relatorio 4 Cinética Enzimática UFABC

Prévia do material em texto

FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC 
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS 
BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO 4: DESNATURAÇÃO PROTEICA 
E ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
Vítor Hugo Jacintho Barbosa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.INTRODUÇÃO 
As proteínas são moléculas complexas e essenciais 
para a vida, desempenhando diversas funções no 
organismo, como catalisar reações químicas, 
transportar moléculas e fornecer suporte estrutural. 
No entanto, as proteínas são estruturas altamente 
sensíveis que podem ser facilmente afetadas por 
condições adversas do ambiente, como 
temperatura, pH, força iônica e agentes químicos. 
A desnaturação proteica é um processo pelo qual a 
estrutura tridimensional de uma proteína é alterada 
ou destruída, resultando na perda da sua atividade 
biológica. Isso ocorre quando as interações não-
covalentes que mantêm a proteína em sua forma 
nativa, como pontes de hidrogênio, forças de Van 
der Waals e interações hidrofóbicas, são 
perturbadas. Como resultado, a proteína perde sua 
capacidade de realizar sua função biológica 
normal. 
A atividade enzimática é um exemplo de uma 
função biológica que pode ser afetada pela 
desnaturação proteica. As enzimas são proteínas 
que catalisam reações químicas em uma velocidade 
muito mais rápida do que seria possível 
espontaneamente. No entanto, a atividade 
enzimática depende da estrutura tridimensional da 
enzima, e qualquer alteração na sua estrutura pode 
diminuir ou inibir completamente a atividade 
enzimática. 
 
Estrutura tridimensional de uma enzima: a atividade 
enzimática depende da estrutura tridimensional da enzima, e 
qualquer alteração na sua estrutura pode diminuir ou inibir 
completamente a atividade enzimática. (Google imagens) 
Por isso, a compreensão dos fatores que afetam a 
desnaturação proteica e a atividade enzimática é 
essencial para a bioquímica e a biologia molecular, 
bem como para a aplicação prática em diversas 
áreas, como biotecnologia, medicina e indústria 
alimentícia. 
1.1 Propriedades enzimáticas do abacaxi 
O abacaxi contém uma enzima digestiva chamada 
bromelina, que é capaz de quebrar proteínas, é 
composta por moléculas proteolíticas que são 
capazes de hidrolisar as ligações peptídicas 
presentes nas proteínas, quebrando-as em 
fragmentos menores. 
Quando consumimos alimentos que contêm 
proteínas, como carnes, ovos ou laticínios, as 
enzimas digestivas presentes no nosso sistema 
digestivo quebram essas proteínas em aminoácidos 
que são absorvidos pelo nosso organismo e 
utilizados na síntese de proteínas do nosso corpo. 
A bromelina é um tipo de protease encontrada no 
abacaxi que pode ajudar a acelerar esse processo de 
quebra de proteínas, já que possui função 
proteolítica muito eficiente. Isso pode ser benéfico 
para pessoas que têm dificuldade de digestão, como 
é o caso de algumas pessoas com problemas 
digestivos. 
 
Estrutura da Bromelina: A bromelina é um tipo de protease 
encontrada no abacaxi que pode ajudar a acelerar esse 
processo de quebra de proteínas. (Fonte: Vânia Letica Abreu) 
1.2 Proteases 
Proteases representam uma classe de enzimas com 
importantes papéis em processos fisiológicos. 
Além disto, elas possuem aplicação comercial, 
estando entre os três maiores grupos de enzimas 
industriais, sendo responsáveis por 60% da venda 
internacional de enzimas. 
 
 
 
 
 Estas enzimas estão envolvidas em processos 
biológicos essenciais, como a coagulação 
sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. 
Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem no 
mecanismo invasivo de tumores, assim como no 
ciclo de infecção de um grande número de vírus e 
microrganismos patogênicos. 
Estes fatos tornam as proteases um alvo 
quimioterápico valioso para o desenvolvimento de 
novos compostos farmacêuticos. As enzimas 
proteolíticas também participam no catabolismo de 
proteínas, tanto nas vias degradativas como nas 
biossintéticas, e na liberação de hormônios 
peptídeos farmaceuticamente ativos a partir de 
proteínas precursoras. 
Certas modificações específicas e seletivas de 
proteínas durante a ativação de enzimas ocorrem 
via proteólise, que também colabora no transporte 
de proteínas secretórias na membrana. 
As proteases têm também uma variedade de 
aplicações principalmente na indústria de 
detergentes e de alimentos. Tendo em vista os 
recentes acordos mundiais para uso de tecnologias 
não poluentes, as proteases começaram a ser usadas 
em larga escala no tratamento do couro, em 
substituição aos compostos tóxicos e poluentes até 
então usados. 
Na indústria farmacêutica, as proteases são usadas 
em pomadas cicatrizantes e têm um uso potencial 
para outros medicamentos. 
 Proteases hidrolisam as proteínas em peptídeos e 
aminoácidos, facilitando a sua absorção pelas 
células; devido a seu papel despolimerizante, as 
enzimas extracelulares têm um papel importante na 
nutrição. (APOSTILA DE BIOQUÌMICA). 
1.3 Gelatina 
Gelatina é uma mistura heterogênea de proteínas 
desnaturadas solúveis em água, derivada da 
hidrólise parcial do colágeno tipo I nativo e que 
possuem alta média de massa molecular. 
Tradicionalmente são usadas na indústria alimentar 
e de cosméticos. Entretanto, recentemente vem 
sendo muito usada em pesquisas na área biomédica 
(devido sua alta biocompatibilidade, 
biodegradabilidade e baixa imunogenicidade, além 
de baixo custo) como estrutura para adesão celular, 
biomaterial para engenharia de tecidos e sistema de 
entrega de fármacos diferente das cápsulas 
tradicionais (YOUNG et al, 2005). 
Na conversão do colágeno à gelatina, que ocorre 
acima da temperatura de desnaturação do colágeno, 
tropocolágenos perdem a estrutura de hélice tripla 
característica, há quebras de ligações 
intermoleculares e de ligações peptídicas 
resultando em cadeias polipeptídicas que pela 
análise SDSPAGE apresentam peso molecular de 
menos de 300 kDa com distribuição muito ampla. 
Assim, os constituintes moleculares da gelatina são 
heterogêneos em relação ao colágeno, apresentam 
cadeias com menor peso molecular relativo e 
variada distribuição de estrutura primária. Como 
alguns dos 39 aminoácidos na estrutura peptídica 
do colágeno contêm grupos funcionais que são 
hidrolisados sob condições ácidas ou básicas, há 
dois tipos de gelatina, dependentes do processo de 
extração: tipo A e tipo B, obtidas de pré-tratamento 
ácido e básico respectivamente (YOUNG et al, 
2005). (APOSTILA DE BIOQUÍMICA) 
 
2.OBJETIVOS 
Este experimento didático tem como proposta fazer 
com que os estudantes entendam como a estrutura 
tridimensional proteica pode ser alterada física e 
quimicamente, bem como observem a ação de uma 
enzima proteolítica. 
a) Estudar os efeitos da desnaturação proteica 
causada por temperatura; 
b) Avaliar os efeitos de álcool e sais sobre a 
solubilidade de uma solução de gelatina; 
c) Demonstrar a atividade proteolítica presente no 
suco de abacaxi. 
 
 
 
 
 
 
 
3.ANÁLISE DE DADOS 
3.1. Preparar uma tabela indicando os resultados observados de cada experimento. 
3.2. Tirar uma fotografia dos resultados para anexar ao caderno de laboratório como figura. 
 
 
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 
Água 
 
2 ml - 
Sulfato 
de 
amônio 
- 2 ml - 
Etanol 
Absoluto 
- - 2 ml 
Gelatina 
 
2 ml 2 ml 2ml 
Resultado 
 
Não 
apresentou 
corpo de 
fundo, 
permaneceu 
incolor. 
Apresentouuma formação 
de corpo de 
fundo 
intermediária 
quando 
comparado ao 
tubo 1 e 3. 
Solução 
esbranquiçada. 
Apresentou 
bastante corpo 
de fundo, 
solução 
bastante 
esbranquiçada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 
Água 
 
2 ml - - 
Amostra 
abacaxi 
- 2 ml - - 
Amostra 
abacaxi 
60°C 
- - 2 ml - 
Amostra 
abacaxi 
fervida 
- - - 2ml 
Gelatina 
 
2 ml 2 ml 2 ml 2ml 
Resultados Permaneceu 
praticamente 
incolor, sem 
muitas 
alterações. 
Apresentou 
um pouco 
de corpo de 
fundo e 
uma 
solução 
levemente 
turva. 
Apresentou corpo 
de fundo e uma 
solução 
consideravelmente 
turva. 
Apresentou 
mais corpo 
de fundo 
que os 
demais 
tubos e 
uma 
solução 
turva. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.3. Discutir o efeito do suco de abacaxi sobre o 
colágeno (gelatina). 
Levando em conta a presença de proteases no suco 
de abacaxi, é correto afirmar houve uma bem-
sucedida quebra das ligações peptídicas das 
proteínas do colágeno. Assim, essas enzimas 
catalisaram a hidrólise das ligações que compõe a 
gelatina, quebrando sua estrutura em peptídeos 
menores e aminoácidos livres, o que gerou no tubo 
1 e no tubo 4 um corpo de fundo gelatinoso. 
3.4. Discutir o efeito da temperatura sobre as 
enzimas (proteases) presentes no suco do 
abacaxi. 
As amostras que não foram fervidas não 
apresentaram tanto conteúdo “gelatinoso” quanto a 
amostra fervida. Isso pode ser associado à 
desnaturação das proteases submetidas a altas 
temperaturas, uma vez que esse fato implica na 
ausência de catalisação das proteínas do colágeno 
em moléculas menores, os aminoácidos. O que 
favoreceu o desenvolvimento de uma estrutura em 
forma de gel. 
3.5. Discutir o efeito do etanol e do sulfato de 
amônio sobre as proteínas em solução. Qual o 
princípio de cada efeito? 
No tubo contendo sulfato de amônio houve a 
precipitação de conteúdo em forma sólida, 
formando duas fases distintas na amostra, uma 
sólida e outra líquida. Situação que pode ser 
explicada pela presença desse sal no meio, assim há 
a tendência de, não só a proteína interagir com o 
composto iônico, como também a água (fase 
líquida). Assim, como a fase líquida é reduzida, há 
uma menor razão 
𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 = á𝑔𝑢𝑎
 e, portanto, 
precipitação de material. 
Já no tubo contendo etanol houve a formação de um 
sólido em consistência de gel, semelhante ao 
observado na amostra de suco de abacaxi fervido. 
O que é coerente, uma vez que o etanol, em altas 
concentrações é também capaz de desnaturar 
proteínas. 
 6. Pesquisar qual(is) protease(s) está(ão) 
presente(s) no suco de abacaxi. 
A principal protease presente no abacaxi é a 
bromelina, segundo Varilla, C et Al., é uma enzima 
presente nos tecidos de plantas da família 
Bromeliaceae, onde o principal representante é o 
abacaxi. É do tipo hidrolase capaz de romper as 
ligações peptídicas das proteínas. 
 6.1 Como poderia ser realizada a purificação 
dessa(s) proteína(s)? 
Segundo Ferreira et al., é possível utilizar o método 
líquido-líquido para purificação dessas enzimas: 
“Este processo de separação é baseado na 
distribuição do soluto entre as fases e a 
miscibilidade parcial dos líquidos. (Rabelo, 1999)” 
Nesse método, a eficiência do processo é regida 
tanto pelas concentrações das fases poliméricas e 
salinas, quanto pelo pH do meio. 
 6.2 A atividade das proteases pode ser 
otimizada? Como? 
É possível otimizar a atividade enzimática das 
proteases a partir do alcance de ‘condições ótimas 
do meio’, que envolvem faixas tanto de pH entre 7 
e 8, quanto temperatura próxima a 50°C 
(SILVEIRA, 2015) . 
 
Gráfico de Atividade enzimática x pH e de Atividade 
enzimática x Temperatura: Os pontos mais altos representam 
o ápice de atividade enzimática nos dois gráficos ao atingir 
um pH correto e uma temperatura correta. 
 
 
 
 
7. Discuta o efeito da temperatura sobre a 
desnaturação de proteínas no processo de 
cozimento dos alimentos. Qual a importância 
disso? 
Levando em conta que durante o cozimento de 
alimentos ocorre a desnaturação proteica, é 
possível inferir que tal processo possui maior efeito 
em termos sensoriais do que nutricionais, uma vez 
que a deformação na estrutura terciária das 
proteínas é capaz de alterar cor, consistência e 
textura do conteúdo alimentício, contudo, não 
necessariamente está relacionada à perda de 
nutrientes presentes na proteína. Ademais, o ácido 
estomacal, por possuir um pH baixo demais, já 
seria responsável pela desnaturação dessas 
moléculas. 
A importância desse processo cabe, portanto, na 
alteração de condições sensoriais dos alimentos, 
sendo crucial para a indústria desse segmento. 
8. Por que se pode utilizar abacaxi para amaciar 
carnes? Qual a relação entre o suco do abacaxi 
e os amaciantes de carnes comerciais. 
O abacaxi possui propriedade amaciante em 
virtude da presença da Bromelina, responsável por 
quebrar fibras que dão à carne aspecto ‘duro’, 
tornando-a mais suave. A relação está na presença 
dessa mesma enzima nos amaciantes comerciais 
(LEMOS, UFRPE). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4.REFERÊNCIAS 
- LEMOS, L. G. P. (ED.). Avaliação Sensorial de 
Carnes Amaciadas por Ácidos e Enzimas. 
- SILVEIRA, L. L. (ED.). Purificação e 
Caracterização de Protease com Atividade 
Colagenolítica produzida por Actinomadura sp. 
Disponível em: 
<https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/170
38#:~:text=A%20enzima%20apresentou%20term
oestabilidade%20at%C3%A9,atividade%20em%2
050%C2%B0C.>. 
- FERREIRA, J. (ED.). PURIFICAÇÃO DA 
ENZIMA BROMELINA PRESENTE NO 
CURAUÁ (Ananas erectifolius L.B. SMITH) 
VARIEDADE ROXA, POR SISTEMA BIFÁSICO 
AQUOSO PEG 4000/FOSFATO DE POTÁSSIO. 
Disponível em: 
<https://repositorio.unesp.br/bitstream/handle/114
49/140397/ISSN1517-8595-2011-13-02-197-
202.pdf;jsessionid=A9C237809557772673858A8
618E90CBD?sequence=1>. 
- Varilla, C.; Marcone, M.; Paiva, L.; Baptista, J. 
Bromelain, a Group of Pineapple Proteolytic 
Complex Enzymes (Ananas comosus) and Their 
Possible Therapeutic and Clinical Effects. A 
Summary. Foods 2021, 10, 2249. 
https://doi.org/10.3390/foods10102249 
-ABÍLIO, G. M. F. et al. Extração, atividade da 
bromelina e análise de alguns parâmetros químicos 
em cultivares de abacaxi. Revista Brasileira de 
Fruticultura, v. 31, n. 4, p. 1117–1121, dez. 2009. 
-How does alcohol denature a protein? | AAT Bioquest 
 
 
 
 
 
 
https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/How-does-alcohol-denature-a-protein