CRIOPRESERVAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES

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PRINCÍPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO DE 
 ESPERMATOZÓIDES 
 Criopreservação: manutenção da viabilidade de 
 órgãos, tecidos e células através de estocagem a 
 temperaturas extremamente baixas por período 
 indefinido; 
 Os sptz foram as primeiras células estudadas para a 
 congelação; devido a possibilidade de definir se a célula 
 está movel ou não (por meio da viabilidade), pelo 
 interesse pela inseminação artificial (demanda da 
 produção animal), e pela facilidade de obtenção de 
 amostras; 
 HISTÓRICO: 
 O primeiro estudo de criopreservação foi iniciado por 
 Spallanzani, onde foi observado que a redução na 
 temperatura diminuía reversivelmente a atividade 
 metabólica do sptz possibilitando o seu armazenamento; 
 porém foi com uma descoberta acidental de que o glicerol 
 atuava como crioprotetor (atuando impedindo a formação 
 de gelo intracelular) de células é que o uso desta técnica 
 iniciou-se, dando origem aos programas de inseminação 
 artificial com sêmen congelado; 
 Vantagens: 
 Viabilidade do sêmen 
 Interior da fêmea Exterior da fêmea 
 Puro 5-11 dias 60 min 
 Resfriado 2 dias 2-11 dias 
 Congelado 24 horas infinito 
 Bem como a logística da aplicação de 
 biotecnologias da reprodução; redução de custos 
 e riscos para importação e exportação de material 
 genético (transporte, quarentena); ganho 
 genético; utilização por tempo indefinido; maior 
 controle das doenças sexualmente transmissíveis. 
 Desvantagens: formação de cristais de gelo; 
 aumento da osmolaridade (efeito solução); 
 Solução: crioprotetores; velocidade de resfriamento e 
 congelação; 
 CRIOPROTETOR: substâncias que protegem a célula 
 durante o congelamento e descongelamento; 
 Não possui mecanismos não completamente elucidados: 
 reduzem o ponto de congelação H2O, evitam formação 
 gelo intracelular, desidratação celular controlada; 
 Características desejáveis: baixo peso molecular e 
 toxicidade, e alta solubilidade em H2O; 
 Classificação dos crioprotetores: por meio de sua 
 habilidade em atravessar a membrana 
 (penetrantes ou intracelulares) ou não (não 
 penetrantes ou extracelulares); 
 Crioprotetores penetrantes: moléculas pequenas 
 que penetram pela membrana celular; formam 
 ligações de hidrogênio com as moléculas de água; 
 diminuem o ponto de congelação e inibem a 
 formação de cristais de gelo; 
 Exemplos: glicerol , propileno glicol, dimetil sulfoxido, 1-2 
 isopropanodiol, etilenoglicol, metanol, etanol, acetamida, 
 formamida; 
 Glicerol (mecanismo de ação): liga-se à água no citoplasma 
 alteram seu ponto de fusão; além disso, quando se ligam 
 com a água livre, formam pontes de hidrogênio que 
 interferem no seu ponto de cristalização; dessa forma, 
 existe menor probabilidade de formação de cristais de 
 gelo lesivos às células espermáticas; 
 Efeito negativo: efeito direto na permeabilidade da membrana; 
 as pontes de hidrogênio com grupos fosfatos dos fosfolipídios 
 diminuem a fluidez; interage com proteínas de ligação e 
 glicoproteínas (agrupamento de partículas); diminui a 
 capacidade elétrica; 
 Crioprotetores extracelulares: não penetram pela 
 membrana plasmática das células; atuam no meio 
 externo na estabilização e reparação da 
 membrana plasmática, e durante a 
 descongelação, previnem o choque osmótico; 
 Substâncias com capacidade de proteção à crioinjúria: 
 exercem proteção via efeitos osmóticos, promovendo um 
 meio hipertônico que provoca a saída de água do meio 
 intracelular, levando à desidratação dos espermatozoides 
 e diminuindo a probabilidade de se formarem cristais de 
 gelo no interior das células; 
 Exemplos: gema de ovo, açúcares (glicose, frutose, lactose, 
 sacarose, trealose), lipídios (gema de ovo, liproteína de 
 baixa densidade), proteínas de leite (caseína), 
 aminoácidos (glutamina, histidina, prolina), polímeros 
 sintéticos de alto peso molecular (álcool polivinílico, 
 metil celulose); 
 Gema de Ovo: comum nos diluentes de sêmen, protege o 
 sptz contra choque térmico, confere proteção à 
 membrana durante congelação e descongelação, permite 
 diminuir os níveis de glicerol; questões sanitárias 
 (contaminação); 
 Mecanismo de ação: pouco conhecido; função de proteger 
 os espermatozóides contra o choque pelo frio, de forma a 
 preservar a motilidade espermática e as membranas 
 acrossomais, bem como reduzir a perda de enzimas; 
 Efeito negativo: aumento da osmolaridade (efeito solução); 
 toxicidade das substâncias; lesão durante o processo; 
 Solução (para o aumento da osmolaridade): velocidade de 
 resfriamento e congelação (resfriamento lento e congelação 
 rápida); 
 Crioinjúrias: danos bioquímicos e funcionais, injúrias 
 oxidativas, formação de cristais de gelo, lesões no DNA, 
 alterações na membrana plasmática; 
 Solução: redução do volume do crioprotetor; avaliação de 
 melhores crioprotetores; redução do tempo de exposição; 
 DILUIDOR: aumentar o volume para facilitar o 
 fracionamento do ejaculado mantendo as 
 características do sêmen; 
 Prover nutrientes como fonte de energia; garantir uma 
 fonte que sirva de tampão como prevenção de alterações 
 de pH; garantir a pressão osmótica fisiológica e 
 concentração de eletrólitos; prevenir o crescimento de 
 bactéria; proteger contra o choque térmico durante a 
 congelação; ter capacidade crioprotetora para reduzir as 
 lesões pela congelação; 
 Crioprotetores (glicerol, gema de ovo, glicose) 
 Osmolaridade (sais) 
 pH (tampões; ácido cítrico) 
 Nutrientes (frutose, glicose, gema de ovo) 
 Antibióticos 
 Infinitas combinações: as variações dependem do 
 propósito, espécie, raça, e características individuais; 
 Meios de armazenamento: pellets, ampolas, 
 palhetas (principal, devido sua maior superfície 
 de contato e homogeneidade); 
 TÉCNICA DE CRIOPRESERVAÇÃO DE 
 ESPERMATOZOIDES 
 CONGELAÇÃO DO SÊMEN : primeiramente é feita a 
 congelação do sêmen para a avaliação da sua 
 qualidade; é feito o espermograma e 
 criopreservação; é preciso descongelar uma 
 palheta do lote de sêmen e realizar o 
 espermograma para avaliar a qualidade da 
 congelação; 
 Sequência: preparo do material (checklist); colheita; 
 avaliação e pré-diluição (fornecimento de nutrientes); 
 diluição; envase e estabilização; congelação; 
 descongelação e reavaliação; 
 Material: nitrogênio líquido (verificar se tem volume 
 suficiente); diluente (descongelar); geladeira (5°C) e ar 
 condicionado; preparar os equipamentos básicos e 
 espermograma; identificação para a ficha de congelação e 
 mapa do botijão; laudo andrológico anterior (verificar 
 alterações); 
 Dados obtidos da avaliação do sêmen: volume do 
 ejaculado, motilidade / vigor, concentração 
 espermática e porcentagem de defeitos (maiores 
 e menores); 
 Valores mínimos de qualidade (bovino): mínimo de 70% de 
 motilidade, 3 de vigor; e achados patológicos em até 30% 
 defeitos totais (até 10% defeitos maiores e 20% defeitos 
 menores); 
 Fatores a serem considerados para o cálculo de doses: 
 volume do ejaculado, motilidade, concentração 
 espermática, perda na congelação, dose 
 inseminante e volume da palheta (0,5 ou 0,25 ml); 
 MÉTODO : pré-diluir o sêmen antes de fazer todos 
 os cálculos garante melhor viabilidade do 
 ejaculado; 
 1°Saber quantos sptz tem no ejaculado 
 (multiplicar a concentração pelo volume); 
 2° Saber quantos sptz estão viáveis neste 
 ejaculado (multiplicar o n° de sptz no ejaculado 
 pela motilidade sptz no ejaculado); 
 3° Saber quantos sptz estarão viáveis após a 
 descongelação (multiplicar o número de sptz 
 viáveis no ejaculado pela porcentagem de células 
 sobreviventes a congelação); 
 4° Saber quantas doses inseminantes o ejaculado 
 pode originar (dividir o número de sptz viáveis 
 após a congelação pelo número de sptz na dose 
 inseminante); 
 5° Calcular o volume de sêmen + meio, 
 dependendo do volume da dose inseminante 
 (palheta de 0,5 ou 0,25 ml); 
 6° ESCOLHA DO DILUIDORES: 
 Two step (frações A e B do diluidor): ambas devem ter o 
 mesmo volume: na fração A irá conter o diluidor sem o 
 crioprotetor e o ejaculado, e na fração B contém o 
 diluidor e 14% de crioprotetor (glicerol em dobro para a 
 mistura das duas frações para totalizar 7% da diluição); 
 eles irão ser misturados após a diluição do sêmen; 
 Considerar diluidor no sêmen utilizado na pré-diluição; 
 One step (com diluidor com uma fração): fração única a 
 35°C, e glicerol final 7%, onde a soma é a dose da palheta; 
 Se o meu diluidor já tem como constituinte o glicerol, 
 obrigatoriamente é feito o one step; 
 O material é envasado na temperatura ambiente e após 
 isso é feito o resfriamento; 
 7° Resfriamento e mistura as frações: ejaculado e 
 diluidor (fração A) no banho-maria (37°C); 
 mistura do sêmen lentamente; resfriamento (1,5-2 
 horas a 5°C); mistura da fração B (5°C) 
 lentamente (1 hora para a glicerolização); 
 Controle da temperatura da geladeira/câmara fria e do ar 
 condicionado do laboratório; 
 8° Envase e estabilização: identificação (nome do 
 reprodutor, registro e partida) e resfriamento 
 prévio das palhetas; envase é feito dentro da 
 geladeira; 
 9° Congelamento final e armazenamento: manter 
 sobre o vapor de nitrogênio líquido por 15-20 
 min, e após isso as palhetas são mergulhadas no 
 nitrogênio; 
 AVALIAÇÃO APÓS A CONGELAÇÃO: após 24 horas 
 (descongelar uma palheta e avaliar a motilidade); 
 Palhetas de 0,5ml 30 segundos em água a 35-37ºC 
 Palhetas de 0,25ml 20 segundos em água a 35-37ºC 
 Fazer espermograma completo : o mínimo esperado é 30% 
 de motilidade e 3 de vigor); 
 Teste de termorresistência: TT lento (38ºC/5h), e TT rápido 
 (46ºC/30 minutos); avaliando se o sêmen é resistente a 
 variações de temperatura; a motilidade deve ser maior 
 que 15%; 
 RESFRIAMENTO DE SÊMEN BOVINO: possibilidades 
 de uso quando necessário (somente para a 
 propriedade); o exame andrológico e cálculos de 
 qualidade são realizados antecipadamente, e um 
 dia antes da inseminação, o sêmen é coletado; 
 etapas (espermograma, diluição (sem perdas), 
 resfriamento (5°C), conservação/transporte, uso);