roteiro-mico-biologia-2017

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
 
CURSO: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS/BACHARELADO/LICENCIATURA 
 
 
 
 
 
Disciplina: Microbiologia Básica 
 
 
 
 
Sugestões de Atividades Práticas de Micologia 
(algumas atividades poderão ser realizadas na forma de projetos) 
 
 
 
 
Professores Responsáveis: 
Eduardo Bagagli 
Sandra de Moraes G Bosco 
 
 
Técnicos: 
Ivana Castilho 
Larissa Ragozo 
Luiz Henrique Alquati 
 
 
2017 
 2 
ASPECTOS MACROSCÓPICOS GERAIS DE CULTURAS DE FUNGOS 
 
A)Finalidade: Identificação de amostras, estudos genéticos, atividade das 
drogas, etc. 
 
B)Fundamento: Os estudos macroscópicos podem ser baseados nas 
seguintes características: 
 
FRENTE DA COLÔNIA 
 1.Aspectos gerais (textura): algodonosa, cremosa, pulverulento, 
aveludado, seroso, plástico. 
 2.Coloração: cor da colônia (hifas, esporos, pigmento difusível). 
 3.Consistência: seca, dura, pastosa, húmida. 
 4.Topografia (relevo) da superfície: presença de dobras, sulcos, 
elevações, lisa/plana. 
 5.Presença de micélio aéreo e profundo. 
 
VERSO DA COLÔNIA: também pode apresentar características que 
auxiliam na caracterização e identificação. Presença de sulcos, dobras, 
pigmentos, etc. 
 
Observar e descrever as características coloniais de culturas dos seguintes 
fungos abaixo, alguns filamentosos outros leveduriformes. 
 
Cultura A (Penicillium sp) 
 
 
 
 
 
 
 
Cultura B (Aspergillus sp) 
 
 
 
 
 
Cultura E (Saccharomyces sp) 
 
 
 
 
 
 
 
 3 
ASPECTOS MICROSCÓPICOS DE FUNGOS 
 
 A)Finalidade: Utiliza-se este método quando há necessidade de se 
obter orgãos de frutificação em boas condições para estudo morfológico 
detalhado. 
 
 B)Fundamento: Pode-se preparar lâminas diretamente a partir de 
fragmentos de culturas já existente (procedimento mais simples), 
normalmente com coloração com Lactofenol–azul–algodão (LFAA); ou fazer 
a partir da “cultura em lâmina”, também denominado “microcultivo”. Neste 
segundo procedimento, o fungo é cultivado em pequeno bloco de meio de 
cultura, sobre a lâmina e entre a lamínula, normalmente sobre um bastão de 
vidro em U, dentro de Placa de Petri contendo umidade alta (breve 
descrição abaixo) 
 
 
CULTIVO EM LÂMINA 
 
Material: 
 
 -Placas de Petri com lâminas dispostas sobre bastão de vidro em U, 
esterilizadas; 
 -Lamínulas; 
 -Ágar Sabouraud a 2% de glicose; 
 -Água destilada esterilizada; 
 -Algodão; 
 -Formol; 
 -Lactofenol - azul – algodão (LFAA); 
 -Culturas 
 
Procedimento: 
 
 1.Cortar o ágar-Sabouraud ou agar-Batata em pequenos fragmentos 
(+ ou - 1 cm); 
 2.Colocar, com assepsia, um fragmento sobre a lâmina esterilizada; 
 3.Semear o fungo em cada lado do fragmento do meio de cultura; 
 4.Colocar uma lamínula limpa e previamente flambada sobre o 
referido meio; 
 5.Adicionar, à placa, algodão embebido em água destilada, a fim de 
manter a umidade no meio; 
 6.Incubar à temperatura ambiente e observar diariamente o 
crescimento; 
 7.Quando houver desenvolvimento satisfatório, submeter à ação do 
formol (1,0 ml - 1 hora); 
 8.Retirar a lamínula e o fragmento do meio; 
 9.Corar a lâmina, colocando-se uma gota de lactofenol-azul-algodão; 
 4 
 10.Depositar a lamínula e fechar com esmalte; 
 11.Observar ao microscópio e desenhar os órgãos de frutificação das 
culturas. 
 
 Lâmina A (Penicillium sp) Lâmina B (Aspergillus sp) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lâmina C (Rhizopus sp) Lâmina D (Microsporum sp) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Fazer um esfregaço com a cultura E e corar pelo método de Gram. 
 Observar ao microscópio e desenhar as estruturas visualizadas. 
 
 Lâmina E (Saccharomyces sp) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 5 
 
MICOLOGIA AMBIENTAL 
 
Isolamento e cultivo de fungos anemófilos e ambientais 
 
Objetivos: Demonstrar a larga ocorrência dos fungos ao nosso redor 
-Verificar o efeito de diferentes meios de cultura no isolamento e 
crescimento fúngico. 
 
Material necessário: Placas com meios de cultura, canetas para 
retroprojetor, magiplastic. 
 
Meios de Cultura: 
 
Meio Descrição 
A Sabouraud Agar 
B Sabouraud + Cloranfenicol 
C DRBC (Dicloran Rosa Bengala, Cloranfenicol) 
 Outros 
 
Sugestões de procedimentos para o isolamento fúngico: 
 
Procedimento Descrição 
1 Manter a placa aberta por 5 minutos, dentro do 
laboratório 
2 Manter a placa aberta distante 10 cm da boca e tossir 
5 vezes 
3 Manter a placa aberta por 5 minutos, fora do 
laboratório 
 
Identificar cada placa com o respectivo meio, procedimento e grupo; 
vedar com Magiplastic, manter a temperatura ambiente e avaliar o 
crescimento com contagem das colônias após uma semana. 
 
Resultados: Número de colônias obtidas nos diferentes meios, após 1 
semana 
 
 Meio de Cultura 
Procedimento A B C 
 
 
 
 
 
 6 
Caracterização de fungos isolados do ambiente 
 
 Objetivos: - Obter treinamento nas técnicas básicas de cultivo e 
identificação de fungos 
-Avaliar o efeito da temperatura sobre o crescimento fúngico 
 
Material necessário: 
 
Culturas fúngicas, tubos contendo meio de Sabouraud Agar inclinado 
lãminas, lamínulas, corante Lacto-fenol-azul-algodão, alça e fio de platina. 
 
Procedimento 
 
Cultivo: Escolher 4 colônias fúngicas/grupo, identificar, Flambar alça 
em bico de Bunzem, coletar esporos e/ou micélios fúngico e semear 
(duplicata) em tubos contendo Sabouraud Agar. Incubar a temperatura 
ambiente (25°C) e a 35-37°C. Avaliar o crescimento após 1 semana, 
descrever o aspecto macroscópico das culturas. 
 
Preparo de lâminas em lacto-fenol-azul-algodão para observação das 
características microscópicas: Coletar um fragmento da colônia (avaliar os 
quatros isolados selecionados) com fio de platina e colocar sobre lâmina 
contendo uma gota de lacto-fenol-azul-algodão, homogeneizar e cobrir com 
lamínulas. Observar ao microscópio, desenhar e comparar com manuais de 
identificação. 
 
 
 
 
Resultados: Se houve ou não crescimento nas condições abaixo. 
 
 Crescimento e aspecto da cultura em Sabouraud Agar 
Isolado 25°C 35-37°C 
1 
2 
3 
4 
 
 
Resultados - Aspectos microscópicos (fazer lâminas com fragmentos da 
colônia, coradas com LFAA, desenhar e tentar identificação): 
 
Isolado 1 
 
 
 
Isolado 3 
 7 
Isolado 2 
 
 
 
 
Isolado 4 
 
 
Observação macroscópica de fungos basidiomicetos ambientais, 
liquens, em alimentos e na deterioração. 
 
A- Basidiomicetos macroscópicos - Possíveis de serem encontrados sobre 
troncos de árvores em decomposição, solo de florestas, fezes de animais, 
etc. Algumas espécies são comestíveis outras são tóxicas, e algumas são 
cultivadas. 
 
1- Ordem Aphyllophorales (Holobasidiomycetes): 
Exemplos: “orelhas de pau” (Polyporaceae), “coral fungi” (Clavaria sp), 
“cantarelos” (Cantharellus sp) 
 
 
2 - Ordem Agaricales (Holobasidiomycetes): 
Exemplos: “champinhon” (Agaricus brunnescens ou A.bisporus); “pleurotus”, 
“cogumelo ostra” (Pleurotus ostreatus); Lentinula edodes (“schiitake”). 
Possíveis de serem encontrados frescos em quitandas. Outros gêneros: 
Leucoagaricus (fungo da saúva), Amanita, Coprinus, Armillaria, Boletus, etc. 
 
 
3 – Ordem Sclerodermatales (Holobasidiomycetes - série Gasteromycetos) 
Exemplos: “estrela-da-terra” (Geastrum sp), (‘puffballs”) (Pisolithus 
tinctorius) micorriza que pode ser encontrada em plantações de Eucaliptus, 
Pinus, etc. 
 
4 – Ordem Nidulariales (Holobasidiomycetes - série Gasteromycetos): 
Exemplo: “ninho-de-passarinho” (Cyathus sp). Apresenta um mecanismo de 
ejeção do basidiocarpo. Pode ser encontrado em jardins que receberam 
esterco (fezes de bovinos e equinos). 
 
5 – Ordem Auriculariales (Phragmobasidiomycetes) 
Exemplo: “fungo orelha” (Auricularia sp). Apresenta um basidiocarpo 
gelatinoso em formato de orelha, normalmente sobre troncos de árvores em 
decomposição. Empregado na culinária chinesa. Contém uma substância 
que reduz a formação de coágulos no sangue. 
 
B – Liquens (associação mutualística entre fungos e algas).8 
Freqüentemente encontrados nas superfícies de troncos de árvores, 
costões rochosos, etc. Importantes como indicadores ambientais, maior 
associação com determinados tipos de árvores. 
Talos: crustoso, folioso fruticoso, escamoso, leproso e gelatinoso 
Exemplo: Gêneros Parmelia e Physcia (Ordem Lecanorales), com talos 
foliosos e apotécio marrom escuros. Encontrados em troncos de árvores. 
 
C – Fungos em alimentos 
Exemplo: Queijo gorgonzola, maturado na presença de Penicillium 
roquefortii. O fungo oxida os ácidos graxos do queijo, produzindo metil 
cetonas, particularmente 2-heptanona, a qual acredita-se dá ao queijo o seu 
penetrante aroma e sabor. 
 
D - Deterioração de alimentos (bolores) 
Exemplos: pães embolorados (principalmente dentro de sacos plásticos); 
frutas (possível visualizar o efeito degradativo das enzimas extra-celulares). 
 
 
Caracterização microscópica de diferentes materiais fúngicos pelo 
preparo de lâminas com Fita Adesiva (Durex) e coloração com 
Lactofenol Azul Algodão (LFAA). 
 
Utilizar principalmente os diferentes produtos acima em deterioração. 
Preparar lâminas, observar ao MO e desenhar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fungos coprófilos: Estudo da sucessão em fungos coprófilos, 
caracterização do fototropismo positivo e de ejeção de esporângios 
em Zigomicetos do gênero Pilobolus. 
 
Material necessário: fezes de cavalo, frasco de vidro ou garrafas pet vazias 
e água potável. 
 
Procedimento: colocar 2-3 fragmentos de fezes no frasco, adicionar água de 
forma a manter o material com bastante umidade, mas preferencialmente 
sem excesso, e manter a temperatura ambiente próximo de luminosidade 
(janela). 
 
Esperado: Vário fungos vão crescer neste material. Inicialmente (após 3-4 
dias), fungos zigomicetos, principalmente o Pilobolus crystallinus, o qual 
 9 
apresenta um fototropismo positivo e um mecanismo de ejeção do 
esporângio, visíveis a olho nu. Outros zigomicetos também crescem nesta 
fase inicial. Após 1-2 semanas, outros fungos vão suceder no mesmo 
material, principalmente Ascomicetos dos gêneros Ascobolus, Saccobolus e 
Thecotheus (fungos com apotécios) e Podospora e Sordaria (fungos com 
peritécios). Finalmente, fungos basidiomicetos, principalmente do gênero 
Coprinus deverá crescer. 
 
Anotar e desenhar os resultados obtidos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fungos simbiontes de formigas cortadeiras: 
 
Formigas cortadeiras da Tribo Attini apresentam uma estreita associação 
com fungos basidiomicetos. Evolutivamente, há cerca de 50 milhões de 
anos atrás, várias espécies deste grupo de formigas desenvolveram a 
capacidade de cultivar fungos celulolíticos decompositores, os quais 
constituem a sua principal fonte alimentar. Formigas cortadeiras dos 
gêneros Atta e Acromyrmex, conhecidas com saúva-limão e quenquém, 
respectivamente, são as mais conhecidas em nosso meio. 
 
Montando a sua própria colônia: o processo inicia-se durante a revoada 
das içás que normalmente ocorre nos meses de outubro e novembro, 
quando as fêmeas são fecundadas, caem ao solo, perdem suas asas e 
iniciam a escavação de uma nova colônia. Cada fêmea já traz consigo um 
pequeno propágulo do fungo (Leucoagaricus sp) na sua cavidade bucal. 
Coletar estas fêmeas fecundadas e colocá-las individualmente em frascos 
plásticos contendo uma base de gesso molhado e solidificado (5-10 mm de 
altura), com teor médio de umidade. Manter este conjunto em sala ambiente 
com temperaturas de cerca 23-25º C, por várias semanas, adicionando 
pequenos volumes de água potável ou de torneira para manter a umidade 
relativa interna relativamente alta, mas não em excesso. Durante este 
período, a futura rainha do formigueiro irá regurgitar o inóculo de fungo, 
prover nutrientes para o seu crescimento a partir de suas próprias reservas, 
e ao mesmo tempo iniciar a postura de ovos, que após algumas semanas 
 10 
eclodirão em pequenas formigas operárias. A partir deste ponto, iniciar a 
introdução gradativa de “alimentos”, representado por folhas verdes. A 
umidade do ambiente interno do frasco deve ser mantida alta, pela 
aspersão eventual de água. Após alguns meses, o número de operárias se 
multiplica e colônia fúngica aumenta de tamanho, necessitando adicionar 
dois novos frascos (câmaras) conectados com tubos, ficando um deste 
destinado para adicionar alimento (folhas) e outro como lixo. Com o passar 
do tempo e aumento da colônia, novas câmaras poderão ser conectadas. 
 
Observação: As revoadas normalmente acontecem nos meses de 
outubro e novembro, após dias chuvosos e quentes. 
 
 
 
 
 
 
Bibliografia auxiliar: 
 
ALEXOPOULOS, C.J.; MIMS, C. W.; BLACKWELL, M. Introductory Mycology. John Wiley & 
Sons, New York, Fourth Edition, 1996. 
 
KENDRICK, B. The Fifth Kingdom. Third Edition. Focus Publishing, Newburyport, MA, 2000,386 
p. (www.mycolog.com/fifthoc.html). 
 
 
FUNGOS PATOGÊNICOS AMBIENTAIS QUE O BIÓLOGO E/OU 
LICENCIADO DEVEM CONHECER 
 
Principais espécies, características gerais e fatores de virulência 
 
 
1- Fungo dimórfico Sporothrix schenckii 
 
Observar e descrever o dimorfismo colonial das culturas 
 
 
 Forma M (micelial) 
 
 
 
 
 
 Forma L ou Y (levedura) 
 
 
 
 
 
http://www.mycolog.com/fifthoc.html
 11 
 
 Observar ao microscópio e desenhar as estruturas visualizadas 
 
 Forma M Forma L ouY 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2) Fungos dematiáceos (com melanina) 
 
-Fonsecaea pedrosoi 
 
-Phialophora verrucosa 
 
Descrever as características colôniais das culturas 
 
 
 
 
 
 
 
Observar ao microscópio e desenhar as estruturas microscópicas destas 
mesmas espécies. 
 
Cultura Cultura 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 12 
3. Paracoccidioides brasiliensis 
 
Observar e descrever o dimorfismo colonial das culturas 
 
 
 Forma M (micelial) 
 
 
 
 
 Forma L ou Y (levedura) 
 
 
 
 
 Observar ao microscópio e desenhar as estruturas visualizadas 
 
 Forma M Forma L ouY 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4) Cryptococcus neoformans 
 
Descrever as características coloniais da Cultura 
 
 
 
 
Observar ao microscópio e desenhar as características do Cryptococcus 
neoformans em uma lâmina corada com tinta da China.