PRODUÇÃO DE EMBRIÕES

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PRODUÇÃO DE EMBRIÕES 
 COLETA DE EMBRIÕES IN VIVO: tem como vantagens 
 um menor intervalo entre gerações, melhor 
 aproveitamento reprodutivo dos animais e 
 qualidade dos embriões recuperados ( vs PIVE), 
 além do menor custo ( vs PIVE); e como 
 desvantagens a utilização de hormônios, e menor 
 quantidade de embriões produzidos ( vs PIVE); 
 SUPEROVULAÇÃO DAS DOADORAS (SOV): uma das 
 maneiras do FD manter seu “status” é produzir 
 substâncias que inibam o desenvolvimento de 
 outros folículos antrais; uma dessas substâncias é 
 a inibina (inibe a secreção do FSH); 
 A dinâmica folicular em animais zebuínos tem-se 
 mostrado diferente da de bovinos de raças européias, de 
 modo que o diâmetro dos FD e a área do CL são menores 
 nas fêmeas zebuínas; e em zebuínos, existem relatos que 
 descrevem maior incidência de três ondas, sendo 
 notificada à presença de até quatro ondas de crescimento 
 folicular por ciclo estral; 
 > 
 Cio natural: realizam-se oito aplicações de FSH 
 com intervalos de 12 horas, para aumentar o 
 recrutamento dos folículos e no 3° dia da SOV, 
 realizam-se duas aplicações de PGF2α 
 promovendo a luteólise, para que haja redução da 
 P4 e consequente pico de LH, ocorrendo assim a 
 ovulação; 
 O uso de P4 e E2 em protocolos foi um grande avanço 
 para a biotecnologia da reprodução animal, permitindo 
 que a SOV fosse iniciada em fases aleatórias do ciclo 
 estral dos bovinos pelo fato de sincronizar o início da 
 onda folicular; esses protocolos são tão eficazes no gado 
 taurino quanto no zebuíno; 
 > 
 BE + P4: o BE é utilizado com a função de 
 suprimir o desenvolvimento folicular, e sua 
 resposta é mais eficaz quando combinada com 
 aplicação de P4 IM (implante vaginal); 
 Inseminação com tempo fixo: nem sempre a 
 ovulação está sincronizada nos tratamentos de 
 SOV e, portanto há dificuldade no acerto das 
 inseminações realizadas, levando à recuperação 
 de inúmeras estruturas não fecundadas; o GnRH 
 tem sido utilizado para controle da ovulação no 
 final destes protocolos, assim como o LH; 
 COLETA DOS EMBRIÕES (técnica): primeiramente é 
 realizada a lavagem uterina 6-8 dias após a 
 primeira inseminação; 
 Equipamentos: sonda de Foley / mandril; equipo de 
 mangueira dupla (Y); PBS + antibiótico + SFB (25-30°C); 
 (DPBS (Dulbecco PBS); filtro de embriões; e anestesia 
 epidural (lidocaína) ou sedação (acepromazina); 
 > 
 A avaliação dos embriões é feita por meio de 
 estereomicroscópio e placa de petri; observa-se a 
 forma esferóide; simetria, aparência clara e nítida 
 dos blastômeros, assim como a compactação dos 
 blastômeros entre si; tonalidade escura e 
 uniforme; uniformidade da membrana celular; 
 integridade da ZP e ausência de fragmentos 
 celulares aderidos; proporcionalidade entre o 
 embrião e o espaço perivitelínico, e ausência de 
 vacúolo no embrião e fragmentos celulares no 
 espaço perivitelínico; 
 Utilizar embriões de grau I e II, a partir do grau 
 III há um desenvolvimento lento (somente TE 
 direta); realizada a avaliação, ele é direcionado 
 para a transferência ou criopreservação; 
 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES (PIVE): tem como 
 vantagens as mesmas da coleta de embriões, 
 ganho genético, capacidade de escolha de sexo, 
 como também permitir o uso em vacas que não 
 respondem a superovulação; uso em animais com 
 problemas reprodutivos; uso em animais mortos; 
 a não utilização de hormônios; produção de 
 maior número de embriões; e como 
 desvantagens , a pior qualidade dos embriões 
 (dentro da vaca o embrião consegue se maturar 
 com os componentes certos na hora certa), e o 
 custo mais alto; 
 Coleta do oócito (Complexo Cumulus-Oophorus): - 
 CCO): temos duas opções, post mortem , onde é 
 feita a punção folicular de ovários de abatedouro; 
 e in vivo , por meio da laparotomia ou 
 laparoscopia, ou ovum pick up ( OPU ), uma 
 aspiração folicular transvaginal guiada por 
 ultrassom; além disso é necessário utilizar 
 agulha, frasco coletor e bomba a vácuo; 
 Por ser um procedimento evasivo, necessita de anestesia 
 epidural feita anteriormente (5ml de cloridrato de 
 lidocaína 2%), e a limpeza da região perineal com água; 
 para auxiliar na técnica, é feita a palpação retal com uma 
 mão, e a utilização de transdutor vaginal na outra; os 
 folículos são aspirados por pressão da bomba a vácuo, e é 
 feita a manutenção dos oócitos em meio de recebimento 
 (PBS + heparina + antibiótico + soro fetal bovino); 
 A estimulação hormonal ou sincronização não tem ganho 
 real para a PIVE, sendo de decisão do veterinário e 
 viabilidade financeira a necessidade de usá-la; 
 Coleta de oócito em novilhas: tem vantagem na 
 aceleração de ganho genético; 
 Punção folicular de ovários de abatedouro: todo o 
 ovário é coletado e posteriormente é feita a 
 aspiração ou fatiamento (bisturi), e 
 armazenamento e transporte em NaCl 0,9% em 
 35-37°C e antibióticos; 
 Avaliação do CCO: é feita a filtração do líquido, 
 visualização, contagem e avaliação dos oócitos 
 (considera-se a espessura e compactação das 
 células do cumulus (maturação); aspecto do 
 citoplasma; e categoriza-se em grau I-V 
 (selecionar grau I e II); 
 As células do cumulus são importantes na maturação 
 nuclear e citoplasmática; a maturação in vitro é realizada 
 em um meio estável, já que as células interagem com ele; 
 MATURAÇÃO IN VITRO ( MIV): m aturação nuclear e 
 citoplasmática; consiste em um meio com 
 hormônios (FSH e LH), soro fetal bovino, 
 nutrientes (aminoácidos, vitaminas, lactato, 
 piruvato), antibiótico, e uma solução tampão; 
 Microgotas cobertas por óleo mineral, em uma estufa em 
 38,5ºC, com 5% de CO2, de 18-24hs; 
 FECUNDAÇÃO IN VITRO (FIV): 
 In vivo : capacitação do espermatozoide; 
 In vitro: necessário realizar a capacitação; 
 O sêmen congelado pode ser manejado por gradiente de 
 Percoll ou Swim-up para separar os espermatozóides 
 vivos e selecioná-los; 
 CULTIVO IN VITRO (CIV): é preciso auxiliar no 
 desenvolvimento embrionário; cultivo único de 
 embriões ou co-cultivo (células do cumulus, 
 evitando poliespermia); meio específico que 
 necessita da realização de feeding , colocando o 
 embrião em um novo meio de cultivo enquanto 
 ele se desenvolve (desenv. até mórula / blastocisto 
 (5-8 d); 
 Meios estáticos (não sequencial): deixa o embrião 
 "usar" o que ele quer quando ele precisar; mais 
 simples de ser aplicado; 
 Meios dinâmicos (sequencial): tenta "mimetizar" o 
 ambiente in vivo; é mais parecido com o ambiente 
 do oviduto, por isso dá mais trabalho (ideal); 
 DESTINO DO EMBRIÃO: criopreservação, 
 transferência (necessita que a fêmea esteja no d8 
 do diestro), e micromanipulação; indicar estágio, 
 grau e qualidade do embrião na palheta; 
 MICROMANIPULAÇÃO DE EMBRIÕES : bipartição de 
 embriões para a retirada das células para 
 avaliações moleculares ou de qualquer 
 parâmetro; somente 25% da massa celular total é 
 necessária para continuar o desenvolvimento; 
 Os embriões podem ser bipartidos nas fases de 
 mórula, blastocisto inicial e blastocisto; embriões 
 na fase de mórula podem ser bipartidosem 
 qualquer sentido; aqueles na fase de blastocisto 
 são divididos de forma a se obter metades 
 equitativas da blastocele e botão celular; 
 A divisão de embriões é uma forma segura e eficiente de 
 criar gêmeos monozigóticos; durante este procedimento, 
 o embrião é dividido em 2 metades usando um 
 micromanipulador e uma microlâmina; cada metade 
 produzida através da divisão do embrião é chamada de 
 demi-embrião; 
 Biópsia de embriões: é usada para avaliar o material 
 genético para diagnóstico de defeitos genéticos 
 específicos ou para determinação do sexo do embrião; 
 além disso, pode coletar material para testes genômicos;