Fungos Microscópicos - Melhoramento de Penicillium roqueforti

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Gene replacement in Penicillium roquefort
Resumo por Camila Luiza Delaix
	O gênero Penicillium engloba fungos filamentosos com grande relevância industrial, que desempenham papéis importantes na produção de antibióticos e enzimas, por exemplo. O Penicillium roqueforti é utilizado ao redor do mundo para produção de queijos e, além disso, por tolerar baixa temperatura e conservantes, também é um comum agente de deterioração alimentícia. Apesar de serem fungos extensamente conhecidos e com papéis amplos na indústria, existe uma carência de ferramentas biotecnológicas para estudo e melhoramento desse gênero. Assim, é crucial que se desenvolvam técnicas moleculares apropriadas para transformação desse fungo. 
	Nesse artigo, os autores melhoraram um protocolo de transformação, transformando-o em um método eficiente de integração de genes em P. roqueforti. Para isso, eles melhoraram eficiência de transformação de protoplastos por 4 passos: Introduziram uma etapa de purificação de protoplastos; utilizaram sorbitol ao invés de NaCl para manutenção da pressão osmótica (o que também propiciou maior eficiência de transformação). Durante a transformação em si, foi introduzida uma etapa de choque-térmico para aumentar as chances de eficiência. Outra estratégia modificada foi passar todos os protoplastos que sofreram a a transformação para um meio de recuperação sem nenhuma força seletiva por 14h, e só então foram selecionados. Essa mudança no protocolo propiciou um resultado de 10 colônias resistentes por micrograma de plasmídeo (A eficiência original era 0.1-1 colônia por micrograma de plasmídeo).
	Como exemplo para a técnica, os autores fizeram a deleção do gene NiaD que codifica uma nitrato redutase NADPH-dependente, que reduz nitrato a nitrito. Fungos filamentosos selvagens são capazes de crescer em meios contendo nitrato como fonte de carbono, mas a versão mutada nesse gene não, pois não consegue metabolizar o nitrato. De forma contrária, a linhagem deficiente ΔNiaD é capaz de tolerar o clorato. Então esse gene possibilita ser marcador tanto positivo como negativo da linhagem mutante e é um ótimo candidato para ser usado nesse teste.
	Na época, ainda não estava disponível o genoma de P. roqueforti, então a estratégia foi se basear nas sequências de P. chrysogenum que se tornou disponível na metade da pesquisa dos autores. Utilizando primers desenhados para as sequências de P. chrysogenum¸ foi possível amplificar todo o fragmento correspondente ao lócus de PrNiaD, um fragmento de 4537 nucleotídeos.
	Para o nocaute do gene NiaD, utilizaram a técnica de recombinação homóloga. Eles construíram um plasmídeo que portava uma deleção completa do gene, carregando no seu lugar o gene de resistência a higromicina. Pela recombinação homóloga, houve um pareamento das regiões UTR do lócus NiaD com a região UTR do plasmídeo e ocorreu um crossover duplo, inserindo o gente da higromicina no lócus do gene NiaD do fungo. Eles confirmaram a transformação utilizando primers específicos para o gene da higromicina (havendo amplificação) e para a ORF de PrNiaD (não amplificou). Como esperado, o mutante ΔNiad não foi capaz de crescer em meio com nitrato mas se tornou mais resistente ao clorato do que a linhagem WT.
	Os autores discutem que existem métodos baseados em eletroporação de T-DNA ou transformação por Agrobacterium tumefaciens, mas que essas duas técnicas são demoradas e requerem a construção de um plasmídeo com T-DNA, assim como a compra de um eletroporador. O método apresentado no artigo é, então, uma opção mais adequada e que pode ser implementada em uma ampla gama de laboratórios, com uma alta eficiência de transformação. Além do mais, a clonagem no lócus de PrNiaD propicia uma seleção-dupla de mutantes resistentes, podendo ser reproduzida a fim de desvendar o funcionamento gênico de P. roqueforti.
Referência:
GOARIN, Anne; SILAR, Philippe; MALAGNAC, Fabienne. Gene replacement in Penicillium roqueforti. Current Genetics, [s. l.], v. 61, n. 2, p. 203–210, 2015. Disponível em https://link.springer.com/article/10.1007/s00294-014-0456-8. Acesso em 12 de março de 2023.