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FRACIONAMENTO DE PROTEÍNAS
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FRACIONAMENTO DE PROTEÍNAS
POR RETENÇÃO SELETIVA
 Cromatografia 
De adsorção
De troca iônica
De exclusão (tamanho)
De fase reversa
De afinidade
De interação hidrofóbica
 Altas 
Baixas 
HPLC
 Eletroforese em gel
PAGE
SDS-PAGE
Focalização isoelétrica
POR SOLUBILIDADE
Desnaturação seletiva
Precipitação
Partição bifásica 
POR TAMANHO/ SEDIMENTAÇÃO	 
Ultracentrifugação
Ultrafiltração
Diálise
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Ultracentrifugação
PRINCÍPIO/ SELETIVIDADE
Separação por coeficiente de sedimentação
A sedimentação pode ser feita em meio homogêneo contendo uma substância inerte (sacarose, CsCl, ...) na qual a concentração e portanto a densidade aumenta do topo para o fundo
PROCEDIMENTO/TIPO DE AMOSTRA
Solução contendo a macromolécula é colocada no topo de um gradiente de densidade.
Durante a centrifugação cada espécie se move através do gradiente, de acordo com seu coeficiente de sedimentação.
As zonas individuais são colhidas com auxilio de uma seringa.
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Ultracentrifugação
 Ultracentrifugação zonal (separação por s):
 Macromoléculas, organelas, vírus
Centrifugação diferencial 
Ex: 600 x g/10min  fração nuclear + cel. não rompidas.
 1500 x g/15min  mitocondria, lisossoma,...
 100000 x g/60min  ribossoma, retículo endoplasmático
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Ultracentrifugação
 Ultracentrifugação isopicnica
 (de densidade igual ou constante)
 
mistura uniforme da amostra com substâncias que formam o gradiente
centrifugação
gradiente é formado e as amostras se localizam nas suas posições isopícnica
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Ultracentrifugação
Coeficiente de sedimentação (s)
d x /dt 	(unidade)		onde: x = distância do centro de
 w 2 x					 rotação (cm)
					 w = rotação angular
						 (rad . seg –1)
Obs: este coeficiente é usualmente expresso em 
S(Svedberg ) 1 S = 10 –13 Seg
 
COEFICIENTE DE SEDIMENTAÇÃO DE ALGUMAS PARTÍCULAS
 Lisossoma	 9400 S	Virus mosaico do tabaco 198 S
 Ribossoma	 80 S	Molec. n-RNA 	 28 S
 Molec. t RNA 4 S Molec. Hemoglobina 4.5 S
 
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Diálise
PRINCÍPIO/ SELETIVIDADE
Difusão através de membrana semi-permeável
PROCEDIMENTO/TIPO DE AMOSTRA
O saco de diálise é preparado com carbonato/EDTA
Solução contendo a macromolécula é colo- cada no interior do saco /tubo de diálise contendo
 membrana semi- permeável com as extremidades fechadas
 Saco de diálise é imerso em um grande volume de novo
 tampão.
 Componentes de bx PM difundem pelos poros da membrana
 para o tampão e água entra no saco de diálise
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Diálise
O processo geralmente ocorre a bx T e com agitação constante
Após varias horas as [ ] dos dois meios está “equilibrada” estando as macromoléculas localizadas no interior e as outras no exterior.
O tampão pode ser trocado 2 ou 3 vezes para acelerar o processo que é geralmente demorado, ou quantas vezes forem necessárias para reduzir a níveis desejados ou eliminar o sal
APLICABILIDADE:
Para separar moléculas de PM muito diferentes
Para dessalinizar amostras provenientes de precipitação isoelétrica ou de outros procedimentos que contenham muitos contaminantes pequenos.
 sempre que for necessária a diminuição da .
COMENTÁRIOS
É uma técnica de grande utilização pois um grande volume pode ser dessalinizado em uma etapa. Por outro lado é um processo demorado e utiliza grande quantidade de tampão.      
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Cromatografia de Exclusão 
PRINCÍPIO/ SELETIVIDADE
Separa ptns globulares pelo tamanho
PROCEDIMENTO/TIPO DE AMOSTRA
A coluna é empacotada (pérolas porosas de material polimérico, geralmente constituídas de PS com tamanho de poro controlado). 
 A amostra é aplicada no topo da coluna.
 A ptn é eluída pela passagem de um volume definido de tp adequado, pela matriz. 
O tp de eluição é as vezes denominado fase móvel e o gel constitui a fase estacionária.
As moléculas maiores que não são capazes de penetrar nos poros da peneira serão eluídas antes das menores
 			(Vo) – maiores		(Ve) – menores
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Cromatografia de Exclusão 
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Cromatografia de Exclusão 
COLUNAS:
POLIACRILAMIDA – Biogel P-2, P – 6,…., P-300 (0,1 – 400)
DEXTRANA – Sephadex G10, …….., G-200 90,05 – 600)
AGAROSE – Sepharose 6B, …………… , (10 – 40000)
	A resina pode conter resíduos carregados de modo a combinar: dois princípios: troca iônica e filtração em gel
DEAE-Sephadex – dietilaminoetil(+) + Dextana
Biogel CM – Carboximetil (-) + Poliacrilamida
RESOLUÇÃO:A resolução depende:
do tamanho da coluna (em geral é diretamente proporcional)*
da tx de eluição
do tamanho do poro (em geral é inversamente proporcional)
do tamanho da partícula
*o aumento do comprimento da coluna pode diminuir a eficiência da separação se ocorrer difusão da amostra a medida que ela atravessa o gel
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Cromatografia de Exclusão 
APLICABILIDADE
Purificação 
Determinação do PM - Como o tamanho de uma ptn globular é relacionado diretamente ao seu PM, diz-se que a separação ocorre em função do PM e portanto pode-se estimar o PM das ptns, por comparação do seu volume de eluição ou do tempo de retenção com o de padrões (curva padrão: logPM x V ou t). 
Há relação linear entre Ve e Log PM em uma determinada faixa de PM (10.100 kd) exceto com ptns não globulares ou ácidos nucléicos . Pode-se e muitas vezes se utiliza a forma desnaturada da ptn, para garantir que apresentam formas “semelhantes”. 
Técnica de apoio para preparação de amostra
Para remoção de sais e moléculas pequenas que se encontram na preparações enzimáticas durante o processo de purificação
Para dessalinização pode-se usar 25% do volume da coluna, já que não se requer alto grau de purificação da ptn.
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Cromatografia de Exclusão 
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 Cromatografia de Afinidade
	
  PRINCÍPIO/ SELETIVIDADE
 Difere das demais técnicas pois explora uma propriedade BIOLÓGICA particular da molécula de interesse ou de uma classe de moléculas*, tendo portanto aplicação limitada. 
 O que torna atraente esta técnica é a possibilidade de levar à homogeidade, uma ptn em uma única etapa.
*ex: moléculas muito parecidas – Ptn G e Ptn A que se ligam a IgG ou técnica utilizando lecitinas (ptn que ligam carboidratos) para purificação de carboidratos e glicoptns.  
	
  A ligação ocorre entre o grupo carboidrato da glicoptn e a lecitina imobilizada, não sendo portanto específica para uma única ptn, mas para uma classe delas cujos componentes contenham alguma semelhança estrutural no carboidrato 
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 Cromatografia de Afinidade
	
  PROCEDIMENTO/TIPO DE AMOSTRA
 reagir o suporte com um agente ativador (por exemplo agarose com brometo de cianogênio) para formar um complexo ativado (disponível comercial).
 reagir o ligante com a agarose ativada para formar uma ligação covalente.
Aplicar a amostra, geralmente em pH apropriado e em [sal] fisiológica. Outras vezes são necessárias altas [salinas] já que a afinidade com o ligante é uma resultante das interações hidrofóbicas e hidrofílicas que ocorrem simultaneamente. 
 A ptn que possui afinidade pelo ligante, se liga fortemente ao suporte e amostras diluídas podem ser aplicadas graças ao efeito de concentração do gel.
 As demais ptns são eluídas com o eluente
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 Cromatografia de Afinidade
A eluição pode ser feita de duas formas:
 pela adição de solução bem concentrada do ligante livre (anticorpo p.ex) que deslocará a ptn. O ligante livre que agora está ligado a proteína pode ser separado da mesma por diálise
 com gradiente de pH (linear ou em degraus).
Para ligantes que se ligam a classes de enzimas e/ou quando a eluição com o ligante livre for muito dispendiosa, impraticável e inconveniente pode-se utilizar esta estratégia. No caso de classes de enzimas, subclasses podem ser separadas com a utilização de gradiente de pH (linear ou de pequenos degraus). Imediatamente após a eluição o pH é corrigido para o valor onde a ptn é mais estável
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 Cromatografia de Afinidade
	
  APLICABILIDADE 
  É a técnica de purificação mais poderosa com relação à resolução e
especificidade, porém mais cara.
 
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 Cromatografia de Afinidade
 COMENTÁRIOS
De um modo geral, a ptn de interesse é lavada (livre de impurezas e liberada da coluna) com o uso de uma substância que tenha mais afinidade pela ptn do que o ligante ou por alteração das condições que altere a ligação entre ligante-ptn 
A técnica em coluna difere da técnica em batelada no fato de que a aplicação de um gradiente pode separar em alguns casos subclasses de ptns (ex Ptna A e G).
A resolução não é tão afetada pelos mesmos parâmetros que a TI e a CIH e depende quase exclusivamente da interação ptn-ligante
VARIAÇÕES : CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE COM METAL IMOBILIZADO (CAMI ou IMAC) 
 Tem sido útil para purificar ptns que utilizam metais na catálise (metaloptns), ou que possuem grande quantidade de resíduos HIS. O íon metálico é imobilizado no gel e a ptn é aplicada na coluna onde se liga ao íon e pode ser liberada do gel pela eluição com solução concentrada do mesmo íon.
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Cromatografia de Adsorção 
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Cromatografia de Interação Hidrofóbica
 Altas  Baixas  
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 PRINCÍPIO/ SELETIVIDADE
 Separação em função da filtração em gel e da mobilidade eletroforética.
 A separação por este método baseia-se principalmente no tamanho da proteína.
 PROCEDIMENTO/TIPO DE AMOSTRA
Polimerização do gel em tp adequado (pH 9.0 p/ptn)
A polimerização é feita no momento da preparação do gel.
Usa-se géis com 3.5 a 25% da polimerização.
Quanto maior a concentração de poliacrilamida no gel, menor sua porasidade.
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 
Gel: poliacrilamida (com ligações cruzadas) 
 Acrilamida 		+	N,N-metilenobisacrilamida
 	 O			 O O
 	 II	 II	 II	
 CH2= CH C-NH2		 CH2=CH-C-NH-CH2 – NH-C-CH=CH2
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Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 
Amostra (cerca de 10g ptn) dissolvida em glicerol ou sacarose (p/ñ se misturar com tp) é aplicada no topo do gel em locais apropriados.
Corrente é aplicada (8OO v) 30-90 min.
O gel é removido
É feita a revelação
 Retarda as grandes
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Revelação do Gel: 
Comassie blue: detector bondas com 0,1g proteína
Corante de prata: detecta bondas com 0,02g proteína 
Autoradiografia: a sensibilidade depende da marcação isotópica.
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 
SDS – PAGE: Sodium dodecylsulfate (desnaurante)
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Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 
 Martins, 2001
1- marcadores de PM:
 fosforilase (97kDa), 
 albumina de soro bovino 
 (66kDa), ovalbumina 
 (45kDa) e anidrase 
 carbônica (29kDa);
 2 – Lipase de C.viscosum 
 (30kDa);
 3 – F; 
 4 - P70D; 
 5 – ENI; 
 6 – EID; 
 7 – EFI; 
 8 - Lipase de R.arrhizus
 (27 kDa).
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Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
ZIMOGRAMA
 1 2 3 4 5 6 7
	 Martins, 2001
Gel contendo óleo de oliva como substrato e Rhodamina como indicador.
1 – Lipase de C.viscosum (30kDa); 
2 – F; 
3 - P70D; 
4 – ENI; 
5 – EID; 
6 – EFI;
7 - Lipase de R.arrhizus (27 kDa).
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GRADIENTE DE pH
 ESTABILIDADE POR ANFÓLITOS
Resolve proteínas que diferem 0,01 unidades de pH em seus pI
Focalizalização isoelétrica
ACOPLAMENTO DOS DOIS MÉTODOS
1a Submete a mistura a uma corrida de focalização isoelétrica.
2a Coloca-se este gel sobre outro com SDS e procede-se a uma 2a corrida.
Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida de uma preparação bruta de E.coli. (mais de 1000 bandas isoladas)
 
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Outros
Video eletroforese/pcr