctt cgcgcagcgc acgctcaccg 
1141 cgcgcttcca ggtcaacaac acccgcccgc cgcacgtgca gctgttgcgc aagccggtgc 
1201 tcacggccat ggggctgctg gcgctgctgg atgaggagca gctctgggcc gaagtgtcgc 
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1261 aggccgggac cgtcctggac agcaaccaca cggtgggcgt cctggccagc gcccaccgcc
1321 cccagggccc ggccgacgcc tggcgcgccg cggtgctgat ctacgcgagc gacgacaccc 
1381 gcgcccaccc caaccgcagc gtcgcggtga ccctgcggct gcgcggggtg ccccccggcc 
1441 cgggcctggt ctacgtcacg cgctacctgg acaacgggct ctgcagcccc gacggcgagt 
1501 ggcggcgcct gggccggccc gtcttcccca cggcagagca gttccggcgc atgcgcgcgg 
1561 ctgaggaccc ggtggccgcg gcgccccgcc ccttacccgc cggcggccgc ctgaccctgc 
1621 gccccgcgct gcggctgccg tcgcttttgc tggtgcacgt gtgtgcgcgc cccgagaagc
 1681 cgcccgggca ggtcacgcgg ctccgcgccc tgcccctgac ccaagggcag ctggttctgg
 1741 tctggtcgga tgaacacgtg ggctccaagt gcctgtggac atacgagatc cagttctctc
1801 aggacggtaa ggcgtacacc ccggtcagca ggaagccatc gaccttcaac ctctttgtgt 
1861 tcagcccaga cacaggtgct gtctctggct cctaccgagt tcgagccctg gactactggg 
1921 cccgaccagg ccccttctcg gaccctgtgc cgtacctgga ggtccctgtg ccaagagggc 
1981 ccccatcccc gggcaatcca tgagcctgtg ctgagcccca gtgggttgca cctccaccgg 
2041 cagtcagcga gctggggctg cactgtgccc atgctgccct cccatcaccc cctttgcaat 
2101 atatttttat attttattat tttcttttat atcttggtac caacgccccc tttaaagcgg 
2161 ctttgcacag gtca.
 R: 1-gta 2 tca.
 a) Abra o site do pubmed em outra aba. No final da página, clique em Blast.
 b) Clique em nucleotide blast, digite e cole a sequência dada. Clique em 
human genomic. Qual é o gene que foi encontrado?
R: Gene Indua- mNRA.
 c) Observe, atentamente, e veja se há alguma alteração de base. Se sim, qual é
a posição e a troca?
R: Sim, existe possíveis variantes. a posição é 17.585 no range 2. a troca 
é a perda de nucleotídeos. 
4. Procure um artigo no pubmed sobre uma doença genética que você tenha 
interesse. Lembre-se de procurar o nome da doença em inglês. Escreva, aqui, o 
número do artigo.
 R: Contudo, pesquisei no PubMed artigos referentes a patologia escolhida
e apresentada acima e encontrei um artigo que apresenta um pouco suas definições
e dificuldades em correlacionar seu genoma, tal qual o título do artigo é: “Terapia
gênica para fibrose cística: progresso e desafios da edição do genoma”, escrito
Giulia Maule, Daniele Aroiso e Anna Cereseto, que foi publicado no dia 30/05/2020,
cujo seu PMCIS é PMC7313467 e está disponível no DOI: 10. 3390/ijms21113903
ou https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32486152/
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