CAPITULO 14 - RESUMO 6 - BIOMED 17 - AMANDA BEATRIZ - TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR

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TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR 
RESUMO – BIOLOGIA MOLECULAR 
SNUTAD E SIMMONS – FUNDAMENTOS DE GENÉTICA 6. ED. 
CAPÍTULO 14 – pag. 267 a 377 
Amanda Beatriz Adriano da Silva1 
 Devido à complexidade do genoma haploide de mamíferos, grande parte das 
técnicas utilizadas para análise de genes e de outras sequências de DNA precisam que a 
sequência esteja disponível em quantidade significativa na sua forma pura ou quase pura. 
Dessa forma, com o desenvolvimento de novas tecnologias de DNA recombinante e de 
clonagem gênica, os geneticistas moleculares ampliaram os métodos que possibilitam que 
genes ou outros segmentos de grandes cromossomos possam ser isolados, replicados e 
estudados por técnicas de sequenciamento de ácidos nucleicos, microscopia eletrônica e 
técnicas analíticas. Destacam-se dois métodos de amplificação dos genes ou de outras 
sequencias de DNA, nas quais, utilização de amplificação da sequência in vivo e outra em 
in vitro. 
 Na primeira metodologia, tem-se a produção de um minicromossomo (possui o 
gene de interesse) em um tubo de ensaio e, em seguida, é colocado em uma célula 
hospedeira, tal procedimento possui duas etapas: a incorporação do gene de interesse em 
um pequeno cromossomo autorreplicante e a amplificação do minicromossomo 
recombinante por sua replicação em célula hospedeira apropriada. Já na segunda 
metodologia, são sintetizados filamentos curtos de DNA complementares às sequências 
de DNA de cada lado do gene de interesse e são utilizados para iniciar sua amplificação 
in vitro por uma DNA polimerase especial denominada de termoestável (reação em cadeia 
da polimerase PCR). 
 Nesse sentido, tem-se as endonucleases de restrição que realizam cortes internos 
nas moléculas de DNA que são sítio-específicas, e suas enzimas de restrição tipo II só 
clivam as moléculas de DNA em sequências nucleotídicas específicas reconhecidas como 
sítios de restrição. Sua função biológica é de proteção do material genético das bactérias 
contra possíveis invasões por DNA estranhos como moléculas de DNA de espécies 
 
1 Discente do Curso de Biomedicina, Universidade do Estado do Pará, Campus VIII, Marabá/PA. 
diferentes ou DNA viral, por isso, podem ser chamadas de sistema imune dos procariotos, 
dessa forma, todos os sítios de clivagem são protegidos por elas, caso ela não esteja 
presente o DNA pode sofrer degradação. Ressalta-se, que geralmente as endonucleases 
de restrição reconhecem sequências de DNA que são palíndromos (pares de nucleotídeos 
que podem ser lidas indiferentemente da esquerda para a direita e vice-versa a partir de 
um eixo central de simetria), elas ainda podem realizar cortes em bisel, clivar dois 
filamentos de uma dupla hélice em diferentes pontos. 
 Os fragmentos de DNA produzidos, apresentam terminações unifilamentares 
complementares, se unem por ligações de hidrogênio e podem ser reunidos em situações 
apropriadas de renaturação através da enzima DNA ligase, possibilitando a reconstrução 
das ligações fosfodiéster faltantes em cada um dos filamentos, ou seja, as moléculas de 
DNA podem ser cortadas em pedações denominados como fragmentos de restrição e 
podem se unir pela DNA ligase. Então, uma molécula de DNA que apresente fragmentos 
de DNA de duas origens diferentes é chamada de DNA recombinante, para que ocorra a 
reconstrução das moléculas de DNA recombinante é necessária a amplificação dessas 
moléculas, ou seja, deve-se produzir várias cópias ou clones delas mesmas, isso acontece 
com a garantia de que um dos DNA parentais incorporados nessa molécula de DNA 
recombinando possua a capacidade de autorreplicação (vetor de clonagem). 
 O vetor de clonagem apresenta três principais componentes, o primeiro é uma 
origem de replicação, segundo é um gene marcador selecionável dominante e terceiro 
deve apresentar pelo menos um sítio de clivagem único para endonuclease de restrição 
(não interfere nem na origem de replicação e nem no gene marcador selecionável). São 
denominados polylinker ou sítio de clonagem múltipla os vetores de clonagem modernos 
que apresentam um grupo de sítios de restrição específicos. Existem vetores de clonagem 
que são versões modificadas de plasmidios, apresenta um fator limitante que é a aceitação 
de insertos relativamente pequenos de DNA estranho. 
 Existe a amplificação in vitro de genes de outras sequências de DNA que é 
realizada pela reação em cadeia de polimerase (PCR), onde a mesma abrange 
oligonucleotídios sintéticos complementares a sequências conhecidas que flanqueiam a 
sequência de interesse para amplificação enzimática principal do segmento interposto de 
DNA no tubo de ensaio. Esse método apresenta três etapas, a primeira tem-se o DNA 
genômico que apresenta a sequência a ser amplificada e é desnaturado por aquecimento 
à temperatura de 92°C por aproximadamente 15 segundos, em seguida, o DNA 
desnaturado é anelado na presença de excesso dos iniciadores oligonucleotídicos 
sintéticos através de incubação de ambos em 50°C a 60°C por 30 segundos (a temperatura 
ideal de anelamento depende da composição de bases do iniciador). Por fim, na terceira 
etapa, a DNA polimerase é usada para replicar o segmento de DNA entre os sítios 
complementares aos iniciadores oligonucleotídicos (DNA genômico desnaturado 
apresenta função de molde). 
 Dessa forma, as tecnologias de PCR possibilitam a obtenção de dados estruturais 
definitivos sobre genes e/ou sequências de DNA quando sua quantidade de DNA for 
muito pequena, o método também é muito utilizado em diagnostico de doenças humanas 
hereditárias (importante na utilização do DNA fetal que é pequeno), em casos forenses 
para identificação de indivíduos através de DNA isolado de amostras pequenas de tecido. 
Ou seja, graças a PCR é possível a identificação de sequências muito pequenas, como no 
caso de gotas de sangue, sêmen e fios de cabelo por exemplo, por isso, o método apresenta 
grande importância em casos jurídicos e para diagnósticos de diversas doenças humanas.