Técnicas complementares na reprodução assistida

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Técnicas complementares na reprodução
assistida
Profª. Vanessa Nayane Pino Perez
Descrição
Técnicas complementares da reprodução humana assistida. Técnicas e indicações de criopreservação da
fertilidade. Tipos de diagnósticos pré-implantacionais e suas indicações.
Propósito
É importante compreender que, na reprodução assistida, existem técnicas complementares às técnicas
convencionais. Com elas, é possível preservar os gametas, embriões, tecidos ovarianos e óvulos, detectar
alguns problemas específicos que possam ser a causa da infertilidade e alcançar maior probabilidade de
uma gravidez bem-sucedida.
Objetivos
Módulo 1
Diagnóstico genético pré-implantacional
Reconhecer os tipos de diagnóstico pré-implantacionais.
Módulo 2
Criopreservação
Descrever as técnicas de preservação da fertilidade.
A fertilização in vitro (FIV) representa uma revolução no tratamento de casais com problemas de
infertilidade. Durante a realização da FIV, é possível utilizar técnicas complementares que têm como
objetivo superar problemas específicos que possam ser a causa da infertilidade. Essas técnicas
surgiram como modo de aumentar as possibilidades de uma gravidez bem-sucedida e são
procedimentos realizados de acordo com as necessidades particulares de cada paciente. Consistem
em exames ou tratamentos que visam analisar, identificar e tratar problemas específicos que
possam causar a infertilidade ou a transmissão de doenças, especialmente aquelas de origem
genética. Assim, ao longo deste conteúdo vamos conhecer as principais técnicas complementares
empregadas em reprodução assistida, são elas: o teste genético pré-implantacional (PGT) e a
criopreservação de gametas e embriões.
Orientação sobre unidade de medida
Em nosso material, unidades de medida e números são escritos juntos (ex.: 25km) por questões de
tecnologia e didáticas. No entanto, o Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o número
e a unidade (ex.: 25 km). Logo, os relatórios técnicos e demais materiais escritos por você devem
seguir o padrão internacional de separação dos números e das unidades.
Introdução
1 - Diagnóstico genético pré-implantacional
Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer os tipos de
diagnósticos pré-implantacionais.
Introdução ao diagnóstico genético pré-
implantacional
O diagnóstico genético pré-implantacional (preimplantation genetic testing, PGT) é um teste que foi
inicialmente idealizado para detecção de mutações gênicas a fim de evitar a transmissão de doenças
hereditárias aos filhos.
O primeiro relato de sucesso com esta técnica ocorreu em 1990, com a detecção de uma doença de
herança recessiva ligada ao cromossomo X, a adrenoleucodistrofia. Para isso, foi realizada biópsia
embrionária em estágio de clivagem, a técnica de PCR (do inglês, polymerase chain reaction), verificada a
sexagem embrionária e foram excluídos os embriões do sexo masculino, possivelmente portadores do X
alterado e candidatos a ter a doença.
Em 1992, o mesmo grupo reportou o uso do PGT de forma ainda mais específica – para evitar fibrose
cística. Portanto, o PGT poderia evitar inúmeros casos de doenças geneticamente transmissíveis e
incuráveis. Além disso, eles viram que alterações estruturais, como as translocações robertsonianas e as
translocações recíprocas, poderiam ser indicações para análise dos embriões.
Cariótipo apresentando translocação robertsoniana.
Translocações robertsonianas
Forma comum de rearranjo cromossômico que pode ocorrer nos cinco pares de cromossomos
acrocêntricos, ou seja, quando o centrômero está mais próximo das extremidades do que do centro, são
eles os cromossomos 13, 14, 15, 21 e 22.
Translocações recíprocas
Quando existe uma troca de partes de informações entre cromossomos diferentes.
A genotipagem do antígeno leucocitário humano (do inglês, Human Leukocyte Antigen) é outra aplicação do
PGT que, além de auxiliar na detecção de embriões afetados, pode contribuir para o tratamento de irmãos
que necessitam transplante de medula óssea compatível. A aplicação inicial do PGT evoluiu para uma visão
mais ampla do embrião, o rastreamento das aneuploidias, principal causa do insucesso reprodutivo. Logo, a
identificação dos embriões euploides compreende atualmente a imensa aplicação da biópsia embrionária
como forma de melhorar a eficácia da fertilização in vitro.
Diferentes tipos de testes genéticos pré-
implantacionais
No PGT, o conteúdo cromossômico total de uma ou poucas células é analisado com alta sensibilidade e
especificidade. No entanto, as células são obtidas a partir de um método invasivo e é necessário um alto
investimento para o laboratório com equipamentos especializados para a biópsia, como o laser.
Além disso, esse procedimento deve ser conduzido por embriologistas altamente
treinados para evitar viés dependente do operador nos resultados e para garantir o
mínimo impacto na viabilidade do embrião.
As denominações para os testes genéticos pré-implantacionais foram sofrendo alterações ao longo dos
anos. De acordo com a classificação mais recente da Sociedade Internacional de Diagnóstico Genético Pré-
implantacional (Preimplantation Genetic Diagnosis International Society - PGDIS), as siglas utilizadas nos
diferentes testes genéticos pré-implantacionais são:
PGT-A (Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidies)
O PGT-A (teste pré-implantacional de aneuploidias) é o mais comumente solicitado nos tratamentos de FIV
e tem como objetivo fazer um screening genético para identificar alterações quantitativas nos 23 pares de
cromossomos, apontando monossomias que podem ser parciais ou totais, trissomias, nulissomias etc.
Dentre as trissomias mais comuns e compatíveis com a vida estão:
Síndrome de Down
Trissomia do cromossomo 21.
Síndrome de Edwards
Trissomia do cromossomo 18.
Síndrome de Patau
Trissomia do cromossomo 13.
Alterações quantitativas ligadas aos cromossomos sexuais também podem ser compatíveis com a vida,
podendo aparecer na forma de trissomia (XXY - Síndrome de Klinefelter) ou monossomia (X0 - Síndrome de
Turner).
Monossomia do cromossomo X.
Trissomia do cromossomo sexual.
As demais monossomias e trissomias diversas que são frequentemente encontradas nos laudos de PGT-A
durante a rotina laboratorial são consideradas incompatíveis com a vida, seja por não permitirem o processo
de implantação, seja por desencadearem uma implantação seguida de aborto precoce.
Atenção!
Apesar das causas da aneuploidia ainda não serem bem compreendidas, sabemos que o mecanismo
cromossômico mais comum é a não disjunção meiótica pela falha da separação correta de um par de
cromossomos durante uma das duas divisões meióticas – geralmente durante a meiose I.
Os critérios de indicação para a realização do PGT-A, mais comumente empregados, são a idade materna
avançada (>38anos), falhas repetidas de implantação, abortos recorrentes e fator masculino grave. Além
disso, o uso do PGT auxilia no aumento de transferência de um único embrião, diminuindo o risco de
gestações múltiplas.
PGT-M (Preimplantation Genetic Testing for Monogenic
disorders)
O PGT-M (teste pré-implantacional para identificação de doenças monogênicas) é o teste indicado para
casais com alto risco pessoal ou familiar para doenças monogênicas. Para casais com risco aumentado de
gerarem filhos com doenças genéticas, o PGT-M pode ser realizado para selecionar embriões que não
tenham a mutação. Acompanhe a seguir:
Doenças monogênicas
Doenças monogênicas são um grupo de doenças genéticas causadas por uma mutação ou alteração na
sequência de DNA de um gene específico e transmitidas de forma hereditária.
Padronização para Doença Monogênica
E l é á i f t d éti é i d f íli h d d P d i ã
Como você deve ter percebido, o critério para indicação do PGT-M é o histórico familiar. Atualmente, o PGT-
M é realizado para mais de 400 desordens gênicas, incluindo aquelas manifestadas desde o momento do
nascimento, até as manifestações tardias, na vida adulta.PGT-HLA (Preimplantation Genetic Testing for Human
Leukocyte Antigen)
Neste caso, não se trata de evitar a transmissão de uma doença pré-existente ao futuro filho, como no PGT-
M, ou evitar aneuploidias, como no PGT-A.
O objetivo do PGT-HLA (teste pré-implantacional para a tipagem do HLA) é gerar uma gravidez a partir da
seleção de um embrião com HLA compatível ao de uma criança afetada por um distúrbio genético que
necessite de transplante de células-tronco hematopoiéticas (como nos casos de talassemia, leucemia etc.),
para que tenha chance de cura ou expectativa de vida prolongada.
Após a seleção por PGT-HLA e o nascimento desse bebê, as células tronco hematopoiéticas são coletadas
do sangue do cordão umbilical ou da medula óssea do irmão doador compatível, ou de uma combinação de
ambas as fontes, e utilizadas para transplante no irmão afetado. O PGT-HLA consiste na determinação
indireta do HLA para identificar haplótipos compatíveis entre os embriões testados e a criança afetada.
Em geral, é necessário fazer um estudo genético prévio da família, chamado de Padronização
para Doença Monogênica.
Detecção do histórico familiar
O PGT-M, portanto, é a técnica indicada para evitar a transmissão de doenças hereditárias pré-
existentes, como Fibrose Cística, Síndrome do X-Frágil, Distrofia Muscular, Doença de
Huntington, Anemia Falciforme entre outras.
Haplótipos
Haplótipo corresponde à combinação de um grupo de alelos de loci adjacentes, que fazem parte do mesmo
cromossomo, geralmente herdados como uma unidade. Um haplótipo pode ser formado por um ou vários
alelos, ou até pelo cromossomo inteiro.
PGT-SR (Preimplantation Genetic Testing for Structural
Chromosomal rearrangements)
PGT-SR (teste pré-implantacional para a detecção de alterações cromossômicas) é o teste genético que
identifica alterações cromossômicas envolvendo rearranjos estruturais nos embriões. Vamos entender
melhor?

Indivíduos com rearranjo estrutural balanceado
Nos casos em que um dos parceiros é portador de um rearranjo estrutural balanceado, como uma
translocação ou inversão, esse rearranjo resulta de uma quebra, recombinação ou troca
cromossômica, seguida de reconstituição em uma combinação diferente da normalidade e geralmente
não causa fenótipo no portador (um dos parceiros).

Embriões com possíveis rearranjos estruturais desbalanceados
Porém, os embriões gerados por esse indivíduo podem apresentar rearranjos estruturais
desbalanceados (ganho ou perda de um segmento cromossômico), que podem levar a falha de
implantação, aborto espontâneo ou síndromes genéticas. Como exemplo, podemos citar as
translocações robertsonianas como as mais comumente encontradas.
Rearranjo estrutural balanceado
Alterações estruturais sem a perda ou acréscimo do material genético.

PGT-P (Preimplantation Genetic Testing for Polygenic
disorders)
O PGT-P (teste pré-implantacional para doenças poligênicas) é a técnica mais recente de todas e ainda
pouco difundida. As doenças poligênicas são influenciadas por variantes genéticas em mais de um gene. A
combinação das variantes nesses genes afeta a probabilidade de desenvolver condições poligênicas
durante o curso da vida de um indivíduo.
Durante a classificação dos embriões por esta técnica, cada embrião recebe uma
pontuação chamada "Índice Genômico". Esse índice é calculado a partir da
combinação de pontuações poligênicas de diferentes preditores de doenças e pode
ser usado para comparar o risco geral de doença entre embriões e
consequentemente auxiliar na decisão de qual embrião selecionar para fazer a
transferência.
Esse índice é utilizado para o cálculo do risco proporcional do desenvolvimento futuro da doença em
comparação com o risco médio dessa mesma doença na população em geral. Diferentemente do que
vemos no PGT-A, no qual os embriões são classificados como “normal” ou “alterado”, ou no PGT-M, em que
recebemos o laudo de cada embrião como “portador” ou “afetado”, no PGT-P cada embrião recebe uma
“razão de risco” de desenvolvimento futuro de cada uma das doenças disponíveis para teste.
Saiba mais
As doenças poligênicas avaliadas pelo PGT-P são: diabetes tipo 1 e tipo 2; câncer de mama, de testículo, de
próstata; melanoma maligno; carcinoma basocelular; esquizofrenia; doença arterial coronariana;
hipercolesterolemia; hipertensão; risco de ataque cardíaco.
Por outro lado, o PGT-P é uma ferramenta de avaliação de risco e não um método de diagnóstico. Com o
uso dessa metodologia, há risco de descartar embriões que poderiam ter um desfecho saudável em relação
à doença poligênica testada. A maioria dessas doenças é influenciada também por fatores ambientais
(estilo de vida, hábitos alimentares) e esses fatores não podem ser considerados na análise embrionária.
NICS (Non-Invasive Preimplantation Aneuploidy Testing)
NICS (teste genético pré-implantacional não invasivo para aneuploidias) é um método não invasivo de
screening cromossômico baseado no sequenciamento do DNA genômico secretado no meio de cultura
durante o desenvolvimento embrionário.
Placa de cultivo embrionário individual.
Recentemente, o NICS-PGT-A com a análise do cfDNA (DNA livre circulante) embrionário liberado para o
meio de cultura foi proposto como uma alternativa para superar a biópsia embrionária para teste de
aneuploidia.
Para essa análise, é retirado o meio de cultura no qual o embrião se desenvolveu até o estágio de
blastocisto e enviado para análise genética.
No entanto, o NICS ainda apresenta certas limitações, entenda:
Resultados falso negativos
Estudos mostram resultados falso negativos, ou seja, quando a análise do DNA obtido a partir dos
meios de cultivo identificou alterações cromossômicas em embriões cromossomicamente normais.
Possível contaminação
Nesse caso, o erro foi atribuído pelos pesquisadores a uma possível contaminação por células
foliculares maternas que rodeiam o óvulo, denominadas células da granulosa.
Ainda é cedo para adotar o diagnóstico genético pré-implantacional não invasivo (NICS), pois outros
estudos precisam ser realizados para garantir a efetividade da técnica que, quando estiver pronta para ser
colocada em prática, representará um ponto de cisão entre o antes e o depois na medicina reprodutiva de
precisão.
Interpretação de resultados

Antes de conhecermos as técnicas propriamente ditas, precisamos entender algumas definições e
conceitos para compreender melhor o que estamos investigando e o que será encontrado no laudo do
exame. Algumas dessas definições você já conhece, são elas:
Embrião euploide
É um embrião geneticamente normal, com 46 cromossomos completos, incluindo 22 pares de
autossomos e um par de cromossomos sexuais.
Embrião aneuploide
É um embrião geneticamente alterado. Ocorre quando há perdas ou ganhos de segmentos
cromossômicos. Dessa forma, a falta de um cromossomo resultando em somente uma cópia
de um cromossomo específico se caracteriza como monossomia; a presença de um
cromossomo a mais, resultando em três cópias de determinado cromossomo, é
caracterizada como trissomia.
Mosaico
O i i d b iã t él l l id l id
Além desses conceitos precisamos conhecer outros, são eles:
Quando o embrião apresenta genes da doença monogênica familiar estudada.
Embrião que, após análise genética para doença monogênica, não apresenta a doença familiar
estudada.
O embrião não tem a informação cromossômica necessária para a análise, o que pode ser
justificado por qualidade embrionária inadequada e/ou degradação do DNA obtido. Ainda durante a
biópsia celular, tais células podem ser perdidas, o que pode contribuir para esse resultado. Quando o
laudo aponta DNA não detectado ou inconclusivo, caso seja tomada a decisão de repetir a análise
com uma rebiópsia, é preciso descongelar o embrião para refazer o procedimento de retirada das
células e posterior recongelamento, para a espera do resultado da nova análise.
O mosaicismo ocorre quando um embrião apresenta células euploides e aneuploides como
resultadode erros na divisão celular (mitose) produzidos durante o desenvolvimento
embrionário.
Embrião afetado 
Embrião não afetado 
DNA não detectado ou inconclusivo 
Indica que uma parte de um cromossomo está ausente ou adquirida. Deleções e duplicações
diagnosticadas em um feto ou em nascidos vivos são geralmente associadas com anomalias físicas
ou cognitivas. O relatório vai mostrar um “- / + p ou q” com a região do cromossomo que é deletada
ou duplicada, respectivamente.
Uma amostra embrionária será classificada como anormal complexa se houver uma combinação de
cinco ou mais achados anormais, incluindo monossomia, trissomia e duplicação/deleção.
Técnicas de biópsia embrionária
Para realizar as técnicas de PGT, é recomendado que a paciente realize técnica de injeção
intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) e não a fertilização in vitro convencional a fim de evitar a
contaminação de células remanescentes do cumulus ou células espermáticas residuais anexadas à zona
pelúcida.
Durante a formação do blastocisto, as células embrionárias se diferenciam nas linhagens de massa celular
interna (MCI) e trofectoderma. Isso ocorre pela formação de uma cavidade (blastocele) preenchida com
fluido, devido à bomba de sódio e potássio.
Esquema representado o estágio de blastocisto.
Para biópsia das células embrionárias, é necessário primeiramente fazer uma abertura da zona pelúcida
(ZP). Para isso, podemos realizar três diferentes procedimentos, são eles: manipulação mecânica,
Deleção/Duplicação Parcial 
Anormal Complexo 
perfuração química com ácido Tyrode ou perfuração a laser. A perfuração a laser é mais fácil, rápida,
precisa e trata-se da metodologia mais utilizada mundialmente.
Existem diferentes tipos de técnicas para a retirada do material embrionário a ser analisado, vamos
conhecê-las?
Biópsia de blastômeros (embrião em estágio de
clivagem)
São removidos 1 ou 2 blastômeros (células) do embrião. Inicialmente, as biópsias embrionárias eram
frequentemente realizadas no estágio de clivagem (embrião com 6 a 8 células). Essa técnica apresenta
certa limitação, pois a quantidade de material genético analisado é pequena (menos representativa da
totalidade do embrião) e é um estágio que, por ser inicial, pode apresentar maiores taxas de mosaicismo – é
sabido que o embrião pode “corrigir" o mosaicismo ao longo do seu desenvolvimento, pela multiplicação de
maior quantidade de células saudáveis que afetadas – podendo ocorrer em até 60% das análises.
Biópsia de blastômero (retirada de célula no estágio de clivagem).
Já no estágio de blastocisto, a incidência de mosaicismo cai drasticamente, pelo número de células
analisadas ser maior e, portanto, uma amostra mais representativa do todo. Logo, a realização da biópsia na
fase de clivagem pode indicar um alto índice de falso positivo para aneuploidia.
A vantagem da biópsia nesse estágio de desenvolvimento (estágio de clivagem) é oferecer tempo suficiente
para o resultado da análise ser liberado em 24 horas, possibilitando a transferência do embrião a fresco
(embriões que são transferidos no mesmo ciclo de indução).
Biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de
blastocisto)
Essa técnica é a mais utilizada atualmente. É realizada uma abertura na ZP, no terceiro, quarto ou quinto dia
de desenvolvimento embrionário. As células são aspiradas e excisadas com auxílio do laser para a quebra
das ligações celulares, ou aspiradas e feita a dissecção mecânica das células biopsiadas.
Excisão
Remoção de parte de um órgão ou tecido com instrumento cortante – nesse procedimento o instrumento
cortante que utilizamos é o laser.
Devido à quantidade de células retiradas (de 6 a 8 células), esse método proporciona uma melhor precisão
diagnóstica. O estágio de blastocisto demonstra ser menos sensível a possíveis danos durante a biópsia,
pois as células que vão originar o feto (provenientes da massa celular interna) são deixadas intactas.
A biopsia de trofectoderma apresenta uma maior acurácia e diminui a incidência de possíveis resultados
errôneos para mosaicismo. No entanto, ela requer o cancelamento da transferência embrionária no mesmo
ciclo, sendo necessária a criopreservação do embrião para transferência em ciclo posterior.
Imagem ilustrativa da biópsia de trofectoderma (retirada de célula no estágio de blastocisto).
Curiosidade
O primeiro humano nascido vivo de uma transferência embrionária em estágio de blastocisto após biópsia
de trofectoderma foi relatado em 2005.
Biópsia de corpúsculo polar
O primeiro corpúsculo polar é expelido nos oócitos maduros, enquanto o segundo corpúsculo polar é
extruído após a fertilização. Eles não têm um papel aparente no desenvolvimento embrionário e não são
parte integrante do embrião, mas ambos contêm material genético materno (o primeiro contém o conjunto
de cromossomos duplicados resultante da primeira divisão meiótica e o segundo contém o conjunto de
cromossomos simples resultante da segunda divisão meiótica).
Morfologia do primeiro corpúsculo polar.
Morfologia do primeiro corpúsculo polar.
A remoção de ambos os corpúsculos polares para fins de PGT é considerada menos invasiva do que as
abordagens que envolvem a biópsia de células em estágios embrionários posteriores. Essa técnica envolve
a remoção de ambos os corpúsculos polares com o intuito de obter uma melhor acurácia no diagnóstico do
oócito. Essa análise pode ser usada para determinar aneuploidias relacionada a meiose materna,
translocações cromossômicas balanceadas derivadas da mãe e para detecção de doenças monogênicas
do genoma materno, permitindo a transferência dos embriões a fresco.
Os corpúsculos podem ser removidos juntos após a fertilização, para detecção de aneuploidias, ou
separadamente para os casos de doenças monogênicas. Devido às informações desta técnica serem
limitadas apenas ao material genético materno, ela não é amplamente utilizada, destinando-se mais para
casos específicos.
Saiba mais
Estudos mostram que a biópsia de corpúsculo polar pode aumentar a taxa de fragmentação embrionária e a
parada do desenvolvimento, sugerindo que mesmo essa manipulação aparentemente pouco invasiva pode
impactar negativamente a viabilidade do embrião.
Biópsia da blastocele
A descoberta de DNA adequado para amplificação e teste genético na blastocele resultou em grande
interesse sobre o potencial para uma nova era de testes genéticos pré-implantação minimamente invasivos.
Para tal procedimento, uma micropipeta de ICSI perfura o trofectoderma no lado oposto da MCI e o fluido é
cuidadosamente aspirado, deixando o embrião totalmente colapsado.
Preparação do Tubing (tubo para armazenar as células para envio ao laboratório de genética).
O colapso dinâmico e a re-expansão da cavidade é um fenômeno frequentemente observado durante o
cultivo de blastocisto in vitro antes da eclosão. Embora a biópsia de blastocele seja um conceito atraente,
esse tipo de procedimento não é comumente utilizado por apresentar dificuldades em obter uma
amplificação consistente do DNA, o que consequentemente restringe a análise genética. A quantidade de
DNA presente na blastocele varia consideravelmente e parece ser indetectável em alguns embriões (ou está
presente em um estado que impossibilita a amplificação) e a principal causa da falha na detecção de DNA
provavelmente deriva de sua natureza degradada.
Técnicas de análise genética - plataformas
de diagnóstico
Inicialmente, a técnica de FISH (Hibridação in situ por fluorescência) foi utilizada para diagnóstico genético
com blastômeros. O teste foi idealizado para detecção dos cromossomos 13, 18 e 21, mas expandiu para
até 12 cromossomos. Para isso, uma ou duas células embrionárias (blastômeros) eram incubadas com
sondas fluorescentes específicas e, em seguida, as alterações cromossômicas numéricas ou estruturais
apenas em 12 cromossomos eram avaliadas. Porém, com o desenvolvimento de técnicas que permitem a
análise de todos os 24 cromossomos (22 autossomos,X e Y), com amplificação do genoma completo em
uma única célula, o CCS (do inglês, comprehensive chromossome screening), a técnica FISH praticamente
caiu em desuso.
Agora vamos conhecer as outras técnicas utilizadas para análise genética pré-implantacional. Você vai
notar que essas técnicas são as mesmas empregadas na biologia molecular, no diagnóstico de doenças
genéticas e em alguns diagnósticos laboratoriais:
Hibridização genômica comparativa (CGH)
Essa foi a primeira técnica de CCS a ser disponibilizada em larga escala e envolve o isolamento e a
marcação fluorescente de DNA obtido de biópsia de blastômero, comparando com o DNA do cariótipo de
um indivíduo normal.
O CGH convencional foi substituído pelo CGH-array (a-CGH), que envolve a hibridização do DNA a um
microarranjo com cerca de 3 mil a 4 mil fragmentos do DNA humano. A limitação dessa técnica para PGT
se dá pela pequena quantidade de DNA. Isso pode contribuir para uma taxa de erro de 2% a 5%. Essa
metodologia tem sido aplicada desde 2010, e tem sensibilidade para detectar perda ou ganho em todos
os cromossomos em um único procedimento.
Polimor�smo de nucleotídeo único (SNP)
O microarranjo de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP microarrays) detecta pares de nucleotídeos
únicos do DNA genômico que são altamente variáveis dentro de uma espécie. O microarranjo geralmente
avalia aproximadamente 300 mil SNPs ao longo do genoma de referência, sendo possível identificar
aneuploidias de número de cromossomos.
Algumas limitações do SNP incluem a não detecção das anomalias estruturais abaixo de 5Mb e de
rearranjos cromossômicos balanceados. De forma geral, a técnica de SNP para PGT é considerada
demorada, de alto custo e complexa.
Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR)
A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) foi desenvolvida como um método para identificar
aneupolidias nos 24 cromossomos. Neste método, ocorre uma etapa de pré-amplificação do DNA seguida
de PCR multiplex na amostra. A vantagem do qPCR é o curto tempo para análise (cerca de 4 horas). A
taxa de erro para esta técnica é de 0,21% por embrião euploide. A técnica é realizada no trofectoderma,
mas não pode ser realizada com blastômero, além de só permitir a leitura simultânea de um reduzido
número de amostras. Também não é capaz de detectar aneuploidias segmentais. Por outro lado, a
técnica de PCR é amplamente utilizada para o diagnóstico de doença monogênica (PGT-M).
Sequenciamento de nova geração (NGS)
O sequenciamento de nova geração (NGS) para PGT ultimamente é a técnica mais utilizada no mundo
para o diagnóstico de aneuploidias (PGT-A). Ela inclui amplificação completa do DNA genômico, seguida
de preparação de uma base de dados comparativa padrão com marcação e fragmentação do DNA antes
do PCR.
O NGS permite a identificação de aneuploidias de cromossomos inteiros, mosaicismo, número de cópias
de mitocôndrias; pode ser utilizada para rastreamento de desordem de um único gene e para
translocações. A taxa de erro da técnica varia entre 0,8% a 1,71%. A sensibilidade e a especificidade do
NGS para detecção de aneuploidias cromossômicas são de 100% e 99,98%, respectivamente.
Aneuploidias segmentais
As aneuploidias segmentais (parciais) afetam apenas uma parte do cromossomo. Do ponto de vista
biológico, essas alterações são geradas principalmente por erros na divisão celular meiótica, que ocorrem
durante a gametogênese, bem como erros mitóticos que acontecem durante desenvolvimento embrionário.
Ilustração de um cariótipo apresentando translocação balanceada.
Comparado com o a-CGH, o NGS tem a vantagem de ser realizado com menores custos e o
sequenciamento de várias amostras simultaneamente.
Dentre as limitações da técnica encontram-se a impossibilidade de detecção de translocações balanceadas
e a dificuldade de interpretação de aneuploidias segmentadas secundárias.
Visão geral
As técnicas de avaliação do perfil genético dos embriões humanos obtidos via tratamentos de Reprodução
Humana Assistida estão em constante e rápida evolução, com acurácia cada vez maior, o que, associado à
alta proficiência do embriologista responsável pela biópsia, vitrificação e desvitrificação desses embriões,
resulta em taxas crescentes de gestação associadas a menores taxas de abortamento.
No entanto, devemos sempre levar em consideração que mesmo a melhora nas técnicas ainda não é
suficiente para “compensar” a deficiência na amostra fornecida para análise. Nesse contexto, vamos
analisar três fatores sobre a biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de blastocisto), são eles:
Vitri�cação
Congelamento ultrarrápido no qual o material fica em estado vítreo.
Desvitri�cação
Descongelamento do material biológico que está em estado vítreo, restabelecendo o desenvolvimento
celular.
Biópsia de blastocisto X Biópsia de única célula
P i bió i d bl t i t f últi l él l ã à bió i d
Por esse conjunto de fatores, é fundamental e obrigatório um correto aconselhamento genético realizado
por um geneticista, bem como um perfeito esclarecimento dos prós e contras da técnica, esclarecendo para
o paciente as limitações que a envolvem. Considerando todos os pontos listados acima, a genética da
reprodução, quando corretamente indicada e realizada, permite resultados fantásticos, evitando doenças e
aumentando o sucesso dos tratamentos.
Atenção!
O diagnóstico genético para seleção de sexo é proibido no Brasil, mas pode ser indicado para casais que
apresentem alguma doença ligada aos cromossomos sexuais X ou Y, como, por exemplo, o X-frágil (doença
que gera uma deficiência mental e, embora aconteça em ambos os sexos, é mais grave nos homens).
Por mais que a biópsia de blastocisto forneça múltiplas células em comparação à biópsia de
uma única célula (que ocorria no estágio de clivagem), essa amostra não é “homogênea” e,
portanto, o conceito base das análises clínicas de que “a parte representa o todo” não é
perfeitamente aplicável aqui.
Células removidas para biópsia
Na biópsia de blastocisto, as células removidas pertencem a uma pequena parte do
trofectoderma que, por sua vez, é um agrupamento celular já diferenciado dentro do embrião
e pode não obrigatoriamente representar o embrião como um todo e as células da massa
celular interna, responsável pela formação do embrião propriamente dito. Prova disso são os
conhecidos casos de mosaicismo.
Capacidade de autocorreção
Soma-se a isso o pouco conhecimento que ainda temos sobre a real capacidade de
autocorreção que esses embriões possam ter para corrigir essas aneuploidias observadas
nesse estágio de desenvolvimento, e ainda o impacto negativo que a biópsia pode causar em
blastocistos de prognóstico ruim.
Passo a passo do tratamento de fertilização in vitro com biópsia embrionária.
Epigenética
Neste vídeo, a especialista Vanessa Amil define o que é epigenética e correlaciona epigenética e reprodução
humana assistida.
Vem que eu te explico!
Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.
Módulo 1 - Vem que eu te explico!
Introdução ao diagnóstico genético pré-implantacional
Módulo 1 - Vem que eu te explico!
Diferentes tipos de testes genéticos pré-implantacionais
Módulo 1 - Vem que eu te explico!


Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Técnicas de biópsia embrionária
Questão 1
O diagnóstico genético pré-implantacional (PGT) é uma técnica complementar na Reprodução Assistida. Ele
permite o estudo de alterações genéticas e cromossômicas no embrião antes de sua implantação no útero.
Inicialmente, esse teste foi desenvolvido para detectar que tipo de alteração genética?
A Para detecção de mutações gênicas.
B Para detecção de desordens numéricas.
C Para detecção de mutações poligênicas.
D Para detecção de rearranjos estruturais desbalanceados.
E Para seleção de um embrião com HLA compatível ao de uma criança afetada.
Parabéns! A alternativa A está correta.
Incialmente,a técnica de PGT foi implementada para avaliar as mutações gênicas que eram
transmitidas hereditariamente. O primeiro relato de sucesso com o PGT foi para a detecção de
uma doença de herança recessiva ligada ao cromossomo X, a adrenoleucodistrofia.
Questão 2
Para a realização da análise genética pré-implantacional existem diferentes tipos de materiais que podem
ser analisados. Qual o material que apresenta maior acurácia dos resultados e diminui a incidência de
possíveis resultados errôneos para mosaicismo?
A Blastômero.
B Trofectoderma.
C Corpúsculo polar.
D Blastocele.
2 - Criopreservação
Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas de
preservação da fertilidade.
Criopreservação de oócitos e embriões
A partir do primeiro relato de nascimento após fertilização in vitro (FIV) em 1978 e do rápido progresso nas
E Células da granulosa.
Parabéns! A alternativa B está correta.
A biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de blastocisto) atualmente é a técnica mais
utilizada. Nessa técnica, são retiradas de 6 a 8 células do embrião e enviadas para análise,
proporcionando melhor precisão diagnóstica.

técnicas de reprodução assistida, surgiu a necessidade de um programa de criopreservação eficaz.
Inicialmente, devido às baixas taxas de sucesso, todos os embriões provenientes de ciclos de FIV eram
transferidos. Entretanto, o enorme avanço nas técnicas laboratoriais levou não apenas ao aumento das
taxas de gestação, mas também ao aumento de gestação múltipla. Uma maneira de diminuir o número de
embriões a serem transferidos e a incidência de gestações múltiplas seria armazenar os embriões
excedentes para um potencial uso futuro, por meio da criopreservação.
Falando em criopreservação, você sabe o que é isso?
A criopreservação envolve o armazenamento de células e tecidos por longos períodos em temperatura
muito baixa (-196°C).
Criopreservação.
Antigamente, transferências de embriões criopreservados apresentavam menor taxa de gestação quando
comparadas à transferência de embriões a fresco. Porém, com a introdução da técnica de vitrificação em
1999, houve completa revolução no campo da criopreservação, resultando em melhores taxas de
sobrevivência à criopreservação e resultados clínicos.
Além disso, a criopreservação de embriões tornou-se essencial para a melhoria da segurança e eficácia dos
tratamentos de reprodução assistida, e atualmente é um processo bem estabelecido.
Saiba mais
Em 1984 foi relatado o primeiro nascimento de uma criança proveniente de embrião descongelado.
Apenas mais recentemente, com a introdução da criopreservação de oócitos, a técnica tornou-se disponível
como uma opção adicional de preservação de fertilidade em mulheres, visto que não necessita do material
genético masculino, reservando à mulher a capacidade de procriar com um parceiro escolhido no futuro.
Curiosidade
A primeira publicação relatando o nascimento de uma criança oriunda de oócitos criopreservados ocorreu
em 1986, pelo protocolo de congelamento lento.
Duas técnicas básicas são aplicadas à criopreservação: o congelamento lento controlado, muito utilizado
nos primórdios da reprodução assistida, e o resfriamento ultrarrápido por vitrificação, que atualmente é a
técnica mais utilizada e muito bem estabelecida.
Vamos conhecer um pouco mais sobre essas técnicas. Mas antes vamos entender como ocorre a
criopreservação.
Princípios �siológicos da criopreservação
Os princípios fisiológicos da criopreservação e suas restrições são de grande importância para
compreender o sucesso (ou insucesso) da técnica. A principal causa de morte celular no processo da
criopreservação é a criolesão (lesão pelo frio).
Mas o que é criolesão?
Sua ocorrência é explicada por diversas teorias, como formação de cristais de gelo
intracelular, volume celular mínimo e transição de fases da membrana, danos à
membrana celular e alterações no funcionamento do metabolismo, tanto celular
quanto mitocondrial.
O que é feito para evitar a criolesão? Vamos entender?
Princípio da criopreservação
Consiste em solidificar a solução por meio de um aumento extremo de sua viscosidade em
temperatura extremamente baixa (-196°C, temperatura do nitrogênio líquido). Com intuito de
preservação celular durante essa exposição a temperaturas não fisiológicas, é necessário a
adição dos chamados crioprotetores.
Crioprotetores não permeáveis à membrana plasmática
Atuam por meio de um efeito osmótico, induzindo a desidratação celular durante o resfriamento e
regulando sua hidratação no aquecimento, prevenindo a formação dos cristais de gelo.
Crioprotetores permeáveis à membrana
Atuam de forma dupla: atingem o meio intracelular, por difusão passiva, com a função de substituir a
água intracelular e reduzir o seu ponto de congelamento. Além disso, por permanecerem em altas
concentrações no meio extracelular, auxiliam a desidratação celular, evitando a formação dos cristais de
gelo.
Os meios utilizados para a criopreservação contêm os dois tipos de crioprotetores,
uma vez que essa combinação permite preservar o equilíbrio osmótico entre os
meios intra e extracelular.
Técnica de criopreservação de embrião e oócitos
Para o sucesso da técnica, as condições devem ser otimizadas para minimizar a incidência de lesões e
manter alta a taxa de sobrevivência. Existem duas técnicas que podem ser aplicadas à criopreservação:
Congelamento Lento
Como o próprio nome diz, o congelamento lento é uma técnica mais demorada, e tem a necessidade de
utilizar equipamentos especiais e caros. Essa técnica consiste na adição de crioprotetores ao material e seu
Crioprotetores
O objetivo da adição de crioprotetor é causar efluxo da água celular que, ao ser resfriada,
pode formar os cristais de gelo, lesionando a célula. Crioprotetores são substâncias que
atuarão no espaço intracelular ou extracelular dependendo do seu tipo: permeáveis à
membrana plasmática (etilenoglicol, glicerol, dimetilsulfóxido, propanediol, acetamida) ou não
permeáveis à membrana plasmática (sacarose, trealose).
posterior resfriamento em rampas de temperaturas lentas, ou seja, na diminuição gradual e constante da
temperatura.
Em 1971 foi registrada sua primeira utilização com sucesso, quando o congelamento ainda ocorreu de
forma rudimentar e com rampas de temperatura pouco controladas. Com esse registro e aumento do
alcance do procedimento, vários equipamentos para controlar a rampa (variação) de temperatura de
resfriamento surgiram no mercado.
Cryobath fechado (foto superior) e aberto (foto inferior).
Em um protocolo de congelamento lento clássico, estabelecido e utilizado desde meados dos anos 1980, as
células são expostas a baixas concentrações de crioprotetores, e a temperatura é gradativamente diminuída
de 0,3°C a 0,5°C por minuto, até alcançar a temperatura entre -30°C e -65°C, e então é adicionado o
nitrogênio líquido (-196°C), no qual ocorrerá o armazenamento. Durante esse processo, um delicado
equilíbrio é mantido pela indução de cristais de gelo extracelulares. Ainda que algumas alterações nos
protocolos de congelamento lento tenham contribuído para maiores taxas de sucesso, a eficiência clínica
desta técnica ainda é questionável.
Acima, verificamos uma foto de um modelo de equipamento utilizado para o congelamento lento (embriões
e oócitos). Na imagem, vemos que o equipamento está conectado a um aparelho que controla a rampa de
resfriamento.
Vitri�cação
Tem como foco evitar a formação de cristais de gelo, tanto nas soluções extra quanto nas intracelulares. Os
embriões e os oócitos são expostos a taxas extremamente rápidas de resfriamento, antes da submersão
em nitrogênio líquido e em soluções com altas concentrações de crioprotetores em volumes muito baixos
(<1µL), criando o que é conhecido como estado vítreo.
Atualmente, a técnica de escolha para o congelamento de oócitos e embriões é a
vitrificação, devido à menor chance de ocorrer dano celular, sendo importante
ressaltar que o uso dos crioprotetoresrepresentou um grande avanço na criogenia.
A vitrificação tem somado qualidade ao tratamento de reprodução assistida, com
melhores taxas de sobrevivência e desenvolvimento embrionário pós
descongelamento, o que permite a programação da transferência embrionária para
um momento mais adequado, social e fisiologicamente.
Existem diferentes tipos de meios de cultura comercializados, no entanto, todos são muito similiares, visto
que contêm duas soluções base utilizadas em duas etapas distintas: equilibration solution (ES) e vitrification
solution (VS).
O oócito ou embrião é colocado no meio ES, no qual, inicialmente, tem a saída de água, sendo, depois,
reidratado com a entrada dos meios crioprotetores.
Após essa fase, o oócito ou embrião é submerso no meio VS com posterior inserção na palheta de
vitrificação, onde sofrerá mais desidratação para posterior imersão no nitrogênio líquido.
Placa, soluções e palhetas utilizados durante a técnica de vitrificação.
Existem dois sistemas de vitrificação: aberto e fechado.
No sistema aberto, a amostra entra em contato direto com o nitrogênio líquido no momento da imersão. No
sistema fechado, a amostra é contida em um invólucro selado (uma capa de plástico semelhante a um
canudo, com as extremidades fechadas) que impede o contato direto com o nitrogênio líquido.
Palheta com sistema aberto.
Sistema fechado. O “canudo” amarelo (invólucro) com amostra.
Estudos mostram que o sistema aberto consegue fazer a rampa de resfriamento mais rapidamente que o
sistema fechado, no qual há primeiro o resfriamento do invólucro para posterior resfriamento da amostra.
Isso torna o sistema aberto mais seguro no que se refere à formação dos cristais de gelo.
Palheta aberta submersa no nitrogênio líquido.
Saiba mais
Para o congelamento de oócitos e embriões a concentração do agente crioprotetor utilizada deve seguir a
indicada pelo fornecedor.
Além disso, estudos mostram que a vitrificação tem melhor taxa de sobrevida, fazendo com que,
atualmente, poucas clínicas no mundo utilizem o congelamento lento. No Brasil, somente uma clínica ainda
utiliza essa metodologia.
Descongelamento de oócitos e embriões
O descongelamento ou aquecimento é o processo inverso da criopreservação. Nesse caso, retiramos os
crioprotetores em três etapas: thawing solution (TS) - solução de descongelamento -, diluent solution (DS) -
diluente - e washing solution (WS) - solução de lavagem - para a reidratação do embrião.
Placa de descongelamento. Palheta submersa na primeira etapa do descongelamento (TS).
Após a finalização desse processo, o embrião e o oócito ainda necessitam de tempo para a completa
reidratação até retomar o tamanho normal.
Blastocisto após descongelamento.
Blastocisto 3 horas após descongelamento.
Criopreservação de embrião e oócitos
Neste vídeo, a especialista Vanessa Amil mostra as técnicas de congelamento e descongelamento de
oócitos e embriões e pontua as suas principais diferenças.

Indicações da criopreservação de embriões
Em algumas situações clínicas, a paciente poderá ter indicação de congelamento total dos embriões
produzidos naquele ciclo de FIV, seja devido a alguma doença, alteração ou risco clínico, seja por não
desejar a transferência a fresco naquele momento.
As indicações que justificam o congelamento embrionário são: baixa reserva ovariana, teste genético pré-
implantacional, cavidade uterina inadequada, progesterona elevada, risco de síndrome do hiperestímulo
ovariano e embriões excedentes.
Agora, vamos conhecer melhor cada uma dessas indicações.
Baixa reserva ovariana
Esse diagnóstico advém dos testes de reserva ovariana basal realizados (dosagem de FSH,
LH, estradiol, progesterona e AMH – hormônio antimülleriano). A opção para esse casal é a
realização da FIV (fertilização in vitro) e o congelamento dos embriões para que possa ter um
número maior de embriões (acúmulo de embriões), permitindo que, no futuro, tenham
embriões que possibilitem o aumento da prole.
Teste genético pré-implantacional
Após o cultivo dos embriões, os blastocistos biopsiados podem ser transferidos no mesmo
dia, caso o estudo genético seja feito imediatamente (esse procedimento só é possível se a
clínica estiver localizada na mesma cidade do laboratório de análise genética). Na maioria
dos centros, pela indisponibilidade desse imediatismo, é necessário o congelamento destes
embriões para que haja tempo do resultado ser disponibilizado. Nesses casos, o blastocisto
euploide será transferido em outro ciclo.
Cavidade uterina inadequada
O l t b i á i d i di d l d id d
O congelamento embrionário pode ser indicado em alguns casos, devido a doenças que
diminuem as chances de implantação. Doenças como adenomiose, miomatose e
endometriose podem tornar inadequada a cavidade uterina e assim reduzir o sucesso do
tratamento.
Progesterona elevada
Durante a FIV, o estímulo hormonal responsável pelo recrutamento folicular pode alterar o
endométrio, fator importante para o processo do tratamento. Caso ocorra aumento da
progesterona plasmática acima de 1.500pg/mL no dia do gatilho com o HCG (gonadotrofina
coriônica humana), o ideal é o congelamento embrionário total, visto que essa situação está
associada à baixa taxa de gravidez.
Risco de síndrome do hiperestímulo ovariano
A Síndrome da Hiperestimulação Ovariana (SHO) é uma complicação decorrente do estímulo
ovariano com indutores de ovulação, podendo levar a quadros graves. Geralmente ocorre
devido a uma resposta exacerbada dos ovários ao estímulo hormonal e resulta em um
número grande de oócitos. Assim, quando ocorrer esta síndrome, a criopreservação de
embriões é indicada por ser uma tática importante para minimizar o risco de
hiperestimulação em pacientes suscetíveis, visto que a transferência a fresco desencadeia
um novo pico de HCG.
Embriões excedentes
Segundo a resolução do Conselho Federal de Medicina (CFM) n° 2.294, de 27 de maio de
2021, não é permitido o descarte de embriões viáveis e a quantidade de embriões a serem
transferidos é limitada (< 37 anos até 2 embriões,> 37 anos até 3 embriões). Sendo assim,
após a transferência dos embriões, os excedentes viáveis devem ser criopreservados.
Indicações da criopreservação de oócitos
A indicação da criopreservação de oócitos são as seguintes:
Baixa reserva ovariana
Nesses casos, podem ser realizados vários ciclos com criopreservação de oócitos, e quando for
alcançado o número desejado de oócitos, realiza-se o descongelamento e prossegue-se com a FIV.
Preservação social
Consiste naqueles casos em que as pacientes desejam adiar a gravidez devido a diversas razões
pessoais.
Pacientes oncológicas
Visto que uma das grandes complicações do tratamento para o câncer é a esterilidade ou perda da
função gonadal, faz-se necessária a criopreservação dos gametas femininos para preservação da
fertilidade.
Doação de oócitos
Os gametas são criopreservados nesses casos quando não há sincronização entre o ciclo da doadora e o
preparo endometrial da receptora.
Criopreservação de sêmen e
espermatozoides obtidos por biópsia
O congelamento de espermatozoides humanos começou a ser introduzido na prática clínica e laboratorial a
partir de 1960, e desde então é considerado uma parte fundamental dentro das técnicas de reprodução
humana assistida (TRA).
Apesar de não ser possível recuperar a motilidade de todos os espermatozoides
que eram inicialmente móveis, a técnica passou a ganhar importância
especialmente em casos de pacientes ainda sem filhos que seriam submetidos a
tratamento de quimioterapia ou radioterapia, que os deixariam inférteis, subférteis
ou com prognóstico desconhecido.
Para que a amostra de sêmen fosse criopreservada de maneira segura, foram desenvolvidos
industrialmente inúmeros crioprotetores para serem adicionados aos espermatozoides.
O mecanismo de ação deles deve garantir a proteção das estruturas intracelulares. Como já sabemos, a
função dos crioprotetores é retirar água dos gametas, evitandoa formação de cristais de gelo. Quanto mais
permeável a membrana plasmática do gameta, melhor será a resposta do espermatozoide ao processo de
criopreservação.
Aspectos laboratoriais da criopreservação de
espermatozoides
O sucesso da criopreservação dos espermatozoides é afetado pela taxa de resfriamento durante o
congelamento. No congelamento rápido, a água presente no meio intracelular congela, causando danos às
organelas pela formação de cristais de gelo. Se a taxa de congelamento for baixa, as células serão
danificadas em razão da formação lenta de gelo no meio extracelular, aumentando a concentração de
solutos extracelulares e, por causa dessa diferença de osmolaridade, a água sai das células, resultando em
desidratação.
Atenção!
Para evitar uma lesão ao espermatozoide, é realizado o rígido controle das taxas de congelamento e são
adicionados à amostra de sêmen os crioprotetores e diluentes.
O crioprotetor mais utilizado é o glicerol, que foi descoberto em 1949. As concentrações de glicerol no
volume final mais adequadas para a proteção durante o congelamento são de 6% e 7%. Quando combinados
aos diluentes, a sobrevivência espermática é maior do que com uso exclusivo do glicerol. Atualmente, os
diluentes que contêm gema de ovo, tampões, citrato e sacarose são os mais indicados.
Técnica para criopreservação de espermatozoides
obtidos por biópsia e sêmen
A adição e a remoção do crioprotetor em concentração proporcional provoca estresse momentâneo na
membrana plasmática dos espermatozoides.
Vamos entender melhor:
Adição do crioprotetor
Quando a adição do crioprotetor é feita na mesma concentração de uma só vez, o estresse na membrana
plasmática dos espermatozoides é muito alto.
Redução do dano
Esse dano pode ser diminuído e a sobrevivência dos espermatozoides aumentada se a adição do
crioprotetor for de forma lenta (em gotas), em velocidade de cerca de 1mL por minuto.
Após a adição total do crioprotetor, o material é armazenado em recipiente criogênico (criotubo) e
submetido ao vapor de nitrogênio e em seguida submerso em nitrogênio líquido (-196°C).
Recipientes criogênicos (Criotubos) que armazenam o sêmen na criopreservação.
Saiba mais
Antes do congelamento, avaliamos os parâmetros seminais (concentração, motilidade e vitalidade). A baixa
qualidade seminal pode ser devido a varicocele, fator hormonal, genético, traumas etc. Quando o paciente
apresenta uma amostra com alteração significativa, mas é possível selecionar espermatozoide para realizar
a FIV, conversamos com ele e explicamos qual seria a recuperação da amostra e orientamos quantas
amostras ele precisará criopreservar para um tratamento.
Os parâmetros seminais devem ser avaliados antes do congelamento. Essa análise é realizada no laboratório de andrologia.
Para o descongelamento, a maneira mais comum é retirar o material congelado do nitrogênio líquido e
deixá-lo à temperatura ambiente até sua total liquefação. Após o descongelamento, é feito o processo de
capacitação espermática, que consiste em separar os melhores espermatozoides do líquido seminal, pelas
técnicas laboratoriais que eliminam da amostra os espermatozoides imóveis, os detritos celulares, os
leucócitos e as células imaturas.
Recomendação
Os espermatozoides obtidos a partir de biópsia de testículo devem ser criopreservados da mesma maneira
que aqueles provenientes do sêmen.
Apesar dos inúmeros avanços na área da criopreservação, ainda há muitos vieses da técnica a serem
aprimorados. Durante essa avaliação, é fundamental avaliar alguns indicadores após o descongelamento da
amostra, como a qualidade seminal. Vamos entender o porquê?
Qualidade seminal
A diminuição da qualidade do sêmen, principalmente da sua motilidade, e o aumento da
fragmentação de DNA são fatores esperados após o descongelamento da amostra e, por
essa razão, são também exemplos de indicadores de que a técnica precisa ser refinada. Além
disso, as taxas de recuperação em geral dependem da qualidade da amostra antes da
criopreservação. Amostras de sêmen de baixa qualidade são mais propensas a sofrer danos
ao DNA e apoptose do que aquelas de boa qualidade.
Motilidade dos espermatozoides
A motilidade dos espermatozoides é o aspecto mais afetado pelo processo de
criopreservação, pois lesiona algumas estruturas celulares dos gametas. As mitocôndrias são
as estruturas celulares que envolvem a peça intermediária dos espermatozoides, agindo
como fornecedoras de energia para a cauda e promovendo o movimento flagelar
característico dos espermatozoides. Aparentemente o que provoca a diminuição da atividade
mitocondrial nos espermatozoides após seu descongelamento é o aumento dos níveis de
apoptose celular.
Indicações da criopreservação do sêmen e dos
espermatozoides obtidos por biópsia
A criopreservação de sêmen deve ser considerada como procedimento preventivo diante das seguintes
situações: antes de quimioterapia e radioterapia; antes de cirurgia de testículo ou próstata; em caso de
dificuldade de coleta ou ausência do companheiro no dia do tratamento de reprodução assistida; em
indivíduos que vão realizar cirurgia de vasectomia e desejam preservar a fertilidade futura; em indivíduos
que trabalham em profissões de alto risco para fertilidade (indústrias químicas, exposição aos agrotóxicos e
pesticidas e exposição a radiações ionizantes); em amostras obtidas por técnicas cirúrgicas, do epidídimo
e/ou testículo.
Dentre as técnicas de recuperação cirúrgicas estão:
PESA (do inglês, Aspiração Percutânea de Espermatozoides do Epidídimo);
MESA (do inglês, Aspiração Microcirúrgica de Espermatozoides do Epidídimo);
TESA (do inglês, Aspiração de Espermatozoides do Testículo);
TESE (do inglês, Extração de Espermatozoides do Testículo);
Micro-TESE (do inglês, Extração de Espermatozoides do Testículo por Microdissecção).
Diminuição da atividade mitocondrial
As mitocôndrias são as estruturas celulares que envolvem a peça intermediária dos
espermatozoides, agindo como fornecedoras de energia para a cauda e promovendo o
movimento flagelar característico dos espermatozoides. Aparentemente o que provoca a
diminuição da atividade mitocondrial nos espermatozoides após seu descongelamento é o
aumento dos níveis de apoptose celular.
Taxas de recuperação
As taxas de recuperação em geral dependem da qualidade da amostra seminal antes da
criopreservação. Amostras de sêmen de baixa qualidade são mais propensas a sofrer danos
ao DNA e apoptose do que aquelas de boa qualidade.
Congelamento de tecido ovariano e ovário
A criopreservação de tecido ovariano é atualmente o método de escolha para preservar a fertilidade de
pacientes jovens com diagnóstico de câncer. O primeiro país a relatar o nascimento de uma criança após a
criopreservação de tecido ovariano com autotransplante ortotópico (implante do fragmento de tecido
ovariano retirado do próprio ovário da paciente) foi a Bélgica, em 2004.
A técnica aplicada foi baseada em experimentos que demonstraram, pela primeira
vez, a possibilidade de êxito em transplantes ortotópicos (transplantar o órgão na
posição anatômica original). Nos anos seguintes, com o aprimoramento das
técnicas, outros nascimentos esporádicos provenientes tanto de gestação
espontânea quanto de fertilização in vitro, foram reportados.
Exemplo
Em 2009, um grupo espanhol reportou o nascimento de gêmeos após tratamento quimioterápico e
criopreservação de tecido ovariano, seguido de transplante, estimulação ovariana induzida e vitrificação dos
oócitos.
As dificuldades de se criopreservar o ovário e o tecido ovariano humano se devem à hipóxia dos tecidos, à
não revascularização, à permeabilidade ineficaz do crioprotetor e à complexidade da foliculogênese, além
do risco de se transplantar células malignas, principalmente na vigência de neoplasias.
Técnica de criopreservação de tecido ovariano e ovário
A partir de um procedimento cirúrgico, realizado por videolaparoscopia (com visualização utilizando
câmeras de vídeo especializadas),é retirada uma parte ou todo o ovário, de acordo com a indicação. O
tecido ovariano é cortado em fatias finas da região cortical, onde estão presentes os folículos primordiais, e
incubado por 5 minutos em meio de cultura suplementado e tamponado, antes da criopreservação.
A desidratação acontece em duas fases:
Primeira fase
Na primeira, o tecido é imerso no meio de cultivo, ao qual são adicionados dimetilsulfóxido (DMSO) e
sacarose em concentrações de 2,0mol/L e 0,1mol/L, respectivamente, por 5 minutos.
Segunda fase
Na segunda fase, o tecido é adicionado ao meio suplementado com DMSO (dimetilsulfóxido), PROH (1,2-
propanodiol) e sacarose, em concentrações de 2,0mol/L, 2,0mol/L e 0,2mol/L, respectivamente, também por
5 minutos.
Imediatamente após a segunda fase, as tiras desidratadas devem ser aspiradas com pipeta Pasteur e
vagarosamente liberadas diretamente no nitrogênio líquido. Após estarem congelados, os fragmentos de
tecido ovariano podem permanecer armazenados por tempo indeterminado.
Por exemplo, após o tratamento de quimioterapia ou radioterapia, há uma chance considerável de a mulher
entrar na menopausa precocemente. Caso isso aconteça, os fragmentos do ovário criopreservados poderão
ser descongelados e reimplantados no organismo da paciente de forma a proporcionar a chance de uma
gravidez futura. A seguir vemos um esquema mostrando o passo a passo da técnica do congelamento de
tecido e ovário.
Passo a passo da técnica do congelamento de tecido e ovário.
Descongelamento do tecido ovariano e ovário
O processo de descongelamento consiste em expor o recipiente ou a palheta em que o tecido está
armazenado, a uma temperatura de 37°C por um minuto, e submergir o material em um gradiente
decrescente de sacarose, cuja função é regular a troca de crioprotetor por meio de cultura essencial.
Atenção!
Após o descongelamento do tecido ovariano, ele deve ser reimplantado no sítio ortotópico ou heterotópico
(transplantar o órgão em outra posição anatômica diferente da orignal), dependendo da técnica e do
objetivo do reimplante.
Indicação para a criopreservação de tecido ovariano e
ovário
Pacientes que, após o diagnóstico do câncer, não têm tempo suficiente para congelamento de
oócitos/embriões ou contraindicação para receberem estimulação ovariana com hormônios são candidatas
à técnica. Além disso, essa é a única opção para preservação de fertilidade em meninas antes da
puberdade.
Vem que eu te explico!
Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.
Módulo 2 - Vem que eu te explico!
Princípios �siológicos da criopreservação
Módulo 2 - Vem que eu te explico!
Indicação de criopreservação de oócitos e embriões
Módulo 2 - Vem que eu te explico!
Criopreservação de sêmen e espermatozoides obtidos por biópsia

Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Vimos alguns métodos de criopreservação de embriões e oócitos. Sobre esses métodos, analise as
afirmativas a seguir.
I. A vitrificação consiste na adição de crioprotetores ao material e seu posterior resfriamento em rampas de
temperaturas lentas.
II. A eficiência da técnica de criopreservação pelo método lento ainda é questionável.
III. No congelamento lento, os embriões e os oócitos são expostos a taxas extremamente rápidas de
resfriamento, antes da submersão em nitrogênio líquido.
IV. Existem dois tipos de palhetas de vitrificação (sistema aberto e sistema fechado).
É correto o que se afirma em:
A I e II.
B I e III.
C I e IV.
D II e III.
E II e IV.
Parabéns! A alternativa E está correta.
O congelamento lento é uma técnica que tem eficiência questionável, pois consiste na adição de
crioprotetores ao material e seu posterior resfriamento em rampas de temperaturas lentas. A
vitrificação é uma técnica de criopreservação ultrarrápida. Os oócitos e os embriões são
armazenados em palhetas que podem ser abertas ou fechadas, e expostos a taxas extremamente
rápidas de resfriamento, antes da submersão em nitrogênio líquido.
Questão 2
Aprendemos que a criopreservação de sêmen e espermatozoides obtidos por biópsia é realizada por uma
técnica diferente da empregada para a criopreservação de oócitos e dos embriões. Sobre a criopreservação
dos espermatozoides obtidos pelo sêmen ou por biópsia, analise as afirmativas a seguir e assinale a
alternativa correta:
A
O congelamento dos espermatozoides e do sêmen não é afetado pela taxa de
resfriamento.
B O crioprotetor mais empregado durante o congelamento do sêmen é o dimetilsulfóxido.
C
A criopreservação de espermatozoides provenientes da biópsia testicular é igual à
criopreservação do sêmen.
D Na criopreservação dos espermatozoides, não são empregados os diluentes, pois eles
Considerações �nais
Ao longo deste conteúdo, estudamos algumas técnicas complementares realizadas durante a reprodução
assistida auxiliando na identificação de causas de infertilidade e aumentando o sucesso dos tratamentos.
Vimos que o PGT é um teste realizado a partir da análise de células embrionárias, retiradas do embrião por
biópsia e posteriormente analisadas em laboratório especializado, de acordo com a doença a ser
identificada. Esse procedimento é indicado para casais que tenham alto risco de transmissão de doenças
genéticas para seus filhos. Este teste é dividido em, PGT-A, PGT-M PGT-HLA, PGT-SR, PGT-P e NICS e pode
ser realizado em embriões no estágio de clivagem ou de blastocisto. Entretanto, estudos mostram que,
quando realizada no estágio de blastocisto, a técnica demonstra ser menos prejudicial ao embrião, pois as
células que vão originar o feto (provenientes da massa celular interna) são deixadas intactas.
Aprendemos também que a criopreservação de gametas e embriões é uma técnica complementar que visa
preservar a fertilidade tanto masculina quanto feminina. Essa técnica consiste na conservação de gametas
ou embriões em baixas temperaturas para que sejam utilizados em tratamentos futuros de reprodução
assistida (transferência embrionária ou fertilização in vitro).
diminuem a sobrevivência espermática.
E
Após a criopreservação, o descongelamento deve ser realizado em uma rampa de
temperatura, com declínio lento da temperatura.
Parabéns! A alternativa C está correta.
Os espermatozoides devem ser criopreservados pela mesma técnica, independentemente se
foram obtidos pelo sêmen ou por biópsia testicular. O sucesso da criopreservação dos
espermatozoides é afetado pela taxa de resfriamento durante o congelamento. O crioprotetor
mais utilizado é o glicerol e, para aumentar a sobrevivência espermática, devemos utilizar
diluentes. O descongelamento dos espermatozoides após a criopreservação deve ser realizado a
temperatura ambiente.
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Podcast
Neste podcast, a especialista Vanessa Nayane Pino Perez falará sobre como entrou para a reprodução
assistida, a rotina, os procedimentos e os cuidados que devem ser tomados em diferentes procedimentos e
muito mais. Vamos lá?
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Referências
ALMODIN, C. G.; COSTA, R. R. Criopreservação em Reprodução. Dental Press, 2014.
AZAMBUJA, R. et al. Reprodução assistida: Técnicas de Laboratório. Porto Alegre: Age, 2017.
BORGES, E.; CORTEZZI, S. S.; FARAH, S. Reprodução humana assistida. Rio de Janeiro: Atheneu, 2011.
BORGES JUNIOR, E.; BRAGA, D. P. A. F.; SETTI, A. S. Reprodução humana assistida: Associação estudo
Sapientiae. 2. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2020.
DZIK, A. et al. Tratado de reprodução assistida. Segmento Farma, 2011.
MARINHO, R. M. Preservação da fertilidade: uma nova fronteira em medicina reprodutiva e oncologia. 1. ed.
Rio de Janeiro: MedBook, 2015.
TREFF, N. R. et al. Preimplantation genetic testing for polygenic disease relative risk reduction: evaluation
of genomic index performance in 11,883 adult sibling pairs. Genes. 2020; 11, 648.
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