Clonagem Molecular e Produção de Hormônio do Crescimento

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Clonagem molecular: visão geral
O gene de interesse é inserido em um plasmídeo, dentro de um tubo de ensaio, e depois é
introduzido em uma bactéria hospedeira, que vai replicar essa molécula de DNA
recombinante produzindo várias cópias
Componentes da clonagem:
Enzimas de restrição: clivam as moléculas de DNA em sítios de restrição
● Existem vários tipos de enzimas de restrição, mas a mais conhecida é a EcoRI
https://rce.casadasciencias.org/rceapp/art/2014/033/
● A função dessas enzimas é proteger o material genético das bactérias contra DNA
estrangeiro, como moléculas de DNA virais
Vetores: são os organismos que vão receber o gene a ser amplificado
● A maioria são plasmídeos
● Os plasmídeos são moléculas de DNA extracromossomal que se reproduzem
independentemente do DNA cromossômico, geralmente carregam genes de
resistência a antibióticos
DNA ligase: une o gene de interesse no vetor
● catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre um fosfato 5’ e uma hidroxila 3’
Transformação das bactérias
o plasmídeo recombinante é inserido em uma bactéria, geralmente E.coli
Ocorre por um choque térmico que torna as bactérias competentes a receber o plasmídeo
Seleção das bactérias contendo o plasmídeo
Produção de proteína
Hormônio do crescimento humano (GH)
Produzido e secretado pela hipófise anterior
Responsável por estimular o crescimento e multiplicação celular
Também é chamado de somatotropina
A deficiência na produção de GH pode ocorrer por problemas genéticos ou tumores na
hipófise e pode causar o nanismo
Dessa forma, é necessário repor esse hormônio
Esse hormÔnio passou a ser produzido na década de 80 pela tecnologia do DNA
recombinante
Aplicando o conhecimento sobre clonagem para produção do hormônio do
crescimento pela tecnologia do DNA recombinante
*aplicar a clonagem para desenvolver esse hormonio (usar o tcc).........
1. Obtenção e preparo do gene hGH
o gene é isolado e amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Após isso, o
produto da PCR é purificado para que sobre apenas o material genético, sem os reagentes
da PCR.
Após isso, esse produto purificado é tratado com enzimas de restrição (NcoI e HindIII) para
gerar extremidades coesivas. O vetor pet28a foi tratado com as mesmas enzimas.
O gene Hgh foi inserido no vetor pet28a e as extremidades foram ligadas pela DNA ligase
Transformação das bactérias: tornar a E.coli competente para receber o plasmídeo
recombinante pela técnica de eletroporação (pulso elétrico de alta voltagem) que torna a
membrana permeável para o plasmideo entrar na bactéria
Seleção de clones recombinantes: as bactérias foram postas em meio contendo o
antibiotico canamicina (o vetor tem o gene de resistencia a esse antibiotico)
● dentro desse gene estao os sitios da enzima de restrição e o inserto será encaixado
nessa porção do vetor. Entao, ao ser tratado com canamicina, as colonias de
bactérias que tiverem o plasmideo recombinante nao irao crescer, pois o gene Kan
foi “cortado”
Dessa forma, as colonias que nao cresceram continham o plasmideo recombinante, e essas
colonias foram coletadas e submetidas a sequenciamento para confirmar a presença do
inserto
As que continham o inserto, tiveram seus dna extraidos e a E.coli foi usada para expressar
o hormonio hGH. Para isso o plasmídeo possui um promotor, um sítio de multipla clonagem,
uma origem de replicação, ou seja, os componentes necessários para que o gene de hGH
sejá transcrito e traduzido, formando como produto o hormonio
Referencias
http://www.aems.edu.br/conexao/edicaoanterior/sumario/2013/downloads/2013/1/21.pdf
http://www.uezo.rj.gov.br/tcc/tbt/Thiago-Santos-Chaves.pdf
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/ov
erview-dna-cloning
http://www.aems.edu.br/conexao/edicaoanterior/sumario/2013/downloads/2013/1/21.pdf
http://www.uezo.rj.gov.br/tcc/tbt/Thiago-Santos-Chaves.pdf
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/overview-dna-cloning
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/overview-dna-cloning
CHAVES, Thiago. Clonagem e expressão do hormônio do crescimento humano (hGH) em
Escherichia coli.