biologia molecular

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Cabeçalho corrente: [TÍTULO REDUZIDO DE ATÉ 50 CARACTERES]
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	[TÍTULO REDUZIDO DE ATÉ 50 CARACTERES]
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 UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP 
 BACHARELADO EM BIOMEDICINA
 JEFFREY COSTA FERREIRA SILVA RA- 2110907
 
 Biologia Molecular Aplicada a Biomedicina 
 Relatório de aulas práticas
 
 POLO RANGEL- SANTOS 2022
 05.12.2022 
 JEFFREY COSTA FERREIRA SILVA RA- 2110907
 
Relatório desenvolvido para 
avaliação do conteúdo de 
Biologia Molecular Aplicada a Biomedicina, das aulas praticas realizadas em 
Laboratório 
 
Ano 
 
 POLO RANGEL- SANTOS 
 04.12.2022
 
 Sumário
 1. Introdução ........................................................................................
 2. Resultado e Discussão ...................................................................
 3. Referencias Bibliográficas .............................................................
 
 
 
 1 - Introdução 
 A importância da biologia aplicada a biomedicina traz conceitos fundamentais de estrutura dos ácidos nucleicos e aspectos relacionados a sua organização e funcionalidade tanto em células procarióticas como em células eucarióticas. Técnicas básicas utilizadas em biologia molecular, e a aplicabilidade desta tecnologia no diagnostico clínico laboratoriais em diferentes áreas da atividade do biomédico.
 A compreensão da biologia molecular das células é uma área dinâmica de pesquisa que é fundamental para todas as ciências biológicas. Isto é verdade, não somente do ponto de vista da pesquisa básica, mas também com respeito a um número crescente de aplicações praticas na agricultura, na biotecnologia e na medicina. As aplicações medicas fornecem exemplos muito interessantes, com novos métodos para prevenção e tratamento tornando possíveis a partir de uma crescente compreensão das bases celulares e moleculares de muitas doenças humanas. Nestas últimas décadas, um número significativo de informações em nível medico-biológico tem chegado ao alcance de profissionais desta área. (Livro texto Unip).
 A compreensão dos diversos mecanismos moleculares envolvidos na replicação do DNA, transcrição do RNA e tradução de proteínas e os mecanismos biomoleculares de controle destas funções, bem como as técnicas básicas e aplicabilidade desta tecnologia no diagnostico clínico laboratorial e em diferentes áreas da atividade do profissional Biomédico, sendo o instrumento ativo da transformação harmoniosa entre a ciência e a sociedade e evidenciando sua competência no exercício da atividade profissional.
 2. Resultado e Discussão
2.1 Aula 1 Uso de Micropipetadores
 Nesta aula tivemos como objetivo, aprender e a utilizar os micropipetadores para assim fazer uma utilização precisa. Foi explicada a forma correta de segurar a micropipeta e seus estágios 1 e 2, sempre que a pipeta estiver devidamente calibrada ao desprezar o conteúdo da mesma bastara apenas usar o primeiro estágio, já o segundo estágio é para desprezar todo o volume com o primeiro. 
As pipetas podem ter um volume fixo ou ajustáveis em escalas diferentes ou continuas. Tem que ser observado o ajuste da ponteira, se não formou bolhas de ar em seu interior, escolher corretamente a ponteira de acordo com a quantidade de líquido necessário, para desprezar o líquido no microtubo a melhor forma é pela parede ou ao fundo.
1- Indicação da pipeta:
	 Identificação da pipeta
	 Intervalo de volume
	Optite
	20-200μ
	Boeco Germany
	20μ
	Boeco Germany
	250μ
	Kasvi basic
	100-1000μ
2- Escolher entre as pipetas disponíveis no laboratório, a pipeta adequada para coletar os volumes.
1,5 μL __0,1-2,5____________ 1000 μL __100-1000_________
12 μL ___10-100____________ 200 μL ___20-1000__________
576 μL __100-1000__________ 1 mL ____100-1000_________
0,001 mL _0-1-2,5___________ 0,5 mL ___0,1-2,5___________
0,02 mL __20______________ 1,2 μL ____0,1-2,5___________
 
3- Faça a pipetagem dos volumes listados no exercício 2 e observe.
4- Utilização de microcubos, marcando A, B e C. Prepare os tubos conforme o quadro a seguir.
	 Tubo
	 Solução 1
	 Solução 2
	 Solução 3
	 Solução 4
	A
	 10 μL
	 5 μL
	 4 μL
	 1 μL
	B
	 10 μL
	 3 μL
	-
	 7 μL
	C
	 10 μL
	-
	 2 μL
	 8 μL
Um total de 20 μL foi adicionado a cada tubo; para verificar se a pipetagem esta correta, ajuste da pipeta P20 para 20 μL e, com cuidado, medir o volume de cada tubo.
Como estava preenchida a ponteira?
R- Estava cheio de líquido
Algum espaço com ar?
R- Não havia espaços com ar e nem bolhas
Ficou algum volume no tubo?
R- Uma mínima quantidade
Houve alguma diferença?
R- Não, ficaram iguais
Qual a explicação você daria?
R- Poderia ter algumas diferenças, pois não sabemos se as pipetas estavam corretamente calibradas.
 5- Utilização de micropipetas com volumes entre 100- 1000 μL.
Procedimento: identifique os microtubos, marcando D, E e F. Prepare os tubos conforme o quadro a seguir.
	 Tubo 
	 Solução 1
	 Solução 2
	 Solução 3
	D
	 100 μL
	 400 μL
	 500 μL
	E
	 150 μL
	 250 μL
	 600 μL
	F
	 200 μL
	 350 μL
	 150 μL
Um total de 1000 μL foi adicionado a cada tubo; para verificar se a pipetagem foi correta, ajuste a pipeta para 1000 μL e, cuidadosamente, meça o volume de cada tubo.
2.2 Aula 2 – Roteiro 1 Extração de DNA parte 1
 Nesta aula pratica feita em laboratório, para ser realizada a extração de DNA vegetal do morango e da cebola, os vegetais em questão possuem muitas células sendo ótimas opções para a prática da extração de DNA.
A extração do DNA do morango conforme a tabela a seguir:
	 Procedimento
	Maceração do morango ate virar uma papa
	Adicionar 15 ml da solução de detergente com sal de cozinha
	Filtrar em papel filtro adequado
	Colocar em um tubo
	Resfriar a mistura no gelo por 5 minutos
	Adicionar álcool em duas vezes o volume do extrato de morango
	Aguardar 
 Após todo o processo acima feito foi observado com clareza a formação do DNA entre as soluções, foi comentado pela professora o papel de cada um dos componentes utilizados no procedimento, a filtragem para a separação do material sedimentado e o aquoso, a maceração no cadinho com vigor para já fazer a lise das células, a adição do detergente para promover o rompimento das membranas o sal para facilitar na lise, o álcool para solubilizar todos os componentes menos o DNA. 
Após homogeneização levemente no tubo o DNA se formou e foi retirado para observação.
DNA do morango, foto tirada em laboratório
Procedimento da extração do DNA da cebola.
	 Procedimento 
	Macerar a cebola ate vira uma papinha
	20 ml de solução de detergente
	Banho maria a 60 C por 15 minutos
	Resfriar a mistura no gelo por 5 minutos
	Adicionar o dobro do volume do extrato de álcool
	Aguardar 
Para a extração do DNA da cebola foram utilizados os processos descritos na tabela a cima, e da mesma forma do morango foi discutido item a item e suas respetivas funções no processo de extração, praticamente idêntico ao morango, ao final foi possível ver um novelo branco, que é o DNA da cebola.
DNA da cebola, foto tirada em laboratório 
1- Por que é necessário macerar o morango e picar a cebola?R- A maceração quebra a parede celular, que é a estrutura extracelular que envolve e protege a célula vegetal.
 2- Em que etapa do procedimento ocorre o rompimento das membranas das células do morango? Explique.
 R- Na etapa que é adicionado o detergente.
 3- Qual a função do sal de cozinha?
 R- O sal ajuda a manter as proteínas dissolvidas no líquido extraído impedindo que elas precipitem com o DNA
 4- Qual o papel do álcool?
 R- O DNA não é dissolvido no etanol por isso promove o agrupamento dos filamentos e torna-se visível. Quanto mais gelado, menos solúvel é melhor para ocorrer a separação dos filamentos.
 5- Por que você não pode ver a dupla hélice do DNA extraído?
 R- Não é possível visualizar a dupla hélice, pois é extremamente pequena para ser observada, mas é possível sim ver o emaranhado contendo inúmeros filamentos da molécula lembrando uma nuvem.
 6- Considerando os procedimentos da extração do DNA genómico, você espera obtê-lo sem as quebras mecânicas ou químicas?
 R- Para visualizar é preciso que haja rompimento da membrana, sem essa etapa não é possível extrair.
 7- Qual é a função do detergente? 8- Qual é a função do sal?
 R- O detergente ajuda a dissolver a bicamada lipídica que compõe a membrana plasmática.
 9- Qual é a importância da temperatura neste procedimento?
 R- A temperatura é essencial no desarranjo dos fosfolipídios das membranas e desnaturação parcial das enzimas evitando que o DNA seja fragmentado dificultando sua extração.
10- Para que filtrar o extrato?
 R- O excesso de partículas maiores do vegetal poderão dificultar a separação dos filamentos de DNA.
11- Qual a função do álcool etílico?
 R- O DNA não pode solúvel em etanol por isso promove o agrupamento dos filamentos de DNA tornando-os visíveis. 
2.3 Aula 3 – Roteiro 1 Extração de DNA parte 2
 Esta aula teve como objetivo, aprender o processo de extração de DNA de bactérias cujo processo é bem distinto do processo de extração de DNA em vegetais, o procedimento mais comum para essa preparação de DNA gnômico bacteriano, consiste na lise das bactérias utilizando lisozima ou detergente seguindo de extração com solventes orgânicos como fenol ou clorofórmio, nesse caso em laboratório foi utilizado o clorofórmio por se tratar de um produto químico mais seguro, para o experimento que o fenol, esse ultimo com toxicidade e periculosidade considerada alta.
Procedimento de extração do DNA da bactéria E. coli HB101.
	 Procedimento 
	Cultura da bactéria E. coli HB101 inoculada no dia anterior em meio de cultura líquido esterilizado, triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NACL 1%, PH 7,5%
	Centrifugar a cultura celular por 5 minutos a 5000 rpm
	Descartar o sobrenadante
	Adicionar 6ml da solução 1 e homogenizar
	Adicionar 0,7ml da solução 2 homogenizar levemente
	Incubar 10 minutos a 60 C com agitação manual suave a cada 2 minutos
	Repousar em temperatura ambiente por 5 minutos com o tubo aberto para esfriar
	Adicionar 6,7 ml de clorofórmio 
	Agitar 10 minutos suavemente 
	Centrifugar 5 minutos a 5000 rpm
	Remover a fase aquosa com pipeta de Pasteur
	Adicionar 2 vezes o volume anotado de etanol gelado
	Aguardar 
	Resuspender em NACL 1%
Apos todo o procedimento, o DNA estará em fase aquosa e não na fase orgânica e nessa última estarão os lipídeos, carboidratos e proteínas. No final do procedimento não se formou um DNA muito visível como nos anteriores, porem foi observado um fio fino e viscoso, claramente pode perceber que se tratava de um DNA.
2.4 Aula 4 – Roteiro 1 Desenho de Oligonucleotídeos Iniciadores (primers)
 Nesta aula pratica foi realizada no laboratório de informática, e teve como objetivo apresentar e introduzir os bancos de dados de anotações genómica apresentando as ferramentas de bioinformática como por exemplo o primer blast.
Estes primers já está pronto para serem usados e a ferramenta apresentada foi exatamente para demostrar como conseguir as informações necessárias para as reações de PCR em tempo real para o diagnostico de COVID-19 e para essa reação são desenhados os primers específicos que podem ser obtidos através desses bancos de dados virtuais. 
Para esta prática foram necessário o acesso a internet e a utilização do site https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ e em seguida foi escolhida a base de dados genome, na busca sars cov 2. Após isso foram discutidas as informações que foram geradas com os dados.
Foi encaminhada a pesquisa para o link que aparece em “RefSeq” e escolhido o menu FASTA e Grafics. Foi comentado nesse momento o conceito de ORF, e foram apresentados os genes.
2.5 Aula 2 – Roteiro 2 Busca de mutações e procura de genes no PUBMED
 Nesta aula tivemos como objetivo apreender a utilizar as ferramentas de bioinformática para a analise de genes e mutações. A mucopolissacaridose do tipo I (MPSI) é uma doença autossómica recessiva, caracterizada pela deficiência total ou parcial das enzimas a-L-iduronidade (IDUA) 	que cliva os glicosaminoglicanos (GAGs) dermatn e heparam sulfatos; a sua deficiência bloqueia a degradação desse GAGs, que são constituintes importantes da matriz extracelular, líquido das juntas e tecido conectivo em todo o corpo; dessa forma, eles se acumulam, progressivamente, no lisossomo, causando a disfunção da célula, do tecido e do órgão, por mecanismos fisiopatológicos, em grande parte, desconhecidos.
Pacientes com MPS I apresentam variados fenótipos clínicos, o mais severo deles é a síndrome de Hurler, com uma progressiva disfunção neurológica, esquelética e anomalias do tecido frágil que podem levar a morte na primeira década. Nas foras menos severas das doenças, tais como a síndrome de Huler-Scheie e a síndrome de Scheie, mais branda, não ocorre o retardo mental, somente alguns sintomas leves.
Os diferentes graus de severidades são devido ao efeito de várias mutações no gene humano IDUA, localizado no braço curto do cromossomo 4. os homozigotos e os heterozigotos para algumas mutações (W402X e Q70X) resultam no fenótipo mais severo, a síndrome de Hurler, enquanto algumas alterações que permitem a atividade residual da enzima resultam num fenótipo brando.
1- Qual o nome do gene?
R- IDUA alfa L-iduronidase [Homo sapiens]
 2- Qual é a identidade do gene?
 R- Codifica a proteína aL-idurinidase ID do gene – 3425
 3- Qual a localização desse gene e quantos enxós ele possui?
 R- Localizado no cromossomo 4p 16.3 (braço curto do cromossomo 4 na região 1; banda 6; SUB banda 3) possui 14 enxós. 
 4- Cite os três locais onde ele é mais expresso?
 R- Baço 3608 RPKM; estomago 3504 RPKM; gordura 2965 PKPM.
 5- Qual é o número da proteína?
 R- NP- 0001194.2 / NP- 001350505.1 / XP – 011511763.1 / XP 016862652.1
 6- Quantos transcritos esse gene possui?
 R- 4 variantes transcritas.
 7- Na aba NCBI Referencie Sequences (RefSeq) clicar em Genbank. Qual é o tamanho do gene?
 R- Possui 17521 pb que codificam 653 aminoácidos (aa) - 17568nt
 8- Voltar na página original e ir para a aba mRNA and Protein (s), clicar em NM_000203.5. Qual é o tamanho do mRNA?
 R- https://doi.org/10.1590/S1415-5273200600300009 Fenilcetonuria no Brasil: evoluções e casos.
 
6. Referencias Bibliográficas
JUNQUEIRA, Luiz Carlos Uchoa; CARNEIRO, José. Biologia celular e molecular. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2015
MENCK, Carlos M. Genetica Molecular Básica. Rio de Janeiro; Guanabara Koogan, 2017
ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS. J. Biologia Molecular da Célula. 6ª edição, São Paulo: ArtMed. 2017
BHANA, S. et al. p53-dependent global nucleotide excision repair of cisplatininduced intrastrand cross links in human cells. Mutagenesis, v. 23, n. 2, p. 131-136, 2008
CAIRNS, J. The Chromosome of Escherichia coli. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, v. 28, n. 0, p. 43-46, 1963