CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS

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CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS
1 História da micologia
Para iniciarmos o estudo sobre a micologia, é interessante entendermos a história geral e como ela surgiu, bem como o que ela estuda e sua importância para as ciências biomédicas. Vamos nessa?
A história da micologia vem do século XVIII, quando a busca para entender as doenças microbianas se intensificou e começaram a encontrar os reais motivos que explicassem algumas doenças. Nessa época, um pesquisador de origem italiana se destaca, conhecido como Agostino Bassi (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 20).
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 20), Bassi foi um pesquisador apaixonado pela área da micologia e contribuiu para o esclarecimento de doenças microbianas de maneira fundamental, e é por esse motivo que ele é conhecido como o “Pai da Micologia Médica”.
Durante muito tempo, a micologia dentro das ciências biomédicas teve pouca expressão em virtude da falta de diagnósticos adequados e, portanto, do baixo desenvolvimento da área. Quando Linneu classificou os seres vivos de forma sistematizada, eles foram divididos em dois grandes grupos, conhecidos por reinos: Reino Animal e Reino Vegetal. Porém, como novos seres foram sendo descobertos e a ciência começou a evoluir de forma exponencial, alguns desses não entravam nos requisitos propostos por Linneu, para fazerem parte somente desses dois reinos e, então, essa classificação teve que ser amplificada. Assim, dois novos reinos foram adicionados: o Reino Protista e Reino Monera (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 23).
No entanto, os fungos ainda faziam parte do reino vegetal, provavelmente por apresentarem características semelhantes aos vegetais. Assim, a micologia acabava sendo um subtópico da botânica. Em pleno caos, de muitas novas espécies com estruturas diferentes às espécies vegetais, em 1969, Whittaker e colaboradores, percebendo que os fungos não possuiam todas as características semelhantes aos vegetais, resolveram criar um novo reino, o Reino Fungi. Essas características diferentes eram de não possuirem clorofila, possuírem parede de quitina e não de celulose e também por armazenarem glicogênio e não amido, como os vegetais (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 24).
Ainda, em 1978, um pesquisador chamado Carl Woose propôs uma classificação baseada na homologia de sequência do DNA ribossomal desses organismos. Por causa dessa classificação, os procariontes foram divididos em dois domínios: Bacteria e Archae. Já os eucariontes foram separados nos domínios chamados de Eukarya (formado pelos reinos Protista, Chromista, Fungi, Plantae e Animalia) (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 24).
Agora que você, estudante, conheceu um pouco de onde surgiu a divisão dos reinos de acordo com as características comuns à eles e percebeu em qual reino a micologia se aplica, vamos adentrar no estudos dos fungos?
A micologia, ou seja, o estudo dos fungos, é uma ciência muito ampla, que não se restringe a estudar somente um tópico. Dentro dela existem muitas subáreas, todas focadas nas possíveis aplicações e importância dos fungos. Existe a micologia médica, micologia vegetal, micologia industrial e entre várias outras.
No nosso caso, na área da ciência biomédica, falaremos bastante a respeito da micologia médica, uma vez que o estudo de fungos que causam doenças e os métodos de diagnóstico laboratorial se fazem importantes para sua profissão.
Em relação a importância dos fungos na nossa vida, podemos citar três grandes áreas principais: ecologia, indústria e alimentação e médica.
Como importância ecológica, podemos citar que os fungos participam de toda decomposição da matéria orgânica, juntamente com as bactérias, ou seja, reduzem a compostos mais simples dos restos de alimentos e seres mortos na natureza. Além disso, atuam na reciclagem dos elementos químicos na natureza, devolvendo ao meio ambientes os elementos essenciais para os seres vivos.
Como importância industrial e alimentícia, as leveduras são as responsáveis por realizar o processo de fermentação de pães e bebidas alcoólicas, bem como queijos. E, ainda, alguns tipos de fungos são utizados diretamente como alimentos, como os cogumelos champignons, shitake e shimeji, muito utilizados na cultura oriental e apreciados em muitos outros países.
Como importância médica, como já citado, eles são importantes pelas enzimas que produzem, as quais são utilizadas para produção de fármacos que levam à possibilidade de servirem como antibióticos, impedindo o crescimento e desenvolvimento de bactérias patogências a pessoas e animais.
1.1 Biologia dos fungos
Você certamente já notou, ao se deparar com um pão mofado, que ele estava cheio de pontinhos pretos, certo? Ou, ainda, já visualizou uma parede esverdeada mofada. Ou até mesmo já comeu queijo, tomou cerveja com os amigos comemorando algo. Você sabia que os fungos são grandes responsáveis por esses produtos? Eles se apresentam de diferentes formas, mas todos fazem parte do grande Reino Fungi. Vamos conhecer um pouco desse grande grupo?
Os fungos são conhecidos pela população como mofos e bolores. Porém, quase sempre são lembrados somente como danosos, seja causando problemas de saúde como alergias e micoses em pessoas e animais, ou parasitando plantas. Ou, ainda, lembramos deles causando estragos em materiais, seja por deterioração ou por somente dar aquele aspecto esverdeado e envelhecido nos objetos arquitetônicos. Além disso, estima-se que milhares de doenças causadas por fungos em plantas economicamente importantes levem à um prejuízo de mais de um bilhão de dólares por ano (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 330).
No entanto, eles podem e são muito benéficos. Existem muitas vantagens geradas pelos fungos, porém, elas não são tão divulgadas quanto os prejuízos. Todos os dias somos beneficiados por produtos originados direta ou indiretamente de fungos, conhecidos como biofábricas excelentes.
Os fungos são organismos eucarióticos, ou seja, seres que apresentam uma membrana nuclear que envolve o núcleo, o qual é definido e possui o material genético, formado pelos cromossomos e o nucléolo.
Esses organismos podem ser unicelulares (possuem uma única célula), ou multicelulares (possuem mais de uma célula). Eles são seres heterotróficos, o que significa que não possuem pigmentos fotossintéticos capazes de absorver energa luminosa como forma de síntese de compostos orgânicos. A maioria dos fungos possui sua parede celular composta por quitina (polissacarídeo presente em artrópodes) e α-glucano. Como exemplos de fungos multicelulares (os bolores) e podemos citar os fungos filamentosos, como os cogumelos. Já como fungos unicelulares, temos as leveduras (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 41).
Além disso, é válido ressaltar que, dentro do grupo de fungos filamentosos, existe uma variação que são os chamados fungos dimórficos, os quais se apresentam sob ambas as formas, dependendo principalmente da temperatura, mas sob influência também do teor de CO2 e condições nutricionais (ANVISA, 2016, p. 2).
A maioria dos fungos que conhecemos se origina nos esporos (quando a reprodução é sexuada) ou nos conídios (quando a reprodução é assexuada). Para que essa germinação aconteça, é necessário condições específicas, como calor e umidade (MOLINARO et al., 2009, p. 400).
O resultado dessa germinação é a formação de filamentos finos, que se chamam tubos germinativos. Esses tubos então vão se ramificando em vários sentidos e acabam formando uma grande massa filamentosa, formando o que chamamos de micélio, o qual constitui o sistema vegetativo (importante para a absorção nutricional do fungo e desenvolvimento do mesmo) (MOLINARO et al., 2009, p. 400).
Existem também uma variedade de filamentos mais simples que, em conjunto, formam o micélio, os quais chamamos de hifas. As estruturas reprodutivas são denominadas de corpo de frutificação e essa normalmente é a estrutura visível a olho nu nos fungos.
1.2 Nutrição e metabolismo dos fungos
Conforme já falamos anteriormente, os fungos não possuem clorofila e, por isso, o substrato que ele se encontra necessita fornecer todas as substâncias queele precisa para sobreviver, o que obriga os fungos a viverem em estado de saprofitismo, parasitismo, simbiose ou mutualismo. De acordo com Molinaro e colaboradores (2009, p. 402 e 403) sendo assim, podemos dividi-los em alguns grupos principais, tais como:
· Saprófitas obrigatórias: São fungos que vivem exclusivamente em matéria orgânica morta, não parasitando organismos vivos.
· Parasitas facultativos ou saprófitas facultativos: São aqueles fungos que causam doenças ou vivem em restos orgânicos, de acordo com as circunstâncias que se encontram.
· Parasitas obrigatórios: São os fungos que vivem exclusivamente atacando organismos vivos.
Para que cresçam e se desenvolvam, várias espécies não precisam de luz, já outras necessitam, para formar suas estruturas de reprodução, podendo ser consideradas fototróficas (as quais buscam a luz). A temperatura ideal para o desenvolvimento dos fungos se encontra entre 0º a 350°C, mas o ótimo para a maioria fica entre 20º a 300°C e a umidade ideal fica em torno da saturação (MOLINARO et al., 2009, p. 403). Ou seja, os fungos conseguem crescer e se desenvolver numa ampla faixa de temperatura, sendo considerados então cosmopolitas, pois estão presentes em qualquer parte do planeta, distribuindo-se no solo, no ar, na água, nos animais, nos vegetais, na matéria em decomposição, nos produtos de alimentação e entre outros.
2 Taxonomia e Classificação dos fungos
A taxonomia dos fungos é dividida, de forma tradicional, em características citológicas e morfológicas. É importante que você saiba que essa taxonomia atualmente pode ir mudando novas características serem adicionadas, com o desenvolvimento de técnicas bioquímicas e moleculares, como forma de auxiliar a identificação das espécies fúngicas. Técnicas como as baseadas na Reação de Cadeia da Polimerase (PCR), sequenciamento de DNA, isoenzimas e cromatografia são bons exemplos de possibilidades de identificação de novas espécies fúngicas (MOLINARO et al., 2009, p. 403).
Dividimos, então, o reino Fungi em sete filos: Chytridiomycota, Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microsporídia, Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota, e um grupo, os fungos anamórficos. Este último grupo não possui valor taxonômico, sendo seus membros relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota (MOLINARO et al., 2009, p. 403). Não se assuste com os nomes, logo falaremos de cada filo!
2.1 Filo Chytridiomycota
De acordo com Molinaro e colaboradores (2009, p. 404), esses são fungos saprófitos aquáticos, sendo poucos marinhos e muitos de água doce. Um exemplo de fungo desse filo é Chytriomyces sp.
Segundo Silva e Coelho (2009, p. 10) a maior parte desse tipo de fungo quitridiomicetos são saprófitos, existindo também espécies parasitas de plantas, animais e outros fungos. Quando são hospedeiros de vegetais, eles parasitam plantas superiores, musgos e fitoplancton. Em animais podem parasitar nematóides, rotíferos, mosquitos e besouros.
2.2 Filo Neocallimastigomycota
Representantes desse filo são encontrados no trato digestivo de mamíferos herbívoros e bem possivelmente em demais ambientes terrestres e aquáticos que sejam anaeróbicos. Exemplo desse filo são os Neocallimastix sp (MOLINARO et al., 2009, p. 404).
2.3 Filo Blastocladiomycota
Representantes desse filo são assexuados, habitam locais restritos de água e parasitam principalmente insetos. Exemplo desse filo são os Allomyces sp. e Coelomomyces sp (MOLINARO et al., 2009, p. 404).
2.4 Filo Microsporídica
Representantes desse filo não possuem mitocôndria na sua estrutura celular, além de serem parasitas obrigatórios de animais e, normalmente, hospedarem-se em peixes e insetos (MOLINARO et al., 2009, p. 404).
2.5 Filo Glomeromycota
Representantes desse filo são fungos filamentosos de micorrizas arbusculares, ou seja, participam de uma relação mutualistíca com algumas plantas. Exemplos são o Mucor sp. e Glomus sp. (MOLINARO et al., 2009, p. 404 e 405).
2.6 Filo Ascomycota
Esse é o maior grupo do reino Fungi, representando quase 75% de todos os fungos já descritos taxonomicamente. Representantes desse filo são fungos saprófitas, cosmopolitas e são parasitas especialmente de algumas plantas. Além disso, podem viver em associação mutualística com algas unicelulares formando o que chamamos de líquens. Exemplos são o Eurotium sp. e Emericella sp. (MOLINARO et al., 2009, p. 405).
Segundo Silva e Coelho (2009, p. 13) também existem ascomicetos parasitas de vegetais, os quais representam um grande problema econômico para muitos países, uma vez que por exemplo a espécie Cryphonectria parasítica ataca folhas de castanheiras, o que acaba comprometendo seu crescimento e prejudicando as plantações.
Os fungos comestíveis, conhecidos como morchelas, e também as trufas, são ascomicetos. Apreciadores procuram, e muito, o ascoma de Morchella esculenta e o cultivo dessa espécie só foi possível de ser realizado em 1983, não permitindo produção em escala industrial, o que torna essa espécie mais desejada ainda (SILVA; COELHO, 2009, p. 13).
Outra espécie de ascomiceto muito desejada por apreciadores é a espécie Tuber melanosporum é uma trufa comestível. Essa espécie é micorrízica das raízes de carvalho e mantém seus ascomas sob o solo, liberando seus esporos quando apodrecem ou são destruídos por animais (SILVA; COELHO, 2009, p. 13).
A maioria das leveduras também são ascomicetos unicelulares, e elas irão se dividir em diferentes 60 gêneros com aproximadamente 500 espécies conhecidas.
2.7 Filo Basodiomycota
Os fungos desse filo são saprófitos e cosmopolitas. São os cogumelos que tanto conhecemos. Exemplos desses fungos são Agaricus sp. e Rhodotorula sp. (MOLINARO et al., 2009, p. 406).
Portanto, dentro desse filo estão os fungos conhecidos popularmente como cogumelos e orelhas de pau, outros, chamados de fungos gelatinosos, gasteromicetos, ferrugens e carvões, e ainda espécies unicelulares. Na maioria, são fungos terrestres, existindo também muitas espécies parasitas (ferrugens), e, ainda, espécies que se formam de forma liquenizada. Estão por toda parte e são facilmente vistos em bosques, na natureza, em gramados e locais com umidade, devido ao fato de possuirem um considerável tamanho (SILVA; COELHO, 2009, p. 14).
No filo Basodiomycota, existem muitos fungos que produzem fungos de cogumelos comestíveis. Porém, é muito importante que você saiba que não se deve utilizar diretamente cogumelos retirados da natureza para alimentação, sem uma análise prévia de especialistas. Isso porque existem muitas espécies tóxicas para o corpo humano e somente especialistas teriam embasamento para analisar corretamente se a espécie é comestível ou poderia causar algum malefício para a saúde da pessoa ou animal.
Sendo assim, recomenda-se sempre comer somente cogumelos comercializados, pois esses já passaram por análise e produção especializada
2.8 Fungos Anamórficos
Os fungos desse grupo estão relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota e. por esse motivo, não foram classificados como um filo específico, pois possui sequências gênicas comparadas com esses dois. São cosmopolitas, saprófitos e parasitam especialmente animais e plantas. Os exemplos mais comuns são Aspergillus sp e Penicillium sp (MOLINARO et al., 2009, p. 406).
3 Drogas Antifúngicas
Cada vez mais as ciências biomédicas buscam novos tipos de fármacos antifúngicos, buscando atender as demandas cada vez maiores da micologia médica. As drogas antifúngicas surgiram muito depois das drogas antibacterianas, uma vez que os fungos, ao contrário das bactérias, são eucarióticos. Esse fato faz com quem terapias antifúngicas levem à efeitos colaterais e dificulte os estudos de novos possíveis fármacos (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 50).
O primeiro composto utilizado como antifúngico foi o iodeto de potássio. Esse composto químico, por mais que a micologia tenha se desenvolvido nos últimos anos, continua sendo a primeira escolha para tratamento de esporotricose ((SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 50).
No início da década de 1950, a nistatina tomou importância para tratar infecções causadaspor leveduras, como aqueleas relacionadas com Candida spp. e ela é muito utilizada até hoje para tratar infecções de pele e mucosas em geral. Em 1956, surgiu a anfotericina B e assim as micoses tiveram um grande avanço no que tange à possibilidade de tratamento, uma vez que fora somente essa droga capaz de terminar com as infecções fúngicas mais profundas (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 50).
O grande “boom” da micologia no que tange ao descobrimento de novas drogas antifúngicas fora a partir de 1965, com o benzimidazol e a partir dele, novos compostos conhecidos como miconazol, cotrimazol, econazol, isoconazol, ticonazol, cetoconazol, oxioconazol. E anos depois, da década de 1990, com derivados desses compostos, como fluconazol, itraconazol, voriconazol, ravuconazol e entre outros.
Em resumo, as drogas antifúngicas podem ser divididas em duas categorias principais:
· Agentes originados de micro-organismos
Como, por exemplo, a nistatina e anfotericina B.
· Agentes químicos
Como, por exemplo, o iodeto de potássio, derivados azólicos, alilaminas, derivados morfolínicos e equinocandinas.
4 Laboratório de micologia
De acordo com Sidrim e Rocha (2004, p. 63), as atividades dentro de um laboratório que atua com micologia devem seguir metodologias clássicas e seguir exigências prévias. A colheitas de materiais clínicos é a primeira etapa do diagnóstico laboratorial e deve ser feita de maneira mais correta possível, uma vez que se não for feita com cuidado e com técnica, pode inutilizar o material e prejudicar as análises posteriores.
Deve-se sempre questionar o paciente se ele se encontra em utilização de medicação antifúngica e, caso ele esteja utilizando, deve ser suspenso por um período de 15 dias antes da colheita, se for de uso tópico, e por 1 mês, quando se tratar de drogas de uso sistêmico (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 63).
É importante ressaltar que todo material coletado deve estar acompanhado de uma ficha padrão, contendo todos os dados pessoais do paciente, bem como os dados clínicos e epidemiológicos. Normalmente, as análises devem seguir no máximo em 2 horas depois, porém, quando não puder ser realizado nesse período de tempo, elas podem ser acondicionadas em refrigerador por até 24 horas, exceto em caso de zigomicose.
· Coleta de escamas de pele: Primeiramente deve-se realizar uma análise visual da lesão e, posteriormente, a assepsia com álcool isopropílico 70%. A seguir, com auxílio de uma cureta dermatológica ou lâmina de bisturi, deve-se raspar vigorosamente as bordas das lesões cutêneas ativas distruibuídas pelo corpo. Esse material deve ser acondicionado em uma placa de Petri estéreis
· Coleta de pelos e cabelos: Normalmente, quando se coleta cabelos, desconfia-se de dermatofitose do couro cabeludo. Para isso, deve-se coletar pelos e cabelos que tenham probabilidade de estarem infectados, otimizando o processo de isolamento de fungos dermatofíticos e esses pelos encontram-se nas regiões de alopecia (áreas de rarefação de pelos). Sendo assim, eles devem ser retirados por arrancamentos com auxílio de uma pinça flambada.
· Coleta de unhas: Para colheita de material das unhas, deve-se sempre possuir como material tesouras de várias dimensões, limas, alicates de unhas e diversas curetas dermatológicas. Quando coletas, deve-se sempre procurar retirar material da região de progressão e confluência do tecido doente
· coleta de mucosas, orifícios naturais e secreções diversas: Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 66), sempre que se coletar esse tipo de material, utiliza-se swab estéril e deve-se coletar, no mínimo, duas amostras de cada lesão. Caso não puder levar o material direto para o laboratório, deve-se acondicionar o swab em solução salina e mantê-los refrigerados por no máximo 24 horas.
No caso de lesões na boca, deve-se realizar uma raspagem ou biópsia da lesão com cureta dermatológica. No caso de lesões na vagina, coletam-se dois swabs, um para confeccionar lâmina histológica e outro para cultura microbiológica.
· Coleta de sangue periférico e medula óssea: Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 66), a metodologia é a mesma preconizada para hemocultura bacteriana, ou seja, realiza-se assepsia na região, coleta-se de 5 a 10 mL de sangue e precede-se com as recomendações do meio de cultura utilizado. Para análise de fungos no sangue, existem atualmente muitos sistemas automatizados, como o ESP (Difco), o BacT/Alert (Organon Teknika), o BACTEC e o BACTEC NR.Coleta de pus e liquidos patológicos: Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 68), esse tipo de coleta deve ser feito de forma mais limpa possível, ou seja, mas asséptica possível. De preferência, deve-se obter por punção de abcessos não abertos após realizar processo de assepsia com álcool 70% ou álcool iodado. Nesse tipo de coleta, entram os líquidos pleural, sinovial, ascítico, os quais devem ser processados imediatamente
· Coleta de urina: Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 67), a metodologia é a mesma preconizada normalmente para coleta de urina, porém deve-se ter cudiadosa degermação da região genitourinária externa com água e sabão neutro antes.
5 Diagnóstico laboratorial de fungos
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 69), existem principalmente duas etapas no diagnóstico laboratorial fúngico, a microscopia e a cultura.
5.1 Exame direto: Microscopia
A microscopia é a primeira etapa do diagnóstico laboratorial micológia, sendo ela considerada o exame direto nesse caso. Essa primeira etapa vai nos dizer se o material coletado possui ou não estruturas fúngicas e vai possibilitar uma análise prévia do tipo de fungo que estamos lidando (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 69).
São elas preparações montadas entre lâminas e lamínulas, imersas em alguma substância que facilite a sua visualização microscópica, como compostos químicos como hidróxido de potássio (KOH), hidróxido de sódio (NAOH), tinta da China ou K-tinta.
A coloração é muito utilizada nos laboratórios de Micologia para visualização das estruturas vegetativas e reprodutivas dos fungos, as formas de leveduras, e realizar testes de viabilidade.
Para análise de escamas de pele, pelos, cabelos e unhas coloca-se de 1 a 2 gotas de solução clarificante (hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio a 40% ou K-tinta) e, sobre estas, algumas escamas ou pelos/cabelos, ou ainda os fragmentos de unhas. Cobre-se com lamínulas e deve-se aguardar um período de 5 a 20 minutos. Em seguida, deve-se analisar o material em microscópio óptico com objetiva de 40x (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 69).
Para análise de mucosas, oríficos naturais e secreções diversas, como a coleta fora realizada com dois swabs, somente um é utilizado para preparação da lâmina. Realiza-se um esfregaço, que será corado pela prata-metenamina e outra lâmina com KOH. O segundo swab é utilizado para realização da cultura (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 70).
No caso de análise de escarro, pus e líquidos patológicos são preparadas três lâminas, uma do tipo lâmina-lamínula com KOH e as outras com esfregaços para ser corado com prata-metenamina e outro pela Giemsa.
5.2 Exame microscópico com hidróxido de potássio (KOH)
Realizar técnicas de microscopia com hidróxido de potássio é indicado para pelos, pele, unha, tecido obtido por biópsia, exsudatos espessos e outros materiais densos. Deve-se adicionar uma gota de KOH (aquoso a 20%) em uma lâmina de microscopia e sobre esta, uma pequena porção da amostra a ser analisada. Deve-se imediatamente cobrir a preparação com uma lamínula e, para intensificar a clarificação, pode-se aquecer ligeiramente, sobre a chama de um bico de Bunsen, sem deixar ferver a mistura. Examina-se a preparação após aproximadamente 20 minutos, em microscópio óptico comum, inicialmente, com objetiva de 10x, seguida de 40x (ANVISA, 2016, p. 7).
5.3 Exame microscópico com Tinta Nanquim (Tinta da China)
Segundo a Anvisa (2016, p. 7) essa técnica é usada em amostras de líquor, urina, secreções ou exsudatos, para visualização de leveduras capsuladas do gênero Cryptococcus, que se tornam mais evidentes contra o fundo negro, proporcionado pela tinta. Para realização da técnica,deve-se adicionar uma gota de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada sobre uma lâmina. Após, deve-se cobrir a preparação com lamínula e observar ao microscópio óptico (objetivas de 10x e 40 x).
Diferencia-se os tipos celulares pela refringência da parede celular e das inclusões no citoplasma das leveduras, em relação aos linfócitos, além da presença de brotamentos.
5.4 Exame microscópico com Coloração pelo Método de Gram
Segundo a Anvisa (2016, p. 7), como todos os fungos são caracterizados por serem gram-positivos, utiliza-se esse tipo de técnica não para diferenciar os organismos, mas, sim, para discriminar elementos fúngicos de artefatos existentes em urina, secreções e fezes. A amostra deve ser homogeinezada, em movimentos circulares, em uma lâmina de microscopia, fixada com calor e submetida à coloração.
5.5 Exame microscópico com Coloração Panótica (Giemsa, Leishman ou Wright)
Segundo a Anvisa (2016, p. 7), esse tipo de técnica é escolhida para pesquisa de Histoplasma capsulatum em diferentes amostras biológicas: medula óssea, sangue, aspirados e secreção cutânea. Nestes casos, deve-se fazer um esfregaço semelhante ao usado para coloração de Gram. Fixa-se com metanol e cora-se segundo o método escolhido.
6 Exame indireto: Cultura celular
Após o exame direto, a cultura é extremamente necessária para a possibilidade de se isolar e identifiar corretamente o fungo que estamos lidando. Assim sendo, as amostras devem ser semeadas em diversos meios de isolamento, sendo eles escolhidos de acordo com os achados micológicos do exame direto ou das preparações coradas e, também, pelo caso clínico da pessoa ou animal.
Os meios de cultura utilizados na micologia são preparações que devem conter as fontes nutricionais necessárias para o crescimento e multiplicação dos organismos. Cultivar micro-organismos dentro de uma placa de Petri pode ter diferentes finalidades, mas mas é importante saber que todo meio de cultura deve suprir as necessidades mínimas para que in vitro se consiga um ambiente parecido ao que se encontrava o organismo na natureza (MOLINARO et al., 2009, p. 425). Os meios de cultura mais utilizados na micologia são o Ágar Sabouraud dextrose (ASD), o Ágar Batata Dextrose, o Ágar Mycosel, o Ágar BHI (ágar infusão de cérebro e coração), Ágar extrato de malte (MEA).
Segundo a Anvisa (2016, p. 8), a amostra, após o processo de exame direto pode ser usada para isolamento do agente etiológico fúngico. Para isso, deverá ser semeada em movimentos de estrias (movimentos de “zig-zag”) sobre a superfície de meios sólidos de cultura, seja em tubos de ensaio ou ainda em placas de Petri, de acordo com o método de escolha.
De acordo ainda com a Anvisa (2016, p.9), esses meios de culturas, para que se possa isolar primariamente os fungos a partir de amostras biológicas, podem ser adquiridos prontos ou ainda podem ser produzidos no próprio laboratório, seguindo a recomendação dos fabricantes. Quando comprados comercialmente, eles vem desidratados e devem sofrer processo de hidratação, conforme instruções do fabricante, e, assim, o meio deve ser distribuído, de preferência, em tubos ou placas de Petri e esterilizados por autoclavação.
Quando estamos falando de solidificar um tubo contendo ágar, recomenda-se deixar o mesmo inclinado, deixando espaço de 3 cm do final do meio até a tampa, para evitar contaminação via meio externo. E quando necessitarmos isolar um fungo a partir de alguma amostra biológica dentro do laboratório? Para isso, devem ser utilizados meios não seletivos, que permitam crescimento de fungos patogênicos e bolores de crescimento rápido, ou seja, fungos que crescem em menos de 7 dias. Esse isolamento é muito importante para diagnóstico laboratorial das infecções ditas oportunísticas (ANVISA, 2016, p. 9).
O meio dito básico em um laboratório de micologia é o ágar Sabouraud dextrose (ASD), conhecido de ágar Sabouraud. Na maioria das vezes, deve-se adicionar um antibiótico para impedir o crescimento de bactérias que prejudicariam o isolamento fúngico (ANVISA, 2016, p. 9).
7 Identificação de fungos
O profissional responsável por analisar os exames micológicos deve tentar identificar todas as culturas positivas e emitir o resultado mais correto possível. Na maioria das vezes, o exame microscópico direto da amostra é suficiente para medidas de controle da infecção, entretanto, outras vezes, o isolamento por meio de cultura e identificação do fungo são imprenscidíveis para orientar a conduta clínica.
Essa identificação dos fungos deve contemplar o gênero e a espécie. Porém, em alguns casos, devido à complexidade do exame, não é possível dizer exatamente qual gênero e espécie é aquele fungo, assim nesses casos somente fala-se o grupo dos fungos (ANVISA, 2016, p. 12).
7.1 Identificação de fungos filamentosos
Segundo a Anvisa (2016, p.16), a identificação de fungos filamentosos baseia-se fundamentalmente na observação da morfologia da colônia e aspectos microscópicos. A análise da colônia objetiva observar: a cor, textura, superfície, pigmento difusível no meio de cultura, entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura primária do fungo. Porém, o mais correto de se fazer é analisar o chamamos de “colônia gigante”, ou seja, uma cultura feita no ponto central de uma camada de ágar distribuído em placa de Petri. A velocidade de crescimento, que pode ser rápida (menor que 7 dias), intermediária (de 8 a 14 dias) ou lenta (maior que 15 dias) é fundamental para que se possa identificar presuntivamente o fungo.
Mas como sabemos que trata-se de um fungo filamentoso? Normalmente, ao observar microscopicamente, somente ao observar estruturas típicas, como hifas hialina ou demácia, septada ou cenocítica, forma, disposição e formação de esporos já são suficientes para podermos concluir que estamos diante de um fungo filamentoso (ANVISA, 2016, p. 12).
Segundo Almeida (2011, p. 27) uma possibilidade é a técnica de esgarçamento, a qual é sempre utilizada como primeira tentativa, por ser mais rápida para identificar as colônias filamentosas. As estruturas fúngicas são quebradas, porém isso torna mais difícil a identificação.
Outra possibilidade de identificação é a de microcultivo em lâmina. No microcultivo em lâmina, as estruturas permanecem íntegras além de ser utilizado um meio de cultura (ágar batata ou ágar ASD), os quais estimulam a produção de macro e microconídeos, que na maioria das vezes identificam o fungo (ANVISA, 2016, p. 16; ALMEIDA, 2011, p. 27-30).
7.2 Identificação de fungos dimórficos
Fungos dimórficos são aqueles fungos filamentosos que podem, em algumas situações, assumir forma de levedura. Nessa forma, eles diminuem sua capacidade de filamentação e dividem-se por brotamento e, assim, suas colônias ficam com aspecto cremoso (ANVISA, 2016, p. 18).
Este tipo fúngico vai ocorrer normalmente sob temperatura acima de 30°C, preferencialmente à 37°C. São fungos de crescimento lento, na maioria das vezes mais de 15 dias, no primo-isolamento (Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis ou moderado (8 a 14 dias), como Sporothrix schenckii. Para que possamos identificar esses fungos, devemos comprovar por meio da visualização do e comprovação do dimorfismo e pelo aspecto microscópico característico de cada fase (ANVISA, 2016, p. 19).
7.3 Identificação de leveduras
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 89), em pessoas saudáveis, sabe-se que existe uma população de leveduras em pleno equilíbrio que fazem parte da flora microbiana normal do organismo. Seu número vai variar de acordo com o local, mas sempre vai estar em estado de equilíbrio sem causar-lhe dano. Isso quando está tudo certo com o estado imunológico. Porém, quando estamos com nossas defesas imunológicas descompensadas, esse número pode variar e elas podem colonizar um local anatômico, gerando infecções e problemas mais graves, levando a doenças geradas pelas leveduras, como é o caso por exemplo da candidíase, ocasionada pela Candida spp.
Ao contrário dos fungos filamentosos, a estrutura morfológicadas leveduras não apresenta muita diversidade e, portanto, nem sempre é um parâmetro suficiente para sua identificação. Em determinadas situações, no entanto, a identificação rápida, simples e presuntiva pode ser feita, e isso vai contribuir significativamente para o diagnóstico da infecção que acometeu o paciente (ANVISA, 2016, p. 12).
Deste modo, ao observarmos a levedura pelo microscópio e visualizarmos hifas hialinas e ramificadas, é sugestivo do gênero Candida sps e se, além disso, desenvolver clamidósporos, que são células de reserva, ou tubos germinativos, em determinadas condições “in vitro”, é identificada como Candida albicans. Outros gêneros como Cryptococcus, Rhodotorula, Geotrichum e Trichosporo, podem ser identificados apenas visualizando sua morfologia característica (ANVISA, 2016, p. 12).
As outras espécies e gêneros, por sua vez, necessitam de outras análises, como provas bioquímicas para identificação. No entanto, do ponto de vista clínico, na maioria das vezes não necessita-se saber acuradamente o tipo da levedura. No caso, essa identificação pode ter interesse epidemiológico. Já quando falamos de leveduras relacionadas a episódios de infecção hospitalar, há muita preocupação e necessidade de saber qual espécie estamos lidando (ANVISA, 2016, p. 12).
Mas então, como analisar leveduras? Deve-se realizar plaqueamento de cada colônia morfologicamente diferente e pura. De cada colônia se faz um repique em ágar ASF para posterior identificação. Importante ponto aqui é que somente podem ser utilizadas colônias de leveduras obtidas de amostras biológicas, quando estas encontram-se puras, ou seja, sem contaminação por bactérias ou outras espécies (ANVISA, 2016, p. 12).
7.4 Identificação de Candida albicans e Candida sp.
Segundo a Anvisa (2016, p. 13), as provas fisiológicas realizadas que são mais comuns e simples para identificar esse tipo de levedura são: tubo germinativo e filamentação em cultivo em lâmina. No cultivo em lâmina, avalia-se a capacidade de produção de hifas hialinas ramificadas, que podem se fragmentar em esporos, denominados artroconídios. Estas hifas ocorrem nos gêneros Geotrichum e Trichosporon. Ao analisar, caso a levedura forme essas hifas hialinas ramificadas sem fragmentação, provavelmente vai pertencer ao gênero Candida e se houver formação de clamidósporos característicos, vamos poder dizer que é Candida albicans.
7.5 Identificação de Cryptococcus
Para identificar esse tipo de levedura, normalmente utiliza-se a pesquisa de cápsula, a qual é uma característica marcante do gênero Cryptococcus. Essa técnica é realizada com uma gota de tinta nanquim e uma alçada da cultura. A cápsula, constituída de material polissacarídico, aparece como um halo claro ao redor dos blastoconídios de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lâmina (ANVISA, 2016, p. 13).
Além disso, ainda segundo a Anvisa (2016, p. 13), a prova positiva no teste da Urease é outra possibilidade de confirmação de Cryptococcus.
Segundo Almeida (2011, p. 30), o teste do tubo germinativo é uma prova que vai caracterizar rapidamente a levedura da espécie Candida albicans. A técnica é bem simples e é basicamente necessário semear um pequeno inóculo dessa levedura em soro, o qual pode ser de várias espécies animais. Os soros recomendados são o humano, o fetal bovino ou de cavalo ou albumina de ovo.
A técnica de microcultivo de leveduras baseia-se no princípio de que elas quando incubadas em meio contendo o detergente “Tween-80”, podem apresentar a capacidade de filamentar-se, formando pseudo-hifas e/ou hifas verdadeiras. E isso faz com que, por essas características específicas filamentosas, possa-se sugerir a espécie da levedura (ALMEIDA, 2011, p. 31).
A técnica de auxanograma (assimilação de carboidratos e nitrogênio), baseia-se, primeiramente, em avaliar a capacidade que as leveduras possuem de utilizar um carboidrato como única fonte de carbono. Assim, utiliza-se um meio basal sem carbono, onde a levedura será semeada. Após a semeadura, adiciona-se um carboidrato e observa-se a capacidade de utilização da fonte de carbono adicionada. Quando esse carboidrato é assimilado pela levedura, há crescimento desta ao redor da fonte de carbono (ALMEIDA, 2011, p. 34).
Além da capacidade de assimilar carboidratos, analisa-se também a capacidade de assimilar fonte de nitrogênio. Demonstrando a capacidade que algumas leveduras possuem de assimilar nitrato de potássio (nitrogênio inorgânico) como uma única fonte de nitrogênio na sua viabilidade biológica